Вирусология экзамен. Вирусология Экз. 1. Предмет и задачи ветеринарной вирусологии. История развития вирусологии
 Скачать 0.56 Mb.
|
|
83. Технология сывороточного производства. Сыворотку получают методом цитрирования крови с последующим сепарированием и дефибринированием плазмы. Сыворотку крови консервируют 0,5%-м раствором фенола и отстаивают в специальных емкостях в течение двух месяцев. Отстоявшуюся сыворотку фильтруют вначале через пластины Ф, а затем через стерилизующие пластины СФ. В последующем сыворотку расфасовывают во флаконы емкостью по 100 мл. Флаконы закрывают пробками и для герметичности их обкатывают алюминиевыми колпачками. На флаконы наносят этикетку и часть продукции сдают на контроль. Контроль сывороток проводят по общепринятым методикам. Гипериммунные сыворотки, получаемые из крови путем удаления форменных элементов и фибрина, называются нативными в отличие от сывороток, подвергнутых дополнительной очистке и концентрации специальными методами.Принципы очистки сывороток основаны на выделении из них активных белковых фракций, преимущественно гаммаглобулинов, и удаление балластных фракций, не являющихся носителями антител. Выделенные фракции растворяют в меньшем объеме растворителя по сравнению с исходным объемом, что позволяет препарат сконцентрировать и вводить в меньших дозах. Необходимость в получении концентрированных сывороток связана, во-первых, со значительными объемами выпускаемых лечебных сывороток, исчисляемыми сотнями тонн. Для расфасовки сывороток требуется большое количество флаконов, пробок, колпачков, ящиков для упаковки. Кроме того, большие затраты уходят на транспортировку такого объема сывороточных препаратов. Во- вторых, ввиду недостаточно высокой активности отдельных сывороток, они вводятся животным в больших дозах: с профилактической целью — по 20—60 мл, с лечебной — по 40—120 мл. Уменьшения общего объема выпускаемых сывороток и повышения их активности можно достигнуть путем их очистки и концентрации иммуноглобулинов. В производственных условиях очистку и концентрацию сывороток проводят чаще всего комбинированным способом, включающим стадии ферментативного гидролиза, прогрева ферментированных сывороток в кислой среде, солевого фракционирования и дополнительной очистки от неактивных белков и использования органических растворителей, сорбентов или дополнительного выдерживания сывороток при пониженных температурах. При такой обработке удаляется до 80—85% балластных белков. Кроме указанных методов очистки и концентрации сывороточных препаратов, гамма-глобулиновая фракция выделяется из сыворотки крови методом ультрафильтрации. 84. Методы контроля гипериммунных сывороток и специфических иммуноглобулинов. В процессе производства сывороточных препаратов отдел контроля качества осуществляет контроль на следующих этапах: - контроль стерильности, специфичности и активности вирусных (бактериальных) антигенов; - контроль уровня антител у доноров при гипериммунизации; - входной контроль сывороточных полуфабрикатов (по показателям стерильность и уровень специфических антител) при получении однородного пула сыворотки; - промежуточный контроль полуфабриката препарата (по показателям стерильность, уровень водородных ионов и специфических антител); - контроль готового продукта.При этом есть еще: входной контроль сырья и материалов, контроль производственной среды, контроль качества дезинфекции и пр. Контроль готового продукта. Каждая серия готовой продукции проходит контроль согласно СТО на соответствующий препарат, по результатам которого специалисты отдела контроля качества ООО «Ветбиохим» оформляют паспорт качества на серию продукции, что является основанием для поступления лекарственного средства на склад и соответственно в продажу. Помимо контроля качества, проводимого внутри организации-производителя, каждый препарат обязательно проходит испытания по всем показателям в сторонних организациях. В Российской Федерации все испытания препарат проходит в ФГБУ «ВГНКИ» (таблица 2), при регистрации за рубежом – в соответствующем контрольно-испытательном органе. 