Вирусология экзамен. Вирусология Экз. 1. Предмет и задачи ветеринарной вирусологии. История развития вирусологии
 Скачать 0.56 Mb.
|
|
69. Единицы количества вируса (ЛД50, ЭЛД50, ИД50, ЭИД50, ТЦД50). Титрование вируса. Расчет титра вируса по Риду и Менчу. Титр вируса — это количество вируса, содержащееся в единице объема материала. Поскольку количество вируса невозможно выразить в обычно применяемых (объем, масса и т. п.) единицах, прибегают к измерению в единицах действия или единицах активности. Вирусы обладают инфекционным и гемагглютинирующим действием. Отсюда и единицы количества вирусов инфекционные и гемагглютинирующие. Размерность этих единиц зивисит от соотношения полноценных и неполноценных вирионов в используемой суспензии, объекта, способа титрования и других факторов. В практике нашли применение три типа единиц количества вируса: 1-й — инфекционные единицы локальных повреждений, вызываемых вирусами и оцениваемых по единичному эффекту; 2-й — инфекционные единицы 50%-ного действия вирусов на чувствительные живые объекты, оцениваемые статистически; 3-й — гемагглютинирующие единицы. Из локальных повреждений, вызываемых вирусами, наиболее известны бляшки в зараженных культурах клеток (островки мертвых клеток в слое живых) и оспины (некротические узелки) на ХАО куриных эмбрионов, зараженных оспенными и некоторыми другими вирусами. В случаях такого проявления инфекционной активности вирусов количество вируса может быть измерено в бляшкообразующих единицах (БОЕ) или оспообразующих единицах (ООЕ). Одна БОЕ равна дозе вируса, способной вызвать образование одной бляшки, а одна ООЕ — одной оспины. Наиболее универсален метод определения титра вируса в единицах 50%-ного инфекционного действия. По этому методу за единицу количества вируса принимается такая его доза, которая способна вызывать инфекционный эффект у 50 % зараженных тест-объектов. Она обозначается как ЭД50— эффективная 50%-ная доза. Число таких доз вируса в единице объема материала и будет выражать титр вируса в этом материале. В качестве тест-объектов в лабораториях обычно используют белых мышей, куриные эмбрионы и культуры клеток, у которых инфекционное действие вируса может проявляться гибелью, клиническими симптомами, патологоанатомическими изменениями и цитопатическим эффектом. Для каждого вируса подбирают чувствительный к нему тест-объект и форму учета его инфекционного действия, по которой оценивают эффект заражения. В зависимости от вида тест-объекта и формы проявления инфекционного действия ЭД50 принимает один из следующих видов, приведенных в таблице 6. Иначе говоря: 1 ЛД50—это доза вируса, убивающая 50 % лабораторных животных (обычно белых мышей); 1 ИД50—доза вируса, вызывающая клинические симптомы или патологоанатомические изменения у 50 % зараженных лабораторных животных; 1 ЭЛД — доза вируса, убивающая 50 % куриных эмбрионов; 1 ЭИД50—доза вируса, вызывающая патологоанатомические изменения у 50 % зараженных куриных эмбрионов; 1 ЦПД50— доза вируса, вызывающая цитопатический эффект у 50 % зараженных культур клеток (обычно пробирок с культурами клеток). Количество ЭД50 (ЛД50, ИД ЭЛД50, ЭИД50 или ЦПД50) вируса, содержащееся в единице объема вируссодержащего материала, и будет выражением титра (Т) вируса в этом материале. Например, Т=103,48 ЦПД50/0,1 мл означает, что в каждой 0,1 мл вируссодержащего материала содержится 103'48 доз вируса (т. е. более 1000, но менее 10 000, а именно 103,48=3020), каждая из которых способна вызвать цитопатический эффект в 50 % пробирок с культурой клеток. Названные единицы 50%-ного инфекционного действия вируса (ЛД50, ИД50, ЭЛД50, ЭИД50, ЦПД50) используются в случаях оценки инфекционного действия вируса со статистически оцениваемым эффектом, имеющим место, когда учет инфекционного действия вируса ведется по летальному действию, клиническим симптомам, патологоанатомическим изменениям или цитопатическому действию. Титрование вирусов по 50%-ному инфекционному действию — наиболее универсальный прием, пригодный для титрования практически любого вируса, если подобрать чувствительную к нему живую систему (текст-объект). Однако этот метод титрования вирусов довольно трудоемкий, длительный и требует статистических расчетов. Задача определения титра вируса в единицах 50%-ного инфекционного действия (ЛД50, ИД50, ЭЛД50, ЭИД50, ЦПД50) сводится к тому, чтобы найти такое разведение испытуемого вируссодержащего материала, в объеме заражающей дозы которого содержалась бы одна ЭД50, а затем рассчитать, сколько таких единиц вируса содержится в таком же объеме вируссодержащего материала, что и будет показателем титра вируса в этом материале. 