биохимия хазипов. Биохимия животных Электронный дидактический комплекс (эдк)

• Название: Биохимия животных Электронный дидактический комплекс (эдк)
• Анкор: биохимия хазипов.doc
• Дата: 24.04.2017
• Размер: 14.38 Mb.
• Имя файла: биохимия хазипов.doc
• Тип: Документы; #3580
• страница: 2 из 23

2. БЕЛКИ; БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ

Аминокислоты

Биологическая химия– наука о химии жизни, о химических явлениях живой природы. Биологическая химия изучает химический состав живых организмов, химические процессы, обеспечивающие их существование.

Жизнь – это форма движения материи, качественно более высокая, чем физическая и химические формы. Она реализуется в индивидуальных биологических организмах. Все живые организмы содержат органические макромолекулы, построенные по общему принципу. Например, бактериальная клетка – кишечная палочка (E.coli) – содержит 5000 различных органических соединений, в том числе 3000 различных белков. Вместе с тем, для всех живых систем известны общие черты. Например, нуклеиновые кислоты состоят из 4-х нуклеотидов, белки – из 20 различных аминокислот, хотя нет полностью тождественных двух организмов по составу белков и нуклеиновых кислот. Общим является также использование энергии через аденозинтрифосфорную кислоту (АТФ). Во всех живых организмах химические процессы происходят при определенной температуре (например, 37⁰C), рН и осмотическом давлении в водной среде. Катализаторами биохимических реакций являются ферменты. Все молекулы, клеточные структуры тканей организма в высокой степени упорядочены, взаимозависимы. Каждый организм является саморегулирующейся системой, для которой характерен обмен веществ, рост, размножение. В организме постоянно происходит расход энергии, образующейся за счет веществ, поступающих из внешней среды. Нормальная жизнедеятельность возможна лишь при определенном химическом составе клеток и тканей. Это обеспечивается в результате синтеза необходимых веществ. Субстратом для синтеза являются питательные вещества – белки, углеводы, липиды, витамины, соли, вода, кислород, которые поступают в организм из окружающей среды. В живых клетках расщепление веществ – (диссимиляция) – постоянно сочетается с их синтезом (ассимиляция). Распад и синтез – это две стороны единого процесса жизнедеятельности.

Живая материя представляет собой сложную биологическую систему, где ведущую роль играют белки и нуклеиновые кислоты. В природе нет живых существ без белков и нуклеиновых кислот. Белки занимают центральное место во всех химических процессах, обуславливающих обмен веществ организма. Нуклеиновые кислоты являются хранителем наследственной информации. Углеводы, липиды, неорганические соли и вода играют важную роль, но занимают подчиненное положение. Важной особенностью обмена в животной клетке является единство и взаимосвязь происходящих в ней многочисленных реакций.

В зависимости от объекта изучения различают биохимию человека, животных, растений, микробов, вирусов. По направлению изучения биохимию делят на статическую, где изучается химический состав, свойства исследуемого объекта; динамическую, изучающую превращение веществ с момента поступления в организм и заканчивая выделением конечных продуктов обмена и функциональную, где изучаются химические основы физиологической деятельности организма в целом, органа, ткани, клетки. Общая биохимия рассматривает общие для всех живых систем закономерности, частная биохимия рассматривает биохимические особенности отдельных систем, органов, тканей и клеток.

Живой организм характеризуется высокой степенью упорядоченности составляющих его ингредиентов и уникальной структурной организацией, обеспечивающей многообразие биологических функций. В этом структурно-функциональном единстве организмов, составляющем сущность жизни, белки играют важнейшую роль.

Белки – высокомолекулярные азотсодержащие органические вещества, молекулы которых построены из остатков аминокислот. Название протеины (от греч. protos – первый, важнейший) – точно отражает первостепенное биологическое значение белков. В отечественной литературе слово «белки» принято называть по аналогии с белком куриного яйца, приобретающем при кипячении (денатурации) белый цвет.

Сейчас, когда достоверно установлено, что наследственная информация у любых живых организмов сосредоточена в молекуле дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), не вызывает сомнения то, что только белки являются теми молекулярными инструментами, при помощи которых реализуется эта генетическая информация. Без белков, в частности ферментов, ДНК не может реплицироваться, не может самовоспроизводить себя – свойства, необходимые для наследственной передачи генетической информации.

