Болезнь Лайма у взрослых. Болезнь лайма у взрослых
 Скачать 1.14 Mb.
|
|
Иммуноферментный анализ (ИФА) Иммуноферментный анализ (ИФА), позволяющий обнаружить антитела к антигенам B. burgdorferi sensu lato является основным методом, применяемы в лабораторной диагностике клещевых боррелиозов. Особое значение в создании стандартизованных тест-систем, обладающих высокой диагностической эффективностью, имеет выбор антигенов, используемых в качестве иммуносорбента. Использование для ИФА очищенных антигенов боррелий, а также рекомбинантных антигенов обусловливает высокую степень специфичности теста. ИФА имеет некоторое преимущество перед НРИФ, заключающееся в большем ее уровне чувствительности и возможности объективной оценки полученных результатов. Вместе с этим, следует отметить, что ИФА выигрывая в чувствительности у нРИФ, проигрывает последней в специфичности. Таким образом, в настоящее время именно эти реакции (нРИФ и ИФА) являются методами выбора для первого этапа пошаговой серологической диагностике ЛБ. Непрямая реакция иммунофлуоресценции (нРИФ) Разработана и предложена в клиническую практику для диагностики клещевого боррелиоза одной из первых. 39 В ходе реакции специфические антитела регистрируются в виде комплексов (антиген + специфическое антитело + сыворотка против глобулинов человека меченная флуоресцином) которые фиксируются на корпускулярном антигене и светятся в ультрафиолетовых лучах. Для исследования пригодны: сыворотка крови, ликвор, внутрисуставная жидкость. Использование поливалентных (против всех классов иммуноглобулинов) или специфических (против определенных классов иммуноглобулинов) антисывороток меченых ФИТЦ позволяет определять как общее количество специфических антител, так и антител определенных классов. Одновременное применение меченых флуоресцином сывороток против IgG и IgM повышает частоту обнаружения специфических антител незначительно (на 2-3%). Чувствительность этой серологической реакции находится в пределах 40-50% при специфичности 96-98% (по некоторым данным до 80%). Данный уровень специфичности нРИФ позволяет принимать за положительный результат разведение сыворотки 1:40 и выше. В качестве антигенов для нРИФ можно применять различные геновиды боррелий, относящихся к комплексу B. burgdorferi s.I. В России наиболее широко используется корпускулярный антиген Ip21(B. afzelii) производства НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи. Получение положительных результатов нРИФ во многом зависит от сроков заболевания. В первые 2-4 недели болезни, у пациентов с МЭ, подтвердить диагноз серологически удается только у трети больных. В последующие 1-3 месяца - еще примерно у 30%. Таким образом, при исследовании парных сывороток больных и переболевших, взятых с интервалом не менее 30 дней, ретроспективно удается подтвердить ЛБ в 60-70% случаев. Диагноз безэритемной формы клещевого боррелиоза всегда требует лабораторного, в том числе и серологического, подтверждения, однако, учитывая особенности иммуногенеза при этом заболевании (отсроченное по времени нарастание титров антител), в ранние сроки заболевания (конец первого месяца) диагноз можно подтвердить приблизительно в 50% случаев протекающих без эритемы. Современная лабораторная (серологическая) диагностика болезни Лайма и интерпретация результатов исследований. Совершенствование серологического метода для диагностики ЛБ позволило в последнее время в большинстве стран мира перейти от принципа трех шагового лабораторного подтверждения диагноза: РНГА, ИФА (нРИФ), иммуноблоттинг; на двух шаговый – ИФА (НРИФ), иммуноблоттинг. Последняя комбинация двух тестов, как показывает опыт, вполне достаточна для серологической диагностики клещевого боррелиоза. Пошаговая серологическая диагностика болезни Лайма Первый этап – качественная и количественная оценка наличия специфических антител (нРИФ, ИФА) Результат положительный Результат отрицательный Переход ко второму этапу Окончание