Вирусология экзамен. Вирусология Экз. 1. Предмет и задачи ветеринарной вирусологии. История развития вирусологии
 Скачать 0.56 Mb.
|
|
75. РТГА, ее сущность, компоненты, методы постановки, применение в вирусологии. Реакция торможения гемагглютинации (РТГА). Основана на том, что антитела при встрече с гомологичным вирусом (антигеном) нейтрализуют не только его инфекционную, но и гемагглютинирующую активность, так как блокируют рецепторы вирионов, ответственные за гемагглютинацию, образуя с ними комплекс антиген + антитело. Принцип РТГА состоит в том, что в пробирке (лунке) смешивают равные объемы сыворотки крови и вируса и после экспозиции (30—40 мин) добавляют эритроциты соответствующего вида животного. Выбор эритроцитов зависит от вируса, используемого в РТГА. Так, для вирусов гриппа используют эритроциты кур, для ПГ-3 КРС — эритроциты морской свинки. Обычно используют 0,5—1%-ную взвесь эритроцитов. Эритроциты являются индикатором наличия вируса в смеси. Агглютинация эритроцитов указывает на наличие вируса в смеси, а отсутствие гемагглютинации — на его отсутствие, так как антитела полностью нейтрализовали гемагглютинирующую активность вируса. РТГА можно ставить в двух вариантах: к разным разведениям сыворотки (обычно 2-кратным) добавляют одинаковые дозы вируса (4—8 ГАЕ); к разным разведениям вируса (обычно 2-кратным) добавляют одинаковые дозы сыворотки. Сыворотки, используемые в РТГА, должны быть предварительно освобождены от термолабильных и термостабильных ингибиторов.Постановку РТГА по первому варианту проводят по следующим этапам: титруют вирус в РГА и определяют его гемагглютинирующий титр; приготовляют и контролируют рабочую дозу вируса (4 или 8 ГАЕ);ставят главный опыт РТГА; учитывают результаты. Оценивают гемагглютинацию в каждой смеси в крестах и определяют титр антител. За титр антител в сыворотке принимается наивысшее разведение сыворотки, которое еще полностью тормозит гемагглютинацию. РТГА ставят в пробирках, специальных полистироловых планшетах макро- или микрометодом. РТГА позволяет решить следующие диагностические задачи: обнаружить и определить титр антител в сыворотке крови с помощью известного вируса; идентифицировать неизвестный вирус путем исследования его с различными заведомо известными сыворотками (антителами). Достоинства РТГА — простота техники постановки и быстрый результат. Однако эту реакцию можно использовать только для гемагглютинирующих вирусов. 76. РИФ, ее сущность, компоненты, методы постановки, применение в вирусологии. Иммунофлюоресцентный метод (РИФ, реакция иммунофлюоресценции, реакция Кунса) - метод выявления специфических АГ с помощью АТ, конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения АТ и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток. Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфекционных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике. Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на способности некоторых флюорохромов (например, изотиоцианата флюоресцеина) вступать в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их иммунологической специфичности.Различают три разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета. Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген - антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки. Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе. Механизм. На предметном стекле готовят мазок из исследуемого материала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя. Для образования комплекса антиген — антитело препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия для удаления не связавшихся с антигеном антител. Затем на препарат наносят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против глобулинов кролика, выдерживают в течение 15 мин при 37 °С, а затем препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия. В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на антигене специфическими антителами образуются светящиеся комплексы антиген — антитело, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии. 77. РСК, ее сущность, компоненты, методы постановки, применение в вирусологии. Реакция