85. Получение ферментных препаратов биотехнологическими приемами. Ферменты сохраняют свои уникальные свойства (эффективность, специфичность действия) вне клеток, поэтому их традиционно широко применяют в практике. Биологические катализаторы нетоксичны, работают в мягких условиях, используют доступное сырье (в том числе и отходы), в связи с чем их применение в промышленности выгодно с экономической и экологической точек зрения. Ферменты присущи всем живым существам, однако для их выделения используют те природные объекты, в которых содержание искомого энзима составляет не менее 1 %. Для крупномасштабного получения ферментов пригодны только некоторые растительные организмы на определенной фазе их развития (проросшее зерно различных злаков и бобовых, латекс и сок зеленой массы ряда растений), а также отдельные ткани и органы животных (поджелудочная железа, слизистая оболочка желудочно-ки- шечното тракта, сычуг крупного рогатого скота, семенники половозрелых животных). Практически неограниченный источник ферментов — микроорганизмы (бактерии, грибы, дрожжи), содержащие набор большинства известных в настоящее время энзимов, количество которых можно повысить в десятки и сотни раз методами мутагенеза, селекции и индукции биосинтеза. Для производства посевного материала используют исходный штамм продуцентов, получаемый из лабораторных чистых культур, который выращивают разными способами на предварительно стерилизованной твердой или жидкой питательной среде до определенного возраста. Посевной материал консервируют (высушиванием или хранением при низких температурах) вплоть до дальнейшего использования. Производственные культуры продуцента получают, выращивая посевной материал микроорганизмов как на поверхности твердых или жидких сред, так и в глубине жидких питательных сред. В последние 15 лет для выращивания продуцентов ферментов; чаще используют более экономный — глубинный метод культивирования. В промышленных условиях для этих целей применяют ферментеры из нержавеющей стали, снабженные приспособлениями для перемешивания и подачи в жидкую питательную среду стерильного воздуха. Сначала ферментер заполняют питательной средой, автоклавируют, а затем засевают чистой культурой, подаваемой из специального генератора. В настоящее время наиболее прогрессивным признан проточный метод культивирования микроорганизмов, который обеспечивает непрерывную подачу в ферментер как питательной среды, так и посевного материала. Размножение микроорганизмов и биосинтез фермента регулируют при использовании этого метода по мере поступления питательной смеси в ферментер. Важнейшим фактором эффективности технологии ферментных препаратов является качество питательной среды. Основное требование к качеству питательной среды состоит в полноценности ее состава, обеспечивающей рост продуцента и биосинтез целевого фермента. Микроорганизмы нуждаются прежде всего в соединениях, содержащих углерод, азот, водород и кислород. К ним относятся органические вещества, соли аммония и вода. Кроме того, в состав питательной среды должны быть включены минеральные соединения, содержащие Mg, Са, Р, S, Fe, К и другие макро- и микроэлементы, витамины, ростовые вещества (биотин, инозит) и пр. Питательные среды в зависимости от состава делятся на синтетические и комплексные. Синтетическими считают те среды, которые состоят из определенного по качественному и количественному составу набора индивидуальных веществ. В комплексные среды входят различные природные продукты, часто отходы пищевых производств. К их числу относятся различные жмыхи, барда спиртовых заводов, картофельная мезга, кукурузный экстракт, меласса, отруби и прочие продукты. Благодаря использованию отходов комплексные питательные среды доступны, дешевы и обеспечивают безотходность биотехнологических производств. 86. Приготовление вирусных антигенов - диагностикумов и бактериофагов. Технология производства вирусных антигенов- диагностикумов ((герпеса простого и вируса болезни Ауески): - 1.- В роллерный матрац Винчестера с минимальной средой Игла (МСИ), содержащей 10 % триптозофосфатного бульона и 10 % сыворотки теленка, внести 2-Ю7 клеток ВНКС13 и выращивать при 37 °С в течение 3 сут. 2-. Инфицировать культуру клеток суспензией производственного штамма вируса (20 мл в среде Игла, не содержащей сыворотки) при множественности заражения 1 БОЕ на 300 клеток. 