Основные проявления жизни: пищеварение, раздражимость, сократимость, способность к росту и размножению, движение, обмен веществ – все связаны с веществами белковой природы. Белки являются основой структуры и функции живых организмов, они выполняют чрезвычайно многообразные функции; считают, что в природе существует 10¹⁰ - 10¹² различных белков, обеспечивающих существование 1,2 • 10⁶ видов живых организмов различной сложности организации. В клетке E.coli содержится около 3000 различных белков, а в организме животных их насчитывается около 100000. Из этого огромного количества разнообразных белков сейчас известно строение более 3000. Самое удивительное заключается в том, что такое большое разнообразие белковых молекул построено из сравнительно простых блоков (кирпичиков) – аминокислот. В состав природных белков входит всего около 20 видов аминокислот.

Белки в организме выполняют следующие основные функции:

1. Каталитическая функция белков. Все пор открытые биологические катализаторы – ферменты являются белками, известных ферментов сейчас свыше 3000. Эта функция белков является уникальной, не свойственной другим полимерным молекулам. Правда, в последнее время стало известно, что рибонуклеиновые кислоты также могут обладать ферментативной активностью. Их называют рибозимами.

2. Питательная (резервная) функция белков. К таким белкам относятся так называемые резервные белки, являющиеся источником питания для развития плода; белки яйца (овальбумины) и основной белок молока (казеин), также выполняют главным образом питательную функцию. Ряд белков используется в качестве источника аминокислот, которые в свою очередь являются предшественниками биологически активных веществ.

3. Транспортная функция белков. Дыхательная функция крови, в частности, перенос O₂, целиком осуществляется молекулами гемоглобина – белка эритроцитов. В транспорте липидов принимают участие альбумины сыворотки крови. Белки сыворотки образуют комплексы с жирами, медью, железом, тироксином, витамином А и другими соединениями, обеспечивая их доставку в соответствующие органы.

4. Защитная функция белков. Основную функцию защиты в организме выполняет иммунологическая система, которая обеспечивает синтез специфических защитных белков – антител в ответ на поступление в организм бактерий, токсинов или вирусов. Взаимодействие антител с антигенами (чужеродными белками) способствует нейтрализации их биологического действия, что обеспечивает безопасность организма от генетически чужеродной информации. Способ свертывания крови это тоже защитная реакция: свертывание белка плазмы крови фибриногена приводит к образованию сгустка крови, что предохраняет от потери крови при ранениях. Интерферон – универсальный противовирусный белок также выполняет защитную функцию.

5. Сократительная функция белков. В сокращении и расслаблении мышц участвуют белки актин и миозин – специфические белки мышечной ткани. Сократительная функция присуща не только мышечным белкам, но и белкам ряда субклеточных структур, что обеспечивает определенные процессы жизнедеятельности клеток.

6. Структурная функция белков. Структурная функция белков занимает очень большое место. Например: коллаген в соединительной ткани, кератин в волосах, ногтях, роговой ткани, эластин в сосудистой стенке выполняют пластические и опорные функции. Важную роль играют белки в комплексе с углеводами в формировании ряда секретов – мукоидов, муцинов и т.д. В комплексе с липидами (фосфолипидами) белки участвуют в образовании биомембран клетки.

7. Гормональная функция белков. В регуляции обмена веществ в организме важную роль играют гормоны, которые вырабатываются в железах внутренней секреции. Ряд гормонов являются белками или полипептидами: гормоны гипофиза – соматотропин, окситоцин, вазопрессин; гормон поджелудочной железы – инсулин и т.д.

Кроме указанных функций, следует отметить, что белки в организме играют важную роль в поддержании онкотического давления и в создании буферных систем. Белки осуществляют генерирование и передачу нервных импульсов. Например, родопсин является фоторецепторным белком клеток палочек сетчатки глаза, имеются белки – вкусовые рецепторы, обонятельные рецепторы. Молекулы рецепторы приводятся в действие специфическими веществами. Например, рецептор ацетилхолина - белок, состоящий из 5 единиц, образует ионный канал.

Регуляция роста и дифференцировки клеток осуществляется также специальными белками. Имеются белки-репрессоры, интерлейкины, белки (пептиды), регулирующие дифференцировку клетки. Обобщая, следует подчеркнуть, что белки в организме выполняют разнообразные функции, обеспечивающие жизненные процессы. Важно то, что белки обладают высокой специфичностью; например, фермент строго взаимодействует со своим субстратом, антитела с антигеном. Высокой специфичностью наделены также белки, обеспечивающие такие процессы как рост, деление и дифференцировка клеток, онтогенетическое развитие живых организмов, биологическая индивидуальность.
Содержание белков в организме и тканях
Белковыми веществами наиболее богаты органы и ткани животных. Источником белка являются также микроорганизмы и растения. Большинство этих белков хорошо растворимы в воде. Однако некоторые органические вещества, выделенные из хрящей, волос, рогов, костной ткани, не растворимые в воде, также отнесены к белкам, т.к. по химическому составу они близки к белкам, выделенным из мышечной ткани, сыворотки крови и т.д.