исследования (для окончательного исключения ранней стадии боррелиоза - повторное исследование по первому этапу через 3-4 недели после первого) Второй этап – определение специфичности IgG или IgM к определенным белкам боррелий (иммуноблоттинг) Результат положительный Результат неопределенный Результат отрицательный Подтверждение серологическое диагноза Повторное исследование через 1-2 недели после первого (не исключен ложный результат первого исследования) окончание исследования - ложный результат первого этапа 40 Метод иммунного блоттинга Для исключения возможных ложноположительных результатов первого этапа исследования, в качестве подтверждающего теста используют метод иммунного блоттинга с «нативными» цельноклеточными лизатами или рекомбинантными антигенами боррелий. Данный метод позволяет определить спектр специфических антител, синтезируемых у обследованного больного к различным антигенам боррелий. Иммуноблоттинг является более специфичным и информативным тестом, чем иммуноферментный метод. В то же время в классическом понимании боррелиозный иммуноблоттинг не является подтверждающим тестом по сравнению с В И Ч - и м м ун о бл от ом . Э т о с вя з а н о с о с л ож н о с т ь ю и н т е р п р е т а ции его результатов, поскольку не всегда возможно дифференцировать активную инфекцию от ранее перенесенной или дать четкий положительный ответ при раннем боррелиозе. Основными критериями отбора коммерческого иммуноблота для клинической диагностики клещевых боррелиозов являются удобство чтения и интерпретации результатов анализа, основанной на идентификации антител к различным антигенам. Метод иммуноблоттинга является скорее качественным, чем количественным, и не может быть использован для мониторинга эффективности проводимого лечения. При проведении серологической диагностики клещевых боррелиозов все образцы, показавшие при первичном тестировании положительные или сомнительные результаты, должны быть подтверждены в стандартизованном IgG и/или IgM иммуноблоте. Согласно рекомендациям Второй национальной конференции по серологической диагностике болезни Лайма и Center forDiseases Control (CDC) (США), результат иммуноблота для определения IgM считают положительным, если в нем выявляется две из трех полос антигенов: 24 kDa (OspC – молекулярный вес варьирует), 39 kDa (BmpA) и флагеллин – 41 kDa (Fla) . Для иммуноблота по выявлению IgG в положительном варианте ответа должны выявляться минимум пять из 10 полос, соответс- твующие следующим антигенам: 18 kDa, 21 kDa (OspC – молек у л я р н ы й в е с в а р ь и р у е т ) , 2 8 kDa, 3 0 kDa, 3 9 kDa ( B m p A ) , 4 1 kDa (Fla), 45 kDa, 58 kDa (не GroEL), 66 kDa и 93 kDa. В настоящее время считают, что некоторые из антигенов боррелий важны для детекции специфических IgG: Osp17, р21,p 3 9 , p 4 1 , p 6 6 , p 8 3 / 1 0 0 ( p 9 3 ) и з ш т а м м о в B . a f z e l i i ; p 1 4 , p 4 1 , p93 из штаммов B. garinii и OspA, OspC, p93 из штаммов B. burgdorferi sensu stricto. Наиболее часто специфические IgM в иммуноблоте обнаруживают к p18, OspC, p39, p41 из штаммов B. afzelii; p39, p41, p66, p83 из штаммов B. garinii и OspC, OspA из штаммов B. burgdorferi sensu stricto. Однако спектр антител к различным антигенам, выявленный в иммуноблоте, может варьировать в зависимости от стадии инфекции. В отдельных случаях, когда результаты иммуноблоттинга сомнительны, исследование следует повторить через 1-2 недели. Если пограничный или положительный результат первого этапа подтверждается вторым этапом, это означает, что серологически диагноз достоверен. По результатам иммуноблота, анализируя спектр имеющихся специфических антител к конкретным белкам боррелий, можно косвенно судить о стадии развития заболевания (ранние или поздние проявления Клещевого боррелиоза), а также о повторном заболевании или его рецидиве в пределах одного эпидсезона. Обнаружение специфических антител в ликворе и других биологических жидкостях У 60-90% больных