3.- Инкубировать при 37 °С в течение 1 ч для адсорбции вируса клетками. Добавить 50 мл среды Игла с 5 % триптозофосфата и 5 % сыворотки теленка и инкубировать при 37 °С в течение 2 дней (для вируса герпеса простого), в течение 27 - 36 ч (для вируса псевдобешенства). . Встряхивая сосуды, отделить клетки от стекла. Если клетки не отделяются, обработать монослой раствором версена. 5. Осадить клетки центрифугированием при 400 g в течение 10 мин. 6. Слить надосадочную фракцию и центрифугировать ее при 20000 g в течение 90 мин. 7. Полученную надосадочную фракцию слить в раствор хлорофоса, а осадок суспендировать в МСИ с 10 % триптозофосфата и 5 % сыворотки теленка (2 мл на бутыль). 8. Образовавшие осадок клетки разрушить в УЗД или тремя циклами замораживания и оттаивания в водяной бане. 9. Осадить обломки клеток при 400g в течение 10 мин. 10.Надосадочную жидкость, содержащую вирус, проверить на бактериальное загрязнение, инокулируя препараты в бульон с экстрактом сердца и мозга (1 неделя при 37 °С) или в жидкую среду Саборада (1 неделя при 37 °С). 11.Вирусы очищают седиментацией в растворах с высокой плотностью, например в насыщенных растворах КВг. В этих условиях выявляются полосы, соответствующие вирионам и пустым частицам. 12.Проводят контроль качества препарата согласно нормативной документации. ТЕХНОЛОГИЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ БАКТЕРИОФАГОВ: Технология приготовления бактериофагов, в основном, аналогична технологии приготовления вирусных препаратов, только вместо эукариотов используются бактериальные клетки, в которых бактериофаги размножаются. Высокая специфичность некоторых штаммов бактериофагов позволяет использовать их для диагностики инфекционных заболеваний и индикации патогенных микроорганизмов. Фагоиндикация позволяет установить природу возбудителя инфекции. 87. Методика получения однослойной первично - трипсинизированной культуры клеток. ПТКК – клетки, полученные непосредственно из органов или тканей организма, растущие in vitro в один слой. КК можно получить практически из любого органа или ткани человека или животного. Лучше это удается сделать из эмбриональных органов, т.к. клетки эмбрионов обладают более высокой потенцией роста. Чаще всего для получения их используют почки, легкие, кожу, тимус, тестикулы. Не позднее 2-3 часов после убоя берут соответствующие органы или ткани, измельчают, обрабатывают трипсином, панкреатином, коллагеназой. Ферменты разрушают межклеточные вещества, полученные при этом отдельные клетки суспендируют в питательной среде и культивируют на внутренней поверхности пробирок или матрасов в термостате при 37С. Клетки прикрепляются к стеклу и начинают делится. На стекле формируется слой толщиной в одну клетку, обычно через 3-5 дней. Питательную среду меняют по мере загрязнения ее продуктами жизнедеятельности клеток. Монослой сохранят жизнеспособность в течение 7-21 дня. При культивировании вирусов в КК удается получать препараты с высоким титром вируса, что важно при получении АГ и вакцин. С помощью метода КК были решены некоторые теоретические вопросы – о взаимодействии вируса с клеткой, месте репродукции вирусов, механизме антивирусной иммунизации. В настоящее время КК применяют для выделения вирусов из патматериала, их индикации, идентификации, для постановки реакции нейтрализации, определения титра вирусов, для приготовления диагностических АГ и вакцин, в качестве тест – объектов в реакции нейтрализации. 88. Технология производства вирусных вакцин. Прежде чем приступить к производству какого-либо вида вирусной вакцины, необходимо получить определенное количество вирусного материала. Вирусы растут только в клетках живых организмов. При использовании целостных организмов возникают немалые сложности. Каждый организм обладает спектром индивидуальных свойств, зависящих от самых различных причин, но все они влияют на успех заражения. Выбор животного того или иного вида и возраста зависит от применяемого вида вируса. Наиболее широко используют белых мышей, крыс, хомяков, морских свинок, кроликов. Но для промышленного