Важным признаком белков служит наличие в них азота, который входит в состав белка как элемент аминокислот. В белках содержится (в % на сухую массу):

углерода	49-55
кислорода	21-23
азота	15-17
водорода	6-8
серы	0,2-3
фосфора	1 - 2

В состав некоторых сложных белков входят Fe, Cu, J, Zn, Br, Mn и другие элементы. Некоторые из них содержатся в очень малых количествах, но имеют важное жизненное значение. Так, железо в составе белков гемоглобина, миоглобина и цитохромов играет важную роль в процессе дыхания, медь – в окислительных процессах, йод входит в состав гормонального белка щитовидной железы, кобальт – в состав витамина В₁₂, являющегося составной частью ряда ферментов и т.д. Количество азота в белках животного происхождения составляет в среднем 16% или на 1 г азота приходится 6,25 г белка (100:16 = 6,25) Эта величина используется для вычисления содержания белка в различных тканях животных (метод Къельдаля).

В организме животных содержится до 50% белков от сухой массы, в семенах злаков – 8-12, в семенах бобовых – 25-35, в клубнях (картофель) – 0,5-2%.
Таблица 2.1

Содержание белка в некоторых тканях (по Чечеткину А.В.)

Ткань (орган)	% от массы свежей ткани	% от массы сухой ткани
Головной мозг	7-9	45
Легкие	14-15	82
Сердечная мышца	16-18	60
Печень	18-20	63
Селезенка	19-21	84
Скелетная мышца	18-23	80
Ячмень		11-13
Кукуруза		8-10
Овес		8-11
Рожь		10-12
Пшеница		14-16
Горох		20-25
Жмых подсолнечниковый		32-42

Белковые вещества в природе находятся в различных состояниях. Например, белки молока, сыворотки крови представляют коллоидные растворы (золи), другие – твердые вещества, нерастворимые в воде (кератин шерсти, рога и т.д.). В некоторых органах белки находятся в полужидком состоянии (кожа, мышцы).
Методы выделения белков
Для подробного исследования физико-химических и биологических свойств белков, химического состава и строения необходимым условием является получение индивидуальных белков в высокоочищенном, гомогенном виде. Для этого обычно биологический материал измельчают (гомогенизируют), белки извлекают (экстрагируют), разделяют (фракционируют).

Гомогенизация. Существуют различные измельчители гомогенизаторы (ножевые, пестиковые), шаровые мельницы; методы замораживания и оттаивания (попеременное) – для получения вирусных белков; разрушение ультразвуком, пресс-методы (пропускание замороженного материала через мелкие отверстия под давлением) и т.д.

Экстракция белков. Для экстракции белков применяются различные буферные смеси с определенными значениями рН среды, органические растворители, неионные детергенты – вещества, нарушающие гидрофобные взаимодействия между белками и липидами и между белковыми молекулами.

Широко используются глицерин, растворы сахарозы, буферные смеси – фосфатные, цитратные, боратные со значениями рН от слабощелочных до кислых, которые способствуют как растворению, так и стабилизации белков. Широко применяется трис-буфер (например, 0,2 M раствор трис (оксиметил) аминометана с 0,1 M раствором HCl в разных соотношениях). Для выделения белков сыворотки крови применяют методы осаждения этиловым спиртом (получение гамма-глобулина), ацетоном, бутиловым спиртом и т.д.

Широко применяется осаждение сульфатом аммония (NH₄)₂SО₄ – для выделения альбуминов и глобулинов.

Для разрыва белково-липидных связей применяют различные детергенты (для отделения от мембран) – тритон Х-100. додецилсульфат натрия, дезоксихолат натрия и т.д.
Методы фракционирования и очистки белков
После экстрагирования белков, т.е. перевода в растворенное состояние, приступают к разделению, фракционированию смеси белков на индивидуальные белки. Для этого применяют методы:

• высаливания;

• осаждения органическими растворителями;

• тепловой денатурации;

• хроматографии;

• гель фильтрации;

• ультрацентрифугирования;

• кристаллизации;

• электрофореза;

• распределения в двухфазных системах.

Как известно, растворение белков в воде связано с гидратацией отдельных молекул, что приводит к образованию вокруг белковой молекулы водных (гидратных) оболочек, состоящих из ориентированных в определенной форме в пространстве молекул воды. Эта вода (гидратной оболочки) отличается от чистого растворителя. Растворы белков отличаются крайней неустойчивостью и под действием разнообразных факторов, нарушающих гидратацию, белки легко выпадают в осадок. Поэтому добавление к раствору белка любых водоотнимающих средств (спирт, ацетон, концентрированные растворы нейтральных солей щелочных металлов), а также воздействие физических факторов (нагревание, облучение) приводит к дегидратации молекул и их выпадению в осадок.

