Гилберт С. Биология развития. Т.2.doc ,БИР. Библиография Гилберт С. Биология развития в 3х т. Т. 2 Пер с англ. М. Мир, 1994. 235 с
 Скачать 19.05 Mb.
|
Глава 10. Тождество геномов и дифференциальная экспрессия генов: молекулярные исследованияИщи простоту и не верь ей. АЛЬФРЕД НОРТ УАЙТХЕД (1919) Для такого исследования необходимо изолировать и накопить в большом количестве не клеточные ядра и даже не отдельные хромосомы, а определенные части определенных хромосом из определенных клеток, только тогда химик сможет анализировать [наследственный материал] более углубленно, чем морфолог. ТЕОДОР БОВЕРИ (1904) ВведениеЭмбриологи задавались вопросом, идентичны ли наборы генов в клетках разного типа одного и того же организма тому набору генов, который содержится в зиготе? Молекулярные биологи интересовались аналогичным вопросом: не является ли ДНК в клетках разного типа одинаковой, несмотря на различия в белках, синтезируемых этими клетками? Проблема осталась той же, но технические приемы, используемые для ее решения, усложнились. Вместо анализа отдельных органов или зародышей мы можем теперь рассмотреть индивидуальные последовательности ДНК и выяснить, присутствуют ли в клетках одни и те же гены и участвуют ли они в активном синтезе РНК. Прежде чем продолжить рассмотрение этой проблемы, нам следует познакомиться с методами молекулярной биологии. Методы молекулярной биологииГибридизация нуклеиновых кислотСовременные представления о генах эукариот и их РНК-продуктах были сформулированы главным образом на основе опытов по гибридизации нуклеиновых кислот. Методика гибридизации включает отжиг одноцепочечных фрагментов РНК и ДНК, позволяющий комплементарным цепям образовывать двухцепочечные гибриды. Например, если нуклеиновые кислоты разрезаны на небольшие фрагменты и каждый фрагмент диссоциирован на отдельные нити (т.е. денатурирован), то каждая нить по прошествии достаточного времени может найти комплементарного партнера и соединиться с ним. Условия ренатурации должны быть таковы, чтобы специфические гибриды комплементарных цепей сохранялись, а неспецифические гибриды диссоциировали. Обычно эти условия обеспечиваются изменением температуры или ионной силы раствора, в котором проходит ренатурация (Wetmur, Davidson, 1968). Сходным образом следует ожидать, что РНК, синтезируемая на каком-либо участке ДНК, будет связываться с цепью, на которой она синтезирована. Таким образом, предполагается, что РНК специфически гибридизуется с геном, который ее кодирует. Для определения уровня гибридизации одну из цепей нуклеиновой кислоты обычно метят радиоактивным изотопом. Возьмем для примера один эксперимент. Нерадиоактивную ДНК из печени лягушки можно денатурировать (ее цепи разделяются в щелочи) и иммобилизовать на нитроцеллюлозном фильтре. Радиоактивную РНК можно получить при введении радиоактивных предшественников РНК в другую лягушку или в культуру клеток лягушки. Гилберт С. Биология развития: В 3-х т. Т. 2: Пер. с англ. – М.: Мир, 1994. – 235 с.__________________ ТОЖДЕСТВО ГЕНОМОВ И ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ_______________ 81 Затем выделяют рибосомы и экстрагируют из них радиоактивную рибосомную 28S-PHK (рРНК), которую добавляют к фильтрам с ДНК. Полагают, что радиоактивная РНК будет связываться только с теми участками ДНК. которые содержат гены для 28S-pPHK. Количество связавшейся РНК можно определить, измерив радиоактивность фильтров после удаления несвязавшейся РНК. Схема такого опыта и его результаты показаны на рис. 10.1. ДНК выделяли из нормальных головастиков с двумя ядрышками на клетку, а также из гомозиготных мутантов, полностью лишенных ядрышек, и гетерозиготных головастиков с одним ядрышком на клетку (Wallace, Birnstiel, 1966). ДНК, выделенную из каждой группы, денатурировали. По 50 мкг ДНК наносили на каждый из нескольких десятков бумажных фильтров: в одной группе фильтров – денатурированная ДНК из головастиков дикого типа; во второй – ДНК из мутантных головастиков; в третий – ДНК из гетерозиготных головастиков. Затем