Глик Молекулярная биотехнология. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер с англ. М. Мир, 2002. 589 с

• Название: Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер с англ. М. Мир, 2002. 589 с
• Анкор: Глик Молекулярная биотехнология.doc
• Дата: 28.01.2017
• Размер: 9.74 Mb.
• Имя файла: Глик Молекулярная биотехнология.doc
• Тип: Документы; #189
• страница: 31 из 88

Моноклональные антитела человека

Несмотря на кажущуюся перспективность иммунотерапии, этот метод имеет и ряд ограничений, связанных с применением моноклональных антител животных и процедурой присоединения к ним нужных молекул. Сам процесс химического присоединения весьма неэффективен, присоединение происходит случайным образом, а кроме того, при этом может снижаться ферментативная активность активатора плазминогена или других веществ, используемых в терапии. И наконец, если предполагается многократное введение препарата, необходимо использовать антитела человека, а не животных, чтобы предотвратить возникновение перекрестных иммунных реакций и сенсибилизацию пациента.

Создание специфических антител, не вызывающих перекрестных реакций, представляет собой довольно трудную задачу, поскольку получение антител человека путем традиционной гибридомной технологии сталкивается с рядом проблем.

•   Хромосомы человека в клетках, полученных слиянием лимфоцитов человека с клетками мисломы мыши, нестабильны, поэтому трудно получить клетки, способные вырабатывать моноклональные антитела человека.

•   Пока не удалось получить эффективные клеточные линии миеломы человека, которые могли бы заменить мышиные.

•   Иммунизация человека различными антигенами не проводится по соображениям этического характера.

Таким образом, для получения антител человека необходимо разрабатывать другие подходы.

В одной из схем B-лимфоциты человека, активно продуцирующие специфические антитела, обработали флуоресцентно меченным