Высаливание. При высаливании белка солями щелочных и щелочноземельных металлов белок обычно не теряет способности растворяться вновь в воде после удаления солей (диализом, гельфильтрацией). Например: глобулины выпадают в осадок при 50% насыщения, а альбумины при 100% насыщении раствора сульфатом аммония. При выпадении белковой молекулы в осадок, большое значение имеет не только концентрация солей, но температура и ионная сила раствора.

Методы хроматографии. Метод хроматографии, разработанный в 1903 г. русским ученым М.В. Цветом, основан на способности пигментов (или др. веществ) специфически связываться с адсорбентом, заключенном в колонке; используются также процессы сорбции и десорбции. Применяют различные методы хроматографии – адсорбционную, распределительную, ионнобменную.

Адсорбционная хроматография – адсорбентом является активированный уголь, окись алюминия или кремния. Широко применяются для разделения белков и другие вещества.

Распределительная хроматография. При этом твердая фаза является только носителем для жидкой фазы. Виды: хроматография на бумаге, на колонках, где в качестве стационарной фазы применяют крахмал или селикагель.

Ионообменная хроматография. Ионообменные смолы являются полимерными органическими соединениями, содержащими функциональные группы, способные вовлекаться в ионный обмен.

Различают анионообменники (органические основания и амины), катионообменники, содержащие фенольные, сульфо-и карбоксильные группы. Широко применяются диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-целлюлоза), триэтиламиноэтил (ТЭАЭ) и аминоэтил (АЭ) - целлюлозы.

Аффинная хроматография (или хроматография по сродству) основана на принципе избирательного взаимодействия белков со специфическими веществами, закрепленными на носителе. В качестве носителя применяют активированную бромцианом сефарозу (CNBr-сефароза), к которой присоединяют различные вещества – субстрат, кофермент, антиген, гормон и т.д. Метод позволяет одноэтапно получить высокоочищенный препарат белка.

Гель-фильтрация или метод молекулярных сит – широко применяется для очистки белков от примесей.

С помощью сефадекса (декстран, полисахарид микробного происхождения, обработанный для разделения белков) можно разделить белки с разной молекулярной массой, так как зерна сефадекса разных номеров имеют различного размера поры, в которые способны проникать белки с определенной молекулярной массой.

Метод электрофореза основан на различии в скорости движения белков в электрическом поле, которая определяется величиной заряда белка при определенных рН и ионной силе раствора. Первоначально метод разработан А. Тизелиусом, в последнее время широко применяется метод зонального электрофореза белков на различных носителях – на бумаге (целлюлозе), крахмале, в полиакриламидном геле. Метод диск-электрофореза в полиакриламидном геле позволяет получить до 50 фракций белков, т.е. имеет очень высокую разрешающую способность.

Изоэлектрическое фокусирование белков – на амфолинах позволяет выделить индивидуальные белки в препаративных количествах.

Ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы или хлорида цезия получило широкое применение для очистки, а также определения молекулярной массы белков по константе седиментации (единица Сведберга - S).

Очистка белка от низкомолекулярных примесей достигается методом диализа, гельфильтрации, кристаллизации, ультрафильтрации. При диализе применяют полупроницаемые мембраны (целлофан, коллоидиновая пленка), диаметр пор которой варьирует в широких пределах. Белки, как правило, через такую мембрану не диффундируют, а низкомолекулярные вещества легко проходят через нее в окружающую среду. Наилучшие результаты дают методы гельфильтрации и ультрафильтрации, т.к. дают возможность, как освободиться от низкомолекулярных компонентов, так и сконцентрировать белки.

Методы определения гомогенности белков. Наилучшие результаты дают ультрацентрифугирование в градиенте плотности, диск-электрофорез в полиакриламидном геле, иммунохимические методы.

Физико-химические свойства белков
Молекулярная масса белков колеблется в широких пределах: от нескольких тысяч дальтон (инсулин – 5700) до сотен миллионов (белок вируса гриппа – 322∙10⁶). Форма белковых молекул бывает глобулярная (шаровидная) и фибриллярная (нитевидная), рис.2.1.

Форма белковых молекул изменяется под влиянием различных факторов: рН, температуры среды, ионной силы, природы растворителя, концентрации раствора.


Рис. 2.1. Глобулярные и фибриллярные белки.