70. Принципы диагностики вирусных болезней животных. Для постановки диагноза требуются сбор, изучение, анализ и сопоставление целого комплекса различных данных. Поэтому диагноз — это результат кропотливой и вдумчивой работы. На 1этапе диагностики используют данные, которые можно быстро собрать непосредственно в хозяйстве. К таковым относятся: (эпизоотологические данные) клинические признаки болезни. патологоанатомические изменения, которые обычно устанавливают при вскрытии павших или вынужденно убитых животных. Чаще всего на основании этих данных можно поставить предварительный диагноз, так как многие вирусные болезни имеют сходные эпизоотологические данные, клинические признаки и патологоанатомические изменения (например, парагрипп-3, вирусная диарея, инфекционный ринотрахеит, респираторно-синцитиальная и аденовирусная инфекции крупного рогатого скота или болезни Ньюкасла и грипп птиц и др.). Окончательный диагноз на вирусную болезнь в большинстве случаев может быть поставлен только с учетом результатов лабораторных исследований. Материал для исследования следует брать как можно быстрее после проявления четких признаков болезни или не позднее 1—2 ч после клинической смерти или убоя (позже начинается бактериальное обсеменение, и по мере продолжения инфекционного процесса количество вируса может уменьшаться в результате воздействия защитных механизмов организма). материал должен быть взят строго асептически; законсервирован. брать в стерильные пробирки с резиновой пробкой. на пробирках должна быть не смываемая этикетка. 71. Методы лабораторной диагностики вирусных болезней животных. 1. Культивирование. Целью данного метода является изоляция возбудителя и получение его чистой культуры на специальной среде в оптимальных условиях. Успешное выделение и культивирование возбудителя из клинического материала позволяет подтвердить этиологию заболевания на ранних сроках до появления специфических антител и идентифицировать возбудитель. 2. Световая микроскопия. 1) Микроскопия фиксированных окрашенных препаратов. Является наиболее доступным и потому распространенным методом диагностики инфекционных (особенно трансмиссивных) заболеваний в ветеринарной медицине. Основан на выявлении возбудителя в клиническом материале по характерной морфологии. метода световой микроскопии достаточно ограниченная чувствительность. При незначительном количестве возбудителей в материале результат микроскопии может быть отрицательным. 2)Темнопольная микроскопия. Вид оптической микроскопии, в которой контраст изображения увеличивают за счет регистрации только света, рассеянного изучаемым образцом. Как правило, используется для обнаружения спирохет - боррелий и лептоспир. 3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). метод ферментативного получения ампликонов (большого количества копий) исследуемых фрагментов ДНК путем повторных циклов репликации и денатурации (разделения цепи ДНК на отдельные нити); при этом происходит копирование только исследуемого участка ДНК (при условии его присутствия в данном образце), поскольку только этот участок соответствует заданным условиям Метод ПЦР идеально подходит для обнаружения микроорганизмов, трудно визуализирующихся, медленно растущих или сложных в культивировании. ПЦР является наиболее предпочтительным методом для диагностики заболевания в острый период. Основным лимитирующим фактором при использовании ПЦР является содержание в исследуемой пробе достаточного количества материала (нуклеиновой кислоты возбудителя). Данные методы основаны на выявлении у животных специфических антител. Заражение инфекционным агентом, если оно происходит впервые, в течение недели вызывает у животного умеренный рост иммуноглобулинов класса М (IgM) и постепенное увеличение иммуноглобулинов класса G (IgG), которое достигает пика через 14 дней. Определение уровня антител у животных с остро начинающимся заболеванием (таким как бабезиоз) дает мало полезной диагностической информации. Для диагностики хронических заболеваний (например, моноцитарного эрлихиоза) измерение уровня антител будет более полезным. 