связывания комплемента (РСК) заключается в том, что при соответствии друг другу антигены и антитела образуют иммунный комплекс, к которому через Fc-фрагмент антител присоединяется комплемент (С), т. е. происходит связывание комплемента комплексом антиген—антитело. Если же комплекс антиген—антитело не образуется, то комплемент остается свободным. Компоненты. Реакция связывания комплемента (РСК) относится к сложным серологическим реакциям. Для ее проведения необходимы 5 ингредиентов, а именно: АГ, AT и комплемент (первая система), эритроциты барана и гемолитическая сыворотка (вторая система). Антигеном для РСК могут быть культуры различных убитых микроорганизмов, их лизаты, компоненты бактерий, патологически измененных и нормальных органов, тканевых липидов, вирусы и вирусосодержащие материалы. В качестве комплемента используют свежую или сухую сыворотку морской свинки. Механизм. РСК проводят в две фазы: 1-я фаза — инкубация смеси, содержащей три компонента антиген + антитело + комплемент; 2-я фаза (индикаторная) — выявление в смеси свободного комплемента путем добавления к ней гемолитической системы, состоящей из эритроцитов барана, и гемолитической сыворотки, содержащей антитела к ним. В 1-й фазе реакции при образовании комплекса антиген—антитело происходит связывание им комплемента, и тогда во 2-й фазе гемолиз сенсибилизированных антителами эритроцитов не произойдет; реакция положительная. Если антиген и антитело не соответствуют друг другу (в исследуемом образце нет антигена или антитела), комплемент остается свободным и во 2-й фазе присоединится к комплексу эритроцит — антиэритроцитарное антитело, вызывая гемолиз; реакция отрицательная. Применение. РСК применяют для диагностики многих инфекционных болезней, в частности сифилиса (реакция Вассермана). 78. РН, ее сущность, компоненты, методы постановки, применение в вирусологии. Реакция нейтрализации вирусов еакция нейтрализации основана на способности специфических вируснейтрализующих антител блокировать инфекционные, гемагглютинирующие, гемадсорбирующие, цитопатические, бляшкообразующие и др. свойства вирусов. Она применяется в двух направлениях:1) для идентификации вирусов;2) для серодиагностики вирусных инфекций, т.е. для определения нарастания титра вируснейтрализующих антител в «парных» сыворотках. Компоненты:1. Исследуемый вирус (при идентификации выделенною вируса) или исследуемая сыворотка (при серодиагностике инфекции).2. Диагностическая (группе-, видо-, типоспецифическая) сыворотка (при идентификации вируса) или известный вирус — диагностикум (при серодиагностике).3. Индикаторный объект: животные, куриные эмбрионы, культуры тканей или эритроциты. Реакции нейтрализации ставят в культурах клеток, куриных эмбрионах и на лабораторных животных. Принцип. Смесью вирус (исследуемый или известный) + сыворотка (диагностическая или исследуемая), выдержанной в течение определенного времени, заражают культуру клеток, куриный эмбрион или лабораторное животное. При (+} реакции, т.е. при нейтрализации вируса антителами индикаторные объекты продолжают нормально существовать, а в контроле — гибель или характерные изменения. 79. Индикация вирусов в патологическом материале путем обнаружения вирионов и телец-включений. 1.Вирусоскопия– световая микроскопия крупных вирионов вирусов (Poxviridae), включений и изменений клетки. Так же используется электронная микроскопия, но этот способ дорогостоящий, сложный и не позволяет точно идентифицировать вирус. 2.Обнаружение телец-включений – это скопления вирионов, избыток белков вирионов, либо клеточный материал измененный под действием вируса. Способность к окраске теми или иными красителями, размеры, форма, структура, местоположение в клетке телец-включений, образованных разными вирусами, неодинаковые, но специфичные для каждого вируса. Поэтому обнаружение в материале от больных животных внутриклеточных телец-включений с определенными характеристиками позволяет судить о том, каким вирусом они образованы, а значит, и о присутствии этого вируса в исследуемом материале. Для обнаружения телец-включений готовят мазки или отпечатки (посмертно или прижизненно), которые подвергают специальным методам окраски с последующей микроскопией. Окраска по Морозову – диагностика оспы (на светло-коричневом фоне, вирионы имеют вид темно-коричневых или черных точек, при массовом обнаружении р-т является положительным). По Муромцеву (нахождение телец Бабеша-Негри, они имеют вид фиолетовых образований различного размера на голубом фоне, ядро окрашивается в синий цвет). Так же используются: По макиавело, Романовскому-Гимзе, По Манну. Вирус бешенства в цитоплазме нервных клеток обнаруживаются тельца Бабеша-Негри. Оспа в эпителиальных клетках – тельца Гварниери. 