с поражениями центральной нервной системы при боррелиозе специфические антитела могут определяться в ликворе. Однако их обнаружение не является решающим фактором для подтверждения боррелиозного поражения центральной нервной системы, поскольку антитела могут проникать в субарахноидальное пространство из крови. Для выяснения причастности боррелий в клинической симптоматике нарушений ЦНС необходимо выяснить наличие синтеза антител к боррелиям, обусловленное существующим патологическим процессом. При боррелиозном поражении нервной системы, 41 приблизительно в 60% случаев происходит местный синтез IgM и IgG глиальной тканью. Крайне редко в цереброспинальной жидкости у больных с ЛБ обнаруживается изолированное продуцирование IgM. Для выявления специфических антител в ликворе обычно используют НРИФ или ИФА, но предпочтение отдается методу иммуноблоттинга. Количество антител в субарахноидальном пространстве зависит от их величины в сыворотке крови, проницаемости гематоэнцефалического барьера и пропорции интратекального синтеза. Относительное увеличение концентрации специфических иммуноглобулинов в центральной нервной системе при боррелиозе (интратекальный синтез антител) можно определить путем вычисления ликвор-сывороточного индекса (ЛСИ). Для этой цели определяется относительная концентрация (в титрах) специфических иммуноглобулинов (или иммуноглобулинов отдельных классов) и общих иммуноглобулинов (г/л) в сыворотке крови и ликворе. На практике бывает достаточным определение только иммуноглобулинов класса G. Следует отметить, что забор материала (ликвора и крови) следует проводить в один день. Расчет ликвор-сывороточного индекса (ЛСИ) проводится по формуле: ЛСИ = специфические IgG (ликвор) х общие IgG (сыворотка) общие IgG (ликвор) х специфические IgG (сыворотка) При использовании нРИФ в качестве метода определения специфических антител, показатели индекса больше 4 считаются положительными и свидетельствуют о наличии в центральной нервной системе интратекального синтеза антител к боррелиям. Показатели индекса меньше 2 расцениваются как отрицательные. Значения между 2 и 3 - пограничные величины индекса. При использовании метода ИФА - значения больше 2 расцениваются как положительные, а 1,5-2 - пограничные значения. Иммуноблоттинг может использоваться в тех случаях, когда наблюдается выравнивание концентраций специфических антител в ликворе и сыворотке крови. Определение широкого спектра антител в ликворе, специфичных к разным белкам боррелий, при отсутствии некоторых из них при исследовании сыворотки крови свидетельствует о преимущественно интратекальном синтезе антител. Безусловно, при клещевом боррелиозе, серологические исследований ликвора должны всегда оцениваться совместно с результатами других исследований цереброспинальной жидкости (цитологических, биохимических и т.д.). Подобный подход можно использовать у больных боррелиозе с поражением других органов и систем, например при поражениях опорно-двигательного аппарата (исследование внутрисуставной жидкости). Интерпретация результатов серологической диагностики болезни Лайма Лабораторная (микробиологическая) диагностика боррелиоза, в том числе и серологическая диагностика преследует несколько целей: верификация боррелиозной инфекции; первичное или повторное заболевание в пределах одного эпидсезона (рецидив заболевания или повторное заражение); определение длительности заболевания и активности инфекционного процесса (при хроническом течении); установление этиологического диагноза (определение геновида боррелий). Из всех серологических диагностических тестов, только иммуноблоттинг может дать наиболее исчерпывающие ответы на выше поставленные вопросы. Именно с помощью данного исследования имеется возможность выявить специфические антитела к определенным белкам боррелий. Выявление IgM, а также IgG к флагеллину (р41 и его фракции p41i), OspC свидетельствуют об относительно небольшом промежутке времени, 