производства используют, в основном, культуры клеток. В настоящее время вакцины, получаемые в культурах клеток, отличаются большим разнообразием: это вакцины против бешенства, чумы, гепатита, оспы, энцефалитов. После накопления вирусов в клетках следующим этапом в производстве вакцин является индикация, идентификация и определение титра вирусного материала. Прямое непосредственное выявление вирусов возможно с помощью электронного микроскопа, но при условии, что в пробе содержится не менее 10-100тыс. вирионов в 1мл. Этот метод не всегда можно применить. При заражении животных вирус идентифицируют по специфическим патологическим изменениям, которые он вызывает внутри организма. Репродукция в клеточных культурах отражается цитопатогенным действием вируса на клетки культуры. Выделение, очистка и концентрирование вирусного материала - После накопления, индикации, идентификации и титрования вирусов проводят выделение и очистку вирусного материала от балластных веществ, так как при накапливании вирусного материала на одну частицу вируса приходится много частиц, никак с ней не связанных, а относящихся в среде. Очистка вирусного материала – непременная операция вакцинного производства, обеспечивающая получение более сильнодействующих и безопасных препаратов. После выделения вируса материал проверяют на стерильность путем посева на питательные среды. Таким образом, выявляют бактериальную загрязненность. После проведения очистки трудно провести дифференциальную инактивацию или отделить такие агенты от целевого вируса. Поэтому, биологическая чистота должна гарантироваться тщательным контролем всех исходных материалов, используемых в производстве, и жестким соблюдением производственных правил. 89. Механизмы противовирусного действия интерферона. Применение интерферона. Интерферон это Белок, Механизм противовирусного действия заключается в создании защитных механизмов в неинфицированных вирусом клетках. Связываясь со специфическими рецепторами на поверхности клетки, интерферон альфа изменяет свойства мембраны клетки, предотвращает адгезию и проникновение вируса внутрь клетки, стимулирует специфические ферменты, Наиболее изученным свойством интерферона является его способность препятствовать размножению вирусов. Он образуется в клетках млекопитающих и птиц в ответ на вирусную инфекцию. воздействует на РНК и ингибирует синтез белков вируса. Подавляет репликацию вирусов в инфицированной клетке. При заражении клетки вирус начинает размножаться. Клетка-хозяин одновременно с этим начинает продукцию интерферона, который выходит из клетки и вступает в контакт с соседними клетками. Хотя интерферон не обладает прямым противовирусным действием, он способен вызывать такие изменения в клетках, которые препятствуют размножению вируса, формированию вирусных частиц и дальнейшему его распространению. Интерферон действует в нескольких направлениях. Во-первых, он оказывает влияние на клетки, соседние с инфицированной, запуская в них цепь событий, приводящих к подавлению синтеза вирусных белков и в некоторых случаях сборки и выхода вирусных частиц (путём активации олигоаденилатциклазы). В ответ на воздействие интерферона клетки вырабатывают большое количество протеинкиназы R. Этот фермент фосфорилирует фактор инициации трансляции eIF-2, фосфорилированный eIF-2 формирует неактивный комплекс с другим фактором, eIF-2B. В результате уровень белкового синтеза в клетке снижается. После протеинкиназы R активируется синтез рибонуклеазы L, которая расщепляет клеточные РНК и ещё больше снижает уровень белкового синтеза. В целом, интерферон-зависимое подавление трансляции является губительным как для вируса, так и для клетки-хозяина. Помимо влияния на трансляцию, интерфероны способны активировать сотни других генов (они известны как гены, стимулируемые интерфероном), играющих роль в защите клетки от вирусов. Кроме того, интерферон лимитирует распространение вирусных частиц путём активации белка p53, что ведёт к апоптотической смерти инфицированной клетки. Вторым направлением действия интерферонов является стимуляция иммунной системы для борьбы с вирусами. Интерферон повышает синтез молекул главного комплекса гистосовместимости