3.Обнаружение вирусных антигенов: серологические реакции (РДП, РН, РСК, РИФ и т.д.) 4.Обнаружение вирусных НК (ДНК-зонды, ПЦР и метод блоттинга). 5.Обнаружение активной формы вируса путем биопробы (лабораторные животные, куриные эмбрионы, культура клеток). 6.Обнаружение гемаглютининов у гемаглютинирующих вирусов (РА, РТГА, но в настоящее время практически не используется по причине наличия более точных методов). 80. ПЦР, сущность, техника постановки, достоинства и недостатки. Полимеразная цепная реакция. ПЦР – принцип метода заключается в выявлении специфического для данного вируса гена по данным банка генов, а после его идентификация в исследуемом материале с помощью ПЦР. В ходе ПЦР происходит амплификация ДНК-вируса – создание дополнительных копий гена. Этот участок называется амплификат, его границы определяются двумя праймерами комплементарными начальным участкам противонаправленных нитей двойной спирали ДНК. Суть молекула ДНК подвергается нагреванию до 94С, что приводит к денатурации – разрушению водородных связей между нитями спирали ДНК, отжиг до 52С в присутствии праймера (короткий фрагмент нуклеиновой кислоты, олигонуклеотид), трифосфатов и фермента ДНК-полимеразы повышение до 72С, что приводит к синтезу новой молекулы ДНК, соответствующей начальной. Процедуру проводят повторно до образования необходимого количества амплификата, необходимого для индикации. Постановка реакции: получение ДНК-образца (исследуемый образец) – материал суспендируют в буфере, добавляют NaOH и выдерживают при 37С 7 минут. Смесь нейтрализуют и центрифугируют, надосадочную жидкость содержащую ДНК или РНК используют при постановке реакции, проведение ПЦР – амплификация выделенного фрагмента ДНК. За 3 часа из одной молекулы образуется до 1 млн копий. Индикация. Полученный амплификат подвергают электрофорезу в агарозном геле для разделения молекул ДНК, после чего на электрофореограмме резко выделяется амплифицированная молекула в виде полос (это фрагменты ДНК, синтезированные в процессе амплификации со специфическим для каждого возбудителя праймером). Данный метод позволяет с высокой точностью диагностировать инф. болезни. Разработаны наборы для диагностики диареи, ринотрахеита, африканской чумы, ящура и т.д. 81. ДНК-зонд, сущность, техника постановки, достоинства и недостатки Методы ДНК (или РНК)-зондов основаны на реакции гибридизации нуклеиновых кислот — способности односпиральных комплементарных цепей ДНК или РНК формировать двуспиральные структуры. Реакция может протекать между комплементарными молекулами вида: ДНК + ДНК, ДНК + РНК, РНК + РНК. Геном вирусов, представленный в виде специфической последовательности нуклеотидов в молекулах нуклеиновых кислот, наиболее информативен и является надежным критерием для идентификации. У большинства ДНК-содержащих вирусов (адено-, герпес-, покс-, папилломавирусы и др.) нуклеиновая кислота находится в виде двух цепей, которые связаны (водородная связь) комплементарно через азотистые основания (аденин—тимин, гуанин—цитозин). Так, у аденовирусов таких нуклеотидных пар 35—36,5 тыс., у герпесвирусов — 125—240 тыс., у поксвируеов — 130—375тыс. и т. д. Если водный раствор ДНК нагреть до 100 °С или сильно защелочить (pH >13), то комплементарные пары оснований теряют связь, и ДНК быстро диссоциирует на две отдельные цепи. Этот процесс называется денатурацией или плавлением. Если комплементарные цепи ДНК выдерживать в течение определенного времени при температуре 65 °С, они легко спариваются, восстанавливая структуру двойной спирали. Этот