различные количества радиоактивной 28S-pPHK гибридизовали с тремя типами ДНК на фильтрах. На одни фильтры наносили небольшие количества радиоактивной ДНК, на другие – большие количества. Оказалось, что радиоактивная рРНК хорошо связывается с ДНК из нормальных головастиков, насыщая в конечном счете всю доступную ДНК. С ДНК из клеток головастиков, лишенных ядрышек, рРНК не связывалась, тогда как ДНК из гетерозиготных головастиков связывала лишь половину того количества рибосомной РНК, которое связывалось с ДНК из нормальных головастиков. Таким образом, было показано, что гены 28S-pPHK в геноме головастиков транскрибируются в области ядрышек. Одна из технических трудностей, связанных с гибридизацией нуклеиновых кислот, заключается в сложности получения молекул РНК с высокой радиоактивностью. Это затруднение можно преодолеть с помощью выделения РНК и получения комплементарной ДНК-копии (кДНК) в присутствии радиоактивных предшественников. Она может быть синтезирована в пробирке, содержащей РНК, короткий фрагмент ДНК, называемый праймером (затравкой), радиоактивные предшественники ДНК и вирусный фермент – обратную транскриптазу.Этот фермент способен синтезировать ДНК на РНК-матрице (рис. 10.2). Поскольку ДНК синтезируется in vitro, проблем с разведением радиоактивных предшественников не возникает. Кроме того, такая кДНК может гибридизоваться как с геном, синтезирующим РНК (хотя и с некодирующей цепью), так и с самой РНК. Это оказывается чрезвычайно полезным при регистрации небольших количеств специфических РНК. Клонирование геновСравнительно недавно, используя методы гибридизации нуклеиновых кислот, биологам развития на основе подхода, названного клонированием генов, удалось выделить отдельные гены. Если бы кто-то захотел изолировать, например, отдельный ген человека, то он столкнулся бы с неразрешимыми проблемами. Геном человека содержит ДНК в количестве, достаточном для кодирования примерно 2 х 105 генов размером около 15 000 пар оснований каждый. Обычные биохимические процедуры не позволяют отделить один ген от всех остальных. Однако техника клонирования генов позволяет выделить специфические участки ДНК, а также провести их амплификацию до огромного числа копий. Первый этап в этой процедуре заключается в разрезании ядерной ДНК на различные фрагменты. Это осуществляется с помощью инкубации ДНК в присутствии рестрикционной эндонуклеазы (обычно называемой «рестриктазой»). Эти эндонуклеазы являются, как правило, бактериальными ферментами, которые узнают специфические последовательности ДНК (табл. 10.1) и расщепляют ДНК в этих участках (Nathans, Smith, 1975). Например, если ДНК человека инкубируют с ферментом BamH1(выделенным из Bacillusamyloliquifaciens, штамм H), то ДНК разрезается в каждом участке, где имеется последовательность ГГАТЦЦ. Продуктом реакции являются различные по длине фрагменты ДНК. содержащие Г на одном конце и ГАТЦЦ на другом (рис. 10.3). Следующий этап – включение полученных фрагментов ДНК в векторы для клонирования. Эти векторы представляют собой кольцевые молекулы ДНК, которые реплицируются в бактериальных клетках независимо от бактериальной хромосомы. Обычно используются плазмиды, устойчивые к тем или иным лекарственным препаратам, или специально модифицированные вирусы, которые особенно эффективны в случае клонирования больших фрагментов ДНК. Подобную плазмиду можно сконструировать таким образом, чтобы она содержала только один чувствительный к BamH1сайт. Ее можно раскрыть при инкубации с данной рестриктазой. После раскрытия она смешивается с фрагментированной ДНК. Во многих случаях нарезанные фрагменты ДНК оказываются включенными в векторы благодаря комплементарности их концов открытым концам вектора. Затем эти фрагменты могут соединяться ковалентно в растворе, содержащем фермент ДНК-лигазу. Итогом всей процедуры являются бактериальные плазмиды. каждая из которых содержит одиночный фрагмент ДНК человека. Их называют рекомбинантными плазмидами или просто рекомбинантной ДНК (Cohen et al.. 1973; Blattner et al.. 1978). |