1) Твердофазный иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA) Принцип метода заключается в том, один их специфических реагентов (антиген) иммобилизуют на твердой фазе. Затем последовательно добавляют другие специфические реагенты, проводя после инкубации каждого из них промывку с целью удаления несвязавшихся компонентов. Один из специфических реагентов, так называемый конъюгат, содержит ферментную метку. Для визуализации результата в конце реакции добавляют хромогеновый субстрат. Через определенный промежуток времени реакцию останавливают и проводят считывание на спектрофотометре.2) Метод флюоресцирующих антител (МФА, IFA) набор иммунологических методов для качественного и количественного определения поверхностных и внутриклеточных антигенов в образцах клеточных суспензий (культур клеток, бактерий, микоплазм, риккетсий, вирусов), образцов крови, костного мозга, альвеолярных смывов, тонких тканевых срезов. 3) Иммуноблот (вестерн-блот) Аналитический метод, используемый для определения в образце специфичных белков. На первом этапе используют электрофорез белков в полиакриламидном геле для разделения денатурированных полипептидов по длине или по трехмерной структуре белка. Далее белки переносят на нитроцеллюлозную или PVDF-мембрану, затем детектируют с использованием антител, специфичных к заданному белку. 4) Иммунохроматография (ИХА, «экспресс-тесты») Также иммунохроматографические тесты на COVID-19, представляют собой экспресс-тесты на антиген, используемые для выявления инфекции SARS-CoV-2. Они могут применяться людьми без медицинского образования для быстрой диагностики в домашних условиях, стоят значительно меньше других форм тестирования на COVID-19 и дают результат в промежутке времени от 5 до 30 минут. Однако они имеют высокий процент ложноотрицательных результатов. Быстрые тесты на антиген используются в нескольких странах в рамках программ массового тестирования всего населения. Считается, что они ценны для выявления бессимптомных носителей, которые потенциально могут распространять вирус, и которые в противном случае не знали бы, что они инфицированы. 72. Серологические методы диагностических исследований вирусных болезней. Серологические исследования — это методы изучения антигенов или антител в биологическом материале больных, основанные на определенных реакциях иммунитета. Обнаружение в биологическом материале антител к возбудителю инфекции или антигенов позволяет установить причину заболевания. Серологические исследования не обладают 100% специфичностью и чувствительностью при диагностике инфекционных заболеваний. Поэтому оценивать их результаты нужно с учетом клинической картины заболевания. Этим обусловлена необходимость использования для диагностики инфекции нескольких тестов, а также применение методов Western-blot, подтверждающих результаты скрининговых методов. Биологический материал, используемый для серологического исследования Сыворотка крови Слюна Фекальные массы. Целью серологических исследований является установление эффективности проведенного лечения после выздоровления пациента, а также обнаружение рецидива заболевания. Кроме того, серологические методы могут выявить такие заболевания как: Амебиаз Лямблиоз Описторхоз Трихинеллёз Токсоплазмоз ЗППП. Основные методы, используемые в серологической диагностике Реакция иммунофлюоресценции (РИФ, метод Кунса). Разновидности метода: Прямой: микробы или антигены тканей или микробы обрабатваются