процесс получил название ренатурация или гибридизация. Все типы реакций гибридизации зависят от солевого состава среды, температуры инкубации, длины реагирующих цепей, их нуклеотидного состава. Любой вирус включает одну специфическую для него молекулу ДНК (или РНК) со строго определенной последовательностью нуклеотидов. Чтобы в исследуемом материале обнаружить вирусную нуклеиновую кислоту, можно воспользоваться ее способностью после разделения цепей (если она двуспиральная) образовывать снова двойную цепь с комплементарной ей молекулой нуклеиновой кислоты, предварительно как-либо помеченной. Такая меченая односпиральная молекула нуклеиновой кислоты, комплементарная молекуле нуклеиновой кислоты определенного вируса, называется ДНК-зондом. Для каждого вида вируса зонд готовят заранее и вводят в него метку в виде атома радиоактивного фосфора (32Р) или в виде биотина, или другим веществом. Методы ДНК-зондов сводятся к следующему: получение односпирального фрагмента ДНК определенного вируса и его метки — это ДНК-зонд; выделение из исследуемого материала нуклеиновых кислот и их денатурация; контакт образовавшихся односпиральных молекул ДНК (или РНК) с ДНК-зондом при 55—65 °С, приводящих к образованию двуспиральных молекул (гибридизация) в случаях их взаимной комплементарности; удаление всех негибридизированных односпиральных молекул нуклеиновых кислот (отмывают или добавляют нуклеазы); обнаружение (по метке) образовавшихся двуспиральных молекул нуклеиновых кислот, которые и будут указывать на наличие в исследуемом материале того вируса, на который был получен ДНК-зонд. Если использовали радиоактивный зонд, то результаты учитывают методом авторадиографии или путем подсчета импульсов в счетчике. Существует большое количество модификаций метода гибридизации с мечеными нуклеиновыми кислотами. Их можно разделить на две основные группы: способы гибридизации в растворе и способы гибридизации на твердых носителях. Наиболее популярен метод гибридизации с использованием носителей — нитроцеллюлозных или нейлоновых фильтров и твердых полимеров. Он заключается в том, что одну нуклеиновую кислоту (чаще исследуемую), предварительно денатурированную, иммобилизуют на носителе (фильтре), проводят гибридизацию с ДНК-зондом и непрореагировавшие молекулы зонда отмывают, а иммобилизованные меченые гибриды остаются на фильтре. Сигнал, подаваемый связанным зондом, обнаруживают посредством авторадиографии, если зонд был радиоактивным, или путем образования цветных пятен, если использовали меченный ферментом зонд. Достоинства метода: высокая чувствительность и специфичность; быстрота анализа; универсальность; отсутствие необходимости в стерильной работе, математической обработке результатов. Недостатки: относительная технологическая сложность и трудность получения зонда; если метка радиоактивная, то нельзя зонд нарабатывать впрок, так как период полураспада 32Р — 14 сут, а 1311 — 8 сут; если метка нерадиоактивная, то чувствительность метода снижается в 10 раз и более. Методы ДНК (РНК)-зондов из диагностической практики постепенно вытесняются новым методом — полимеразной цепной реакцией. 82. Биотехнология получения специфических глобулинов, крови и сыворотки реконвалесцентов, их применение. Сыворотка реконвалесцентов. Эта сыворотка крови переболевших животных, содержащая специфические антитела, применяется с лечебной и профилактической целями. Кровь берут от животных не ранее 12 и не позднее 20 дней с момента обнаружения у них клинических признаков ящура и при отсутствии осложнений на вымени, копытах, сердце.Кровь берут от животных не ниже средней упитанности и при удовлетворительном состоянии здоровья. Кровь берут из яремной вены в количестве 3–5 л от каждого животного (с учетом индивидуальных особенностей организма животного). Место введения иглы выстригают или выбривают, моют с мылом и дезинфицируют настойкой йода. Кровь берут в стерильные цилиндры или бутыли с соблюдением всех правил асептики в помещении, хорошо вымытом, побеленном и тщательно дезинфицированном. Монтаж и стерилизацию посуды проводят заранее. Перед стерилизацией в цилиндр или в бутыль наливают 50 см3 физиологического раствора на 1 л крови, после этого отверстие цилиндров или бутылей закрывают двойным слоем бумаги, каждый из них перевязывают шпагатом. Перед введением иглы в яремную вену верхний слой бумаги приподнимают, а нижний прокалывают стеклянным наконечником резинового шланга. В момент взятия крови верхним слоем бумаги прикрывают нижний слои бумаги со стеклянным наконечником, предотвращая возможность попадания воздушной микрофлоры. По окончании крововзятия и изъятия наконечника из цилиндра верхний слой бумаги плотно накладывают на нижний и перевязывают шпагатом. Кровопускательную иглу монтируют следующим образом: на нее надевают резиновый шланг длиной около 1 м, оканчивающийся стеклянным наконечником. Лучше для кровопускания брать иглу с отверстием не менее 0,3 см в диаметре. Резиновый шланг с иглой и стеклянной трубкой обертывают бумагой, перевязывают в нескольких местах шпагатом и подвергают в таком виде стерилизации. Перед наполнением цилиндра или бутыли кровью стенки должны быть увлажнены находящимся в них физраствором. Во избежание образования пены кровь спускают по стенкам сосуда. Взятую кровь ставят для лучшего свертывания в теплое помещение при температуре 25° на 5–6 часов. Через 6 часов сгусток крови обводится фламбированной стеклянной палочкой или металлическим зондом. Затем цилиндры с кровью помещают на двое суток в прохладное место. После отстоя сыворотку от нескольких животных сливают в общую, заранее стерилизованную и вымеренную бутыль. Сыворотку (серии) сливают через стерильный сифон или стерильную воронку с соблюдением правил получения стерильной сыворотки. Комнату, в которой сливают сыворотку, чисто убирают и увлажняют дезраствором.После слива консервируют сыворотку следующим образом:1) заранее готовят стерильный 5%-ный раствор кристаллической карболовой кислоты на физрастворе;2) на каждые 900 см3 сыворотки добавляют 100 см3 3%-ного раствора карболовой кислоты (из расчета ее содержания в сыворотке в количестве 0,5%'e Консервирующую жидкость вливают постепенно в бутыль, осторожно встряхивая ее, по окончании карболизации производят более тщательное перемешивание (со взбалтыванием) сыворотки с консервирующей жидкостью.Консервированную сыворотку расфасовывают в стерильные флаконы емкостью 100–250 см3 через сифон с соблюдением правил стерильности. На флаконы с сывороткой наклеивают этикетки с обозначением на них наименования биопрепарата, времени изготовления, номера серии, кем изготовлена сыворотка, количества ее и дозировки для применения.Флаконы стерилизуют с временными ватными пробками, а постоянные пробки, завернутые отдельно в бумагу, привязывают к горлышку соответствующего флакона и в таком виде стерилизуют.Перед укупоркой, в момент расфасовки сыворотки, пробку и горлышко флакона фламбируют над пламенем. Укупоренные флаконы заливают мастикой или сургучом. Сыворотка пригодна для практического применения при условии ее безвредности. Последняя проверяется путем введения сыворотки двум морским свинкам (подкожно) в дозе 5 см3 и двум белым мышам в дозе 0,5 см3. Срок наблюдения за подопытными животными не менее 5 суток. Сыворотку считают безвредной, если в означенный срок все привитые животные останутся здоровыми, а на месте введения сыворотки не будет обнаружено никаких патологических изменений. При отсутствии мышей и свинок безвредность сыворотки проверяют на 2– 3 телятах путем введения под кожу 50 см3 сыворотки. Если в течение трех суток па месте инъекции не будет обнаружено никаких патологических изменений, сыворотка выпускается для массового применения. Способ применения сыворотки. Сыворотку реконвалесцентов применяют с профилактической целью в неблагополучных по ящуру хозяйствах телятам, ягнятам и поросятам, а также взрослому племенному скоту. Сыворотка реконвалесцентов создает у животных лишь пассивный иммунитет длительностью до 8–12 дней. Сыворотку вводят под кожу в области шеи в дозах: телятам 1–1,5 см3 . на 1 кг веса животного, поросятам и ягнятам 1,5–2,0 см3 на 1 кг веса животного. Одновременно с прививками в хозяйстве проводят тщательную механическую очистку и дезинфекцию помещений, загонов, предметов ухода. |