I и II классов и активирует иммунопротеасому. Высокий уровень молекул главного комплекса гистосовместимости I класса обеспечивает эффективную презентацию вирусных пептидов цитотоксическим Т-лимфоцитам и натуральным киллерам, а иммунопротеасома осуществляет процессинг вирусных пептидов, предшествующий презентации. Высокий уровень молекул главного комплекса гистосовместимости II класса обеспечивает презентацию вирусных антигенов Т-хелперам. Т-хелперы, в свою очередь, выделяют цитокины, которые координируют активность других клеток иммунной системы. Некоторые виды интерферонов, например интерферон-γ, могут прямо стимулировать клетки иммунной системы, такие как макрофаги и натуральные киллеры. Образование интерферона могут стимулировать не только интактные вирусы, но и различные другие агенты, например некоторые инактивированные вирусы, двухцепочечные РНК, синтетические двухцепочечные олигонуклеотиды и бактериальные эндотоксины. Человеческий лейкоцитарный интерферон во флаконах Биологическая активность интерферона очень высока. У мышиного интерферона она составляет 2⋅109 ед./мг, а одна единица снижает образование вирусов примерно на 50 %. Это означает, что достаточно одной молекулы интерферона, чтобы сделать клетку резистентной к вирусной инфекции. Показано, что молекулы интерферона должны оказывать действие на клетку в течение минимум четырёх часов, для того, чтобы в клетке начались процессы борьбы с вирусом, таким образом, многие специалисты не считают эффективным интраназальное применение интерферона для профилактики ОРВИ[17]. Тем не менее, последние исследования на мышах показывают, что интерферон, применённый на слизистую оболочку, может действовать в качестве иммунологического адъюванта против вируса гриппа, усиливая специфический ответ иммунной системы[18]. В США проводятся клинические испытания вакцины против гриппа, которая использует интерферон в качестве адъюванта. Интерферон вызывает и целый ряд других биологических эффектов, в том числе подавляет размножение клеток. 90. Биотехнология получения ДНК-вакцин – вакцин третьего поколения. Используемые сегодня вакцины можно разделить в зависимости от методов их получения на следующие типы: • живые аттенуированные вакцины; • инактивированные вакцины; • вакцины, содержащие очищенные компоненты микроорганизмов (протеины или полисахариды); • рекомбинантные вакцины, содержащие компоненты микроорганизмов, полученные методом генной инженерии. Технологию рекомбинантной ДНК применяют также для создания живых ослабленных вакцин нового типа, достигая аттенуации путем направленных мутаций генов, кодирующих вирулентные протеины возбудителя заболевания. Эту же технологию используют и для получения живых рекомбинантных вакцин, встраивая гены, кодирующие иммуногенные протеины, в живые непатогенные вирусы или бактерии (векторы), которые и вводят человеку. Принцип применения ДНК-вакцин заключается в том, что в организм пациента вводят молекулу ДНК, содержащую гены, кодирующие иммуногенные белки патогенного микроорганизма. ДНК-вакцины называют еще генными, генетическими, полинуклеотидными вакцинами, вакцинами из нуклеиновых кислот. Для получения ДНК-вакцин ген, кодирующий продукцию иммуногенного протеина какого-либо микроорганизма, встраивают в бактериальную плазмиду. Плазмида представляет собой небольшую стабильную молекулу кольцевой двухцепочечной ДНК, которая способна к репликации (воспроизведению) в бактериальной клетке. Кроме гена, кодирующего вакцинирующий протеин, в плазмиду встраивают генетические элементы, которые необходимы для экспрессии («включения») этого гена в клетках эукариотов, в том числе человека, для обеспечения синтеза белка. Такую плазмиду вводят в культуру бактериальных клеток, чтобы получить большое количество копий. Затем плазмидную ДНК выделяют из бактерий, очищают от других молекул ДНК и примесей. Очищенная молекула ДНК и служит вакциной. Введение ДНК-вакцины обеспечивает синтез чужеродных протеинов клетками вакцинируемого организма, что приводит к последующей выработке иммунитета против соответствующего возбудителя. При этом плазмиды, содержащие соответствующий ген, не встраиваются в ДНК хромосом человека. |