специальными сыворотками с антителами, а также меченными флюорохромами, которые светятся в УФ-лучах. Бактерии, таким образом, светятся в виде каймы зеленого цвета по периферии клетки. Наблюдается в люминисцентном микроскопе. Непрямой: мазки обрабатываются антителами антимикробной кроличьей сыворотки. Затем антитела, которые не связались с антигенами микробов, отмываются. Таким образом, выявляются оставшиеся на микробах антитела. В итоге, образуется комплекс микроб + антикроличьи антитела + антимикробные кроличьи антитела, помеченные флюорохромом. Этот комплекс наблюдается в люминесцентном микроскопе. Для оценки результатов существует 4хбалльная шкала, которая характеризуется интенсивностью поверхностного жёлто-зелёного свечения клеток антигенов: + очень слабое свечение клетки ++ слабое свечение периферии клетки +++/++++ яркое свечение клетки. Титром реакции считается разведение сыворотки с результатом результат реакции +++ или ++++. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГ) Реакция пассивной или непрямой гемагглютинации используется при диагностике инфекций, вызванных простейшими, бактериями и риккетсиями. Методика состоит из нескольких этапов. Сначала эритроциты обрабатываются «отмываются» изотоническим раствором хлорида натрия, после, при необходимости, - раствором танина 1: 20000, далее сенсибилизируются растворимыми антигенами. После обработки буферным изотоническим раствором хлорида натрия, антиген готов к употреблению. Сыворотку разводят в пробирках изотоническим раствором хлорида натрия, после чего к каждой разведенной сыворотке добавляют эритроцитарный диагностикум. Результаты оценивают по характеру осадка эритроцитов: + слабая интенсивность ++ средняя интенсивность +++ интенсивная реакция ++++ резко интенсивная реакция. Положительным считается результат реакции с интенсивной реакцией +++ или резко интенсивной реакцией ++++, при которых эритроциты покрывают все дно пробирки. Иммуноферментный анализ (ИФА) Метод обладает высокой специфичностью и чувствительностью, более 90%. Основное достоинство - возможность выявления инфекции и прослеживания динамики процесса, на который указывает уровень антител. Применяется анализ для диагностики широкого круга инфекций, в том числе: ВИЧ-инфекция Вирусные гепатиты ЗППП 73. РНГА, ее сущность, компоненты, методы постановки, применение в вирусологии. Реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации (РНГА, РПГА) основана на использовании эритроцитов (или латекса) с адсорбированными на их поверхности антигенами или антителами, взаимодействие которых с соответствующими антителами или антигенами сыворотки крови больных вызывает склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки в виде фестончатого осадка. Компоненты. Для постановки РНГА могут быть использованы эритроциты барана, лошади, кролика, курицы, мыши, человека и другие, которые заготавливают впрок, обрабатывая формалином или глютаральдегидом. Адсорбционная емкость эритроцитов увеличивается при обработке их растворами танина или хлорида хрома. Антигенами в РНГА могут служить полисахаридные АГ микроорганизмов, экстракты бактериальных вакцин, АГ вирусов и риккетсий, а также другие вещества. Эритроциты, сенсибилизированные АГ, называются эритроцитарными диагностикумами. Для приготовления эритроцитарного диагностикума чаще всего используют эритроциты барана, обладающие высокой адсорбирующей активностью. Применение. РНГА применяют для диагностики инфекционных болезней, определения гонадотропного гормона в моче при установлении беременности, для выявления повышенной чувствительности к лекарственным препаратам, гормонам и в некоторых других случаях. Механизм. Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) отличается значительно более высокой чувствительностью и специфичностью, чем реакция агглютинации. Ее используют для идентификации возбудителя по его антигенной структуре или для индикации и идентификации бактериальных продуктов — токсинов в исследуемом патологическом материале. Соответственно используют стандартные (коммерческие) эритроцитарные антительные диагностикумы, полученные путем адсорбции специфических антител на поверхности танизированных (обработанных танином) эритроцитов. В лунках пластмассовых пластин готовят последовательные разведения исследуемого материала. Затем в каждую лунку вносят одинаковый объем 3 % суспензии нагруженных антителами эритроцитов. При необходимости реакцию ставят параллельно в нескольких рядах лунок с эритроцитами, нагруженными антителами разной групповой специфичности. Через 2 ч инкубации при 37 °С учитывают результаты, оценивая внешний вид осадка эритроцитов (без встряхивания): при отрицательной реакции появляется осадок в виде компактного диска или кольца на дне лунки, при положительной реакции — характерный кружевной осадок эритроцитов, тонкая пленка с неровными краями. 74. РДП, ее сущность, компоненты, методы постановки, применение в вирусологии. Реакция диффузионной преципитации (РДП). основана на способности молекул антигенов и антител диффундировать между молекулами агарового геля. Если АГ и АТ специфичны друг другу, то они связываются (комплекс АГ–АТ) и образуют осадок – преципитат. Результат реакции учитывают только визуально по обнаружению в агаровом геле линии преципитации белого цвете. Для этого лучше использовать яркий источник света в затемненном помещении. РДП в ветеринарной практике используют в диагностики бешенства, лейкоза крупного рогатого скота, болезни Марека, инфекционной анемии лошадей и др. Реакция относится к экспресс – методом диагностики, очень простая и не требует стерильности в выполнении. Однако, обладает низкой чувствительностью, в связи с чем не всегда представляется возможным визуально обнаружить преципитат в агаровом покрытие. Именно поэтому специфические антигены и антитела, используемые в реакции, должны находиться в достаточной концентрации, чтобы можно было с высокой степенью вероятности выявлять линии преципитации. Методика постановки РДП 1 Готовят 1,0 %-ный раствор агара на дистиллированной воде и нагревают его на водяной бане в течение 60-90 минут до образования коллоидного раствора (золь); 2 Наливают раствор расплавленный агара ровным слоем на предметное стекло (или чашку Петри), расположенное на горизонтальной поверхности, сначала по периметру, а потом быстро заполняя середину стекла. Толщина агара должна не превышать 1,5–2,0 мм. Не допускать образования пузырей и волн в слое агара. Оставить при комнатной температуре до затвердевания агарового покрытия (агаровый гель). 2 Вырезают в агаре лунки с диаметром 5,0 мм (2,0 мм – для микрометода РДП) на расстоянии 3,0 мм друг от друга. Для этого можно использовать либо специальные штампы для РДП, представляющие собой трубочки одинакового диаметра с остро заточенными краями, расположенные на одной плоскости и на одинаковом расстоянии друг от друга (рис. 29), либо самостоятельно изготовленные бумажные трафареты, количеством лунок, расположенными строго в соответствии с оригинальным штампом. Такой трафарет помещают под стекло с застывшим агаровым гелем и с помощью любой трубки заданного диаметра вырезают лунки. Количество и расположение лунок определяется диагностической задачей. 3 Вносят в лунки компоненты реакции (АГ, АТ). При этом лунка должна быть полностью заполнена. Одновременно с исследуемыми пробами в лунки вносят положительные контроли – антиген специфический и сыворотка специфическая, и отрицательные контроли, не содержащие вирусных антигенов (например, физиологический раствор) и специфических противовирусных антител (например, сыворотка крови от здорового донора). Предметные стёкла помещают во влажную камеру на инкубацию в течение 6 – 12 – 24 – 48 – 72 час. при температуре +37°С. Через 48-72 часа препараты можно высушить и окрасить раствором амидного чёрного, что позволяет сохранять результат реакции длительное время и создаёт возможность документирования результата путём фотографирования. 4 Проводят учёт результата РДП визуально по линии преципитации. РДП используют для индикации и идентификации вируса, для обнаружения и определения титра антител в сыворотке крови. |