42 прошедшим с момента инфицирования (ранняя стадия ЛБ). Выявление широкого спектра антител к антигенам (p83/100, p75, Oms66/p66, OspA, BmpA/p39, p18, p21) позволяет сделать заключение о достаточно продолжительном периоде времени, прошедшим с момента инфицирования (даже в случаях бессимптомного течения заболевания). В случаях, когда после проведенного лечения и выписки пациента из стационара, у него вновь выявляются признаки клещевого боррелиоза, на фоне повышенного содержания IgM и IgG (к флагеллину), то это следует расценивать как случаи повторного заражения. Данный метод позволяет провести дифференциальную диагностику между антительным ответом на специфичные и неспецифичные белки боррелий. С помощью данного метода невозможно идентифицировать геновид боррелий, которым обусловлены особенности клинической картины заболевания. Всегда следует помнить о возможности получения в серологических тестах ложноотрицательных или ложноположительных результатов исследования. Ложноотрицательные результаты серологических исследований могут наблюдаться у пациентов с проявлениями иммунодепрессивных состояний (неопластические процессы, СПИД и др.), а также на ранних стадиях клещевого боррелиоза. Использование диагностических тест-систем, основу которых составляет ограниченный набор антигенов (например, только OspA), может привести к ситуации, когда отрицательный результат исследования обусловлен тем, что иммунная система человека просто не продуцирует против этих антигенов специфические антитела, поскольку у боррелий, персистирующих в организме человека, эти белки отсутствуют. Ложноположительные результаты в серологических исследованиях возможны из-за “эффекта перекреста” при наличии у пациентов других (инфекционных и неинфекционных) заболеваний. Например, у больных трепанематозами (возбудители T. pallidum и T. phagedenis) и другими спирохетозами (возбудители клещевого возвратного тифа: B. persica, B. hermsii, B. duttoni и др.), т. к. вышеуказанные микроорганизмы имеют многие сходные антигенные детерминанты с таковыми у возбудителей боррелиоза. Для исключения подобных ошибок, перед исследованием следует проводить “истощение” сыворотки антигенами этих спирохет. Ложноположительные реакции могут регистрироваться у больных с ревматоидным артритом, системными заболеваниями соединительной ткани, при неопластических процессах. Использование технологии “истощения” (предварительная адсорбция ревматоидного фактора) позволяет значительно снизить вероятность получения ложных результатов. Неопределенные (сомнительные) результаты реакций возможны при взаимодействии некоторых низкоспецифичных белков боррелий (p66, p75) с антителами к поверхностным белкам многих грам-отрицательных (Y. enterocolitica O:3, E. coli, C. jejuni, N. meningitidis, H. influenze) и грамположительных бактерий (пневмококки, стафилококки) и даже микобактерий туберкулеза. Сомнительные результаты серологических исследований могут наблюдаться при некоторых вирусных заболеваниях (цитомегаловирусная инфекция, Эпштейна-Барр вирусная инфекция) в результате поликлональной активации В-лимфоцитов. Следует особо подчеркнуть, что в случаях, когда у пациентов, при неоднократных исследованиях, постоянно обнаруживаются повышенные титры IgM (без сероконверсии), то это следует расценивать как ложноположительный результат. Причины этого явления часто остаются невыясненными. Следует помнить, что переоценка диагностической значимости лабораторных тестов, без учета клинической картины заболевания, может явиться причиной гипердиагностики клещевого боррелиоза, что в свою очередь может привести к комплексу лечебно- диагностических ошибок. Другие лабораторные методы диагностики и некоторые изменения в показателях функционирования органов и систем при болезни Лайма 43 Среди неспецифических показателей воспаления, повышение значений которых обнаруживается в крови при боррелиозе, можно выделить СРБ, сиаловые кислоты, ЦИК. Лейкоцитоз и повышенный уровень общих и специфических IgM, а также некоторые компоненты системы комплемента (С3 и С4) обнаруживается достаточно редко. Свободные иммунные комплексы обнаруживаются у 60% больных с бессимптомным течением боррелиоза, а также при других болезнях (например, коллагенозы). Все же, несмотря на относительную специфичность выявления ЦИК при боррелиозе исследование их необходимо, т.