Вирусология экзамен. Вирусология Экз. 1. Предмет и задачи ветеринарной вирусологии. История развития вирусологии
 Скачать 0.56 Mb.
|
|
61. Вирусологическая лаборатория, устройство, правила работы. В.Л состоит из лаборатории и подсобных помещений. Для диагностической лаб-и используют изолированный отсек, состоящий не менее чем из 5-6 комнат. Светлое помещение. и состоять из предбоксника и бокса, разделенных стеклянной перегородкой с дверьми. В боксах размещают только столы, стулья и принадлежности для работы. Поверхность столов покрывают нержавеющей сталью, пластиком или стеклом, а над рабочей поверхностью устанавливают бактерицидные лампы. У входа в бокс кладут резиновый губчатый дезковрик, пропитанный дезраствором. В предбокснике лежат стерильная одежда и оборудование, соответствующее назначению бокса. Лаб-ю обеспечивают холодной и горячей водой и вентиляцией с подачей стерильного воздуха. Для регистрации поступающего патматериала предназначена приемная,где размещают несколько столов, обитых оцинкованной жестью, и емкости с дезрастворами (3% хлорамина, натрия гидроксида или 5% фенола). В комнате для предварительной обработки материала (вскрывочной) вскрывают трупы и отбирают материал для дальнейшего исследования. Комнаты-боксы оборудуют в зависимости от назначения.В автоклавной стерилизуют посуду, питательные среды, аппаратуру, питательные среды и обезвреживают инфекционный материал. Необходимо иметь два автоклава: для чистых материалов и для инфицированных. Моечная предназначена для мытья посуды, аппаратуры и приборов. Виварий должен иметь карантинное отделение, комнаты для здоровых и экспериментальных животных и подсобные помещения. Для вирусологической лаборатории любого типа обязательной частью лаборатории является настольный бокс или лучше бокс с ламинарной подачей воздуха. правила работы. Этапы лабораторной диагностики вирусных болезней. ) Индикация (обнаружение) вируса в патматериале: Экспресс-методы: a) Обнаружение вирионов: 1) Электронной микроскопией; (2) Световой микроскопией (оспа); b) Обнаружение вирусных АГ в серологических реакциях (РИФ, ИФА, РСК, РДП, РНГА); c) Обнаружение телец-включений методами световой и люминесцентной микроскопии; d) Обнаружение вирусных нуклеиновых кислот методами ПЦР, ДНК-зондов; e) Обнаружение гемагглютининов в РГА; f) Обнаружение инфекционной активности вируса в биопробе. 2) Изоляция (выделение) вируса из патматериала. 3) Идентификация (определение вида) выделенного вируса в серологических реакциях или методом ПЦР-анализа. 62. Правила взятия, консервирования и доставки вируссодержащего материала в лабораторию. 1. Вид исследуемого материала должен определяться клинической картиной заболевания и соответствовать локализации и характеру инфекционного процесса. В случае неясности клинической картины, а также при отсутствии очаговой симптоматики для исследования берут кровь, а в некоторых случаях мочу. 2. Всегда собирают достаточное количество материала для детального тщательного исследования. 3. Материал для бакисследования должен забираться по возможности в начальном периоде болезни (возбудитель выделяется достоверно чаще, и инфекционный процесс имеет типичную локализацию). При хирургической инфекции, следовательно, материал забирают до вскрытия абсцесса первичной обработки раны. 4. Забор материала должен проводиться по возможности до применения антибиотиков и антисептиков. Если такая терапия начата, то теоретически ее следует прервать на 1-2 дня Последнее возможно только в критических случаях, при отсутствии эффекта антибактериальных средств. 5. Для того чтобы избежать ошибок в определении этиологии заболевания, забор осуществлять в трого асептических условиях. В начале материал следует максимально освободить от нормальной микрофлоры (например, прополоскать полость рта стерильными раствором без антисептиков; при раневой инфекции очистить поверхность раны и др.). 6. Многие микроорганизмы чувствительны к попаданию в материал антимикробных препаратов, поэтому необходимо исключить контакт с металлами и ватой, особенно искусственной, содержащей свободные жирные кислоты.7. Материал, полученный от пациента, всегда должен расцениваться как потенциально опасный. Следовательно, при его заборе, хранении, доставке, обработке, во избежание заражения следует придерживаться мер техники безопасности для бактериологической и вирусологической лаборатории. 8. Материал необходимо доставить в возможно более короткий срок в лабораторию и начать исследование. При отсутствии возможности быстро доставить его в лабораторию, материал помещают в холодильник при t=4°C или добавляют консервант, но лучше использовать вариант со специальными транспортными средами. 10. Для сохранности материала в процессе доставки следует оберегать его от действия факторов окружающей среды, таких как: свет, тепло, холод, механические повреждения и др. Поэтому пробы лучше доставлять в специальных металлических контейнерах. 11. После окончания бак. и вирусол.исследований остатки материала считаются опасными и подлежат уничтожению (например, автоклавированием или сжиганием), предметы многоразового использования (посуда, контейнеры, инструменты)обеззараживаются. 63. Подготовка вируссодержащего материала для исследования. В лаб-ии полученный патматер. освобождают от консерванта, оттаивают, отмывают от глицерина, взвешивают или измеряют. Часть мат-ла берут для вирусологич. исследований, оставшуюся часть хранят в холодильнике на случай доп. исследований. Затем составл. план исследований присланного мат-ла. Подготовка органов и тканей. Вирус необходимо высвободить из клеток органов и тканей и перевести в фосфатный буфер или раствор Хенкса. Для этого материал тщательно измельчают ножницами и растирают в ступке со стерильным кварцевым песком. Из растертого материала обычно готовят 10%-ную суспензию на фосфатном буфере или растворе Хенкса. Полученную суспензию центрифугируют при 25-50час, надосадочную жидкость отсасывают в стерильные флаконы и освобождают от микрофлоры. Дозы антибиотиков, могут колебаться: от 100 до 1-2 тыс. ЕД. и более на 1 мл в зависимости от характера исследуемого материала. Следует избегать излишне больших доз антибиотиков, так как их избыток при дальнейшем внесении в культуру клеток может вызвать неспецифическую дегенерацию последних. Экспозиция суспензии с антибиотиками не менее 30-60 минут при комнатной температуре, затем материал подвергают бактериологическому контролю на наличие бактерий, грибов путем посева на среды. После получения отрицательного результата бактериологического контроля вируссодержащий материал используют для заражения лабораторных животных, куриных эмбрионов или культур клеток. В случае положительного бактериологического контроля суспензию вируса подвергают дополнительной обработке антибиотиками и повторно ставят контроль. Суспензию хранят при минус 20°С - минус 70 °С. Подготовка выделений из носа, глаз. Тампоны, погруженные в соответствующий раствор, встряхивают 10-15 мин, тщательно отжимают, полученную жидкость центрифугируют 20 мин при 2-3 тыс. мин. Надосадочную жидкость отсасывают в стерильную пробирку и в нее добавляют пенициллин и стрептомицин по 500-1000 ЕД. на 1 мл, выдерживают и после бактериологического контроля используют для заражения. Подготовка фекалий. Пробу кала (приблизительно 1 г) помещают в баночку с бусами, содержащую 10 мл раствора Хенкса или фосфатно-буферного раствора. После гемогенизации материала встряхиванием и последующего центрифугирования при 2-3 тыс. мин в течение 30 мин надосадочную жидкость отсасывают, добавляют пенициллин, стрептомицин по 500-1000 ЕД./мл, нистатин 30 ЕД./мл и 200 мкг тетрациклина на 1 мл. После 30-60-минутного контакта производят посев па стерильность, замораживают и хранят при минус 10°С - минус 20°С. В день заражения исследуемый материал оттаивают и повторно центрифугируют для удаления вновь образующегося после замораживания осадка. Исследование кала может быть заменено ректальными мазками, обработка которых требует меньше времени, а частота выделения вируса при этом не только не меньше, но иногда выше, чем при исследовании кала. Мочу обрабатывают антибиотиками (500-1000 ЕД/мл) и используют для заражения. Содержимое папул, пузырьков и пустул, чешуйки и корки исследуют при кожных высыпаниях. Содержимое папул и пузырьков разводят физиологическим раствором 1:5, а корки, чешуйки после растирания суспендируют в солевом растворе 1:5-1:10 и центрифугируют при 2-3 тыс. мин в течение 10-15 мин. После обработки пенициллином и стрептомицином (по 200-500 ЕД./мл) материал используют для заражения. 64. Цели использования лабораторных животных в вирусологии. Для: обнаружения вируса в патматериале; первичного выделения вируса из патматериала; накопления вирусной массы; поддержания вируса в лаборатории в активном состоянии; титрования вируса; получения гипериммунных сывороток; в качестве тест-объекта в реакции нейтрализации. В вирусологии используют кроликов, белых крыс, белых мышей, хомячков. Однако только некоторые вирусы удается культивировать на животных перечисленных видов. Во многих случаях для тех же целей используют других чувствительных к данному вирусу животных: кур, голубей, котят, щенков и т. д. Так, биопробу при диагностике оспы птиц ставят на курах, оспы овец – на овцах, чумы свиней – на подсвинках. По генетическим качествам лаб-х жив-ых делят на 4 гр: 1) животные смешанного происхождения, полученные от разных животноводов, такие жив-ые гетерогенны;2) жив-ые, полученные непосредственно из одного источника, однако генетически такие жив-е вариабельны; 3) инбредные линии жив-ых. Их получают в результате спаривания брата с сестрой или родителей с детьми по крайней мере не менее 20 поколений. При таком методе разведения достигается все возрастающая степень гомозиготности. 4) однородные гибриды F1. Высокая степень гетерозиготности, характерная для каждого гибрида, связана здесь с генетическим однообразием, которое соответствует степени гомозиготности родительских линий. Как правило, однородные гибриды F1 менее изменчивы, чем обе родительские линии. Животные-мутанты имеют отдельно выраженный наследственный фактор, который обусловливает видимое отклонение от нормальной формы. Требования к лаб-ным жив-ым : чувствительным к данному вирусу, возраст, здоровые. 65. Методика заражения культур клеток вирусом. Перед заражением путем микроскопии отбирают пробирки культур клеток, с хорошим сплошным монослоем. Работа с культурами клеток проводится в стерильном боксе. Заражение КК проводят 10% рабочей суспензией, приготовленной из исследуемого материала (патматериала) или вируссодержащим материалом, свободным от бактериальной и грибковой микрофлоры. 2 способа заражения. 1. С выросшего монослоя в пробирках сливают ростовую питательную среду, клеточный слой ополаскивают раствором Хенкса для удаления белка питательной среды и продуктов клеточного обмена. Затем в КК наливают 0,8мл вируса или рабочей суспензии. 4-6 пробирок с КК оставляют для контроля, где только заменяют питательную среду. Зараженные и контрольные пробирки с КК помещают в термостат при t +37С. 2. Сливают ростовую питательную среду. На клеточный слой наносят исследуемый материал или вирус. Плотно закрывают резиновыми пробками и выдерживают 1-2 часа на контакте. За это время вирус адсорбируется на поверхности клеток и частично проникает внутрь клеток. Затем монослой промывают раствором Хенкса, сливают жидкость вместе с продуктами клеточного обмена и не адсорбированным вирусом. В каждую пробирку наливают по 1мл поддерживающей питательной среды, плотно закрывают пробками, укладывают в горизонтальный штатив под углом 5-6градусов и ставят в термостат на инкубацию. Ежедневно проводят микроскопию КК на выявление ЦПД (цитопатическое действие вирусов). Микроскопию всегда начинают с контрольных КК. Наиболее широко применяют стационарное инкубирование в термостате при 37 °С. При этом матрасы кладут в горизонтальном положении, пробирки - под углом 5° так, чтобы монослой клеток оказался под питательной средой (чертой вверх). В ряде лабораторий зараженные культуры клеток инкубируют на вращающейся системе - роллерах. Используя этот метод, удается получать большой выход вируса, имеющего более высокий инфекционный титр, чем при стационарном культивировании. Наиболее широко и часто о размножении вируса в культуре клеток судят по цитопатическому (цитопатогенному) эффекту или цитопатическому (цитопатогенному) действию. 66. Методы заражения куриных эмбрионов. Заражение куриных эмбрионов происходит на 5-19 день развития. дня инкубации. Вирусы в них могут репродуцироваться в клетках самого зародыша, хорион-аллантоисной (ХАО) и амниотической оболочках, в стенках желточного мешка, накапливаться в этих структурах и в жидкостях аллантоисной и амниотической полостей. В разных структурах могут репродуцироваться различные вирусы. Разработано несколько методов заражения куриных эмбрионов, но в практике чаще используют следующие методы: на ХАО хорион-аллантоисной — например, вирусы оспы птиц и др.; в аллантоисную полость — вирусы гриппа, В редких случаях используют метод заражения куриных эмбрионов в тело зародыша и в кровеносные сосуды ХАО. Обнаружить вирус в куриных эмбрионах можно по следующим признакам: по гибели зародыша в определенные характерные для соответствующего вируса сроки инкубации; по патологоанатомическим изменениям в структурах куриного эмбриона, например, белые узелки (оспины) при оспе птиц, инфекционном ларинготрахеите кур и других инфекциях или желто-зеленый цвет аллантоисной жидкости при гепатите утят и т. д.; по реакции гемагглютинации (для обнаружения гемагглютинирующих вирусов, например, вируса болезни Ньюкасла, гриппа, ПГ-3 и др.). При наличии вируса в эмбриональной жидкости куриного эмбриона через 3—7 мин после смешивания капли вируссодержащей жидкости и капли взвеси эритроцитов соответствующего вида животного образуются хлопья эритроцитов (агглютинация). Так, для выявления вируса ПГ-3 крупного рогатого скота используют эритроциты морской свинки, вирусов гриппа — эритроциты кур и т. д 67. Методика приготовления культуры клеток фибробластов эмбрионов кур. Первичные клеточные культуры готовят из любой эмбриональной ткани, поскольку эмбриональные клетки обладают повышенной способностью к росту и размножению. Чаще культуры клеток готовят из смеси нескольких тканей, например кожной, костной и мышечной. Так получают фиброблас-ты эмбриона. Для получения клеточных культур используют эмбриональную ткань. 