к. они исчезают на фоне проводимого лечения и могут сохраняться при развитии поздних проявлений боррелиоза после МЭ. Также доказано, что боррелиозные антитела могут циркулировать в крови и вне связи с иммунными комплексами, причем наблюдается это не так уж и редко. Свидетельством поражения печени и поджелудочной железы при боррелиозе может быть обнаружение увеличения их размеров и повышение уровня ферментов, что наблюдается примерно в 5-30% и 10-15% соответственно. Тяжелых гепатитов не наблюдается, хотя повышение печеночных трансаминаз может быть в 100 раз больше нормальных величин. Иногда может наблюдаться микрогематурия, которая, как правило, связана с умеренной протеинурией и отражает степень выраженности общеинфекционного синдрома. Креатинин и мочевина в сыворотке крови обычно не повышается. Особенностью поражений сердца при боррелиозе является отсутствие повышения креатинкиназы. 4.9 Инструментальная диагностика 4.9.1 Методы инструментальной диагностики Метод Показания Сила* Электроэнцефалография (ЭЭГ) Пациенты с клиническими симптомами клещевого боррелиоза при наличии очаговой неврологической симптоматики, с судорожным синдромом С Магнитно-резонансная томография головного мозга Пациенты с клиническими симптомами ЛБ при поражении центральной нервной системы С Компьютерная томография головного мозга Пациенты с поражением нервной системы у пациентов с ЛБ С Электрокардиограмма (ЭКГ) Пациенты с клиническими симптомами клещевого боррелиоза С Эхокардиография (Эхо- КГ) Пациенты с клиническими симптомами ЛБ при поражении сердечно-сосудистой системы С Ультразвуковое исследование суставов (УЗИ суставов) Пациенты с клиническими симптомами ЛБ при поражении опорно-двигательного аппарата С Рентгенография суставов Пациенты с клиническими симптомами ЛБ при поражении опорно-двигательного аппарата С Электронейромиография (ЭНМГ) Пациенты с клиническими симптомами ЛБ при поражении нервной системы С Холтеровское мониторирование Пациенты с клиническими симптомами ЛБ при поражении сердечно-сосудистой системы С 44 Офтальмоскопия Пациенты с клиническими симптомами ЛБ при поражении органа зрения С Сцинтиграфия суставов Пациенты с клиническими симптомами ЛБ при поражении опорно-двигательного аппарата С Ультразвуковое исследование (УЗИ) органов брюшной полости Дифференциальная диагностика с другими клещевыми инфекциями, соматической патологией С Для выявления поражений сердца при болезни Лайма нельзя отказаться от обычной ЭКГ, как одного из показательных методов обнаружения нарушений со стороны сердца. ЭКГ проводится в динамике. При выявлении атриовентрикулярной блокады показан кардиомониторный контроль в течение всего курса антибактериальной терапии. В случаях боррелиозных артритов для подтверждения наличия воспалительных и деструктивных изменений суставов выполняется рентгенологическое исследование пораженных суставов. При подозрении на поражение нервной системы проведение нейрофизиологических исследований (электромиография, электронейрография) помогает выявлять многоочаговый характер вовлечения в патологический процесс периферического и центрального звеньев нервной систем. Кроме того, нейрофизиологические методы могут использоваться для прогноза течения болезни. Наиболее предпочтительным методом является магнитно-резонансная томография, которая примерно в 2,5 раза более показательна, чем компьютерная томография. МРТ позволяет выявить изменения воспалительного характера спинного мозга, стволовых структур, белого или серого вещества головного мозга и даже проявления васкулита. |