8— 12-дневные. Питательные среды, рекомендуемые для культивирования представителей акариот, прокариот и эукариот принципиально отличаются между собой в том смысле, что для "выращивания" акариот необходимы живые клетки или ткани Так, вирусы гриппа накапливают в куриных эмбрионах. Куриные эмбрионы по сравнению с культурами клеток значительно реже бывают контаминированы вирусами и микоплазмами, а также обладают сравнительно высокой жизнеспособностью и устойчивостью к различным воздействиям.Для получения чистых культур риккетсий, хламидий и ряда вирусов в диагностических целях, а также для приготовления разнообразных препаратов (вакцины, диагностикумы) используют 8—12-дневные куриные эмбрионы. О размножении упомянутых микроорганизмов судят по морфологическим изменениям, выявляемым после вскрытия эмбриона на его оболочках. О репродукции некоторых вирусов, например гриппа, оспы, можно судить по реакции гемагглютинации (РГА) с куриными или другими эритроцитами. К недостаткам данного метода относятся невозможность обнаружения исследуемого микроорганизма без предварительного вскрытия эмбриона, а также наличие в нем большого количества белков и других соединений, затрудняющих последующую очистку риккетсий или вирусов при изготовлении различных препаратов. 68. Определение ЦПД при диагностике вирусных болезней. Перед выявлением вируса в клетках его обычно отделяют от клеток хозяина путем их разрушения с помощью многократного замораживания и оттаивания или растирания со стерильным песком. Полученный вирусосодержащий материал центрифугируют или пропускают через бактериальный фильтр, обрабатывают антибиотиками для предотвращения бактериального загрязнения. Индикация вирусов в культуре клеток осуществляется, прежде всего, по цитопатическому действию (ЦПД) вирусов, сроки и характер которого зависят от свойств вируса, проявляясь дегенеративными изменениями клеток с последующей их гибелью и отслаиванием от стекла. Полная дегенерация клеток сопровождается значительными изменениями в виде пикноза ядра и цитоплазмы, отслаиванием клеточного монослоя от стекла. Частичная дегенерация культур кл. может протекать по следующим типам: гроздеобразования (округление, увеличение и слияние клеток с образованием гроздевидных скоплений, типично для аденовирусов),очаговой деструкции (очаги пораженных клеток на фоне в целом сохранившегося монослоя), характерной для вирусов гриппа; симпластообразования (слияние кл. с образованием гигантских многоядерных клеток в виде симпластов или синцитиев, характерных для вирусов кори, паротита, парагриппа, респираторно-синцитиального, герпеса, иммунодефицита человека).Пролиферативный тип ЦПД с трансформацией клеток в злокачественные, обладающие неограниченными потенциями к росту, способны вызывать онкогенные вирусы. Сроки, в течение которых наступает ЦПД, вариабельны (например, 1-2 дня у полиовирусов, 7-14 суток у аденовирусов). Индикация вирусов с помощью реакции гемадсорбции (РГа).Сущность этой реакции заключается в способности эритроцитов человека или животных адсорбироваться на поверхности клеток, инфицированных рядом вирусов в ранние сроки их репродукции (до развития ЦПД) в результате действия гемагглютининов – гликопротеидов, входящих в состав суперкапсида вируса. Для постановки РГА в культуру клеток добавляют 0,2 мл 0,5%-й взвеси эритроцитов, выдерживают 15-20 мин при температуре 40, 200 или 370 С в зависимости от свойств вируса, после чего взвесь эритроцитов удаляют и производят учет реакции под малым увеличением микроскопа по скоплению эритроцитов на отдельных клетках или на всем монослое. Индикация вирусов по внутриклеточным включениям. Репродукция некоторых вирусов (оспы, герпеса, бешенства) приводит к образованию внутриклеточных включений, локализующихся в цитоплазме или в ядре клеток и представляющих собой скопления вируса (или его антигенов). Включения выявляют путем световой микроскопии культур клеток, окрашенных по Романовскому- Гимзе или другими методами, а также с помощью прямого флюорохромирования (например акридиновым оранжевым) с последующей микроскопией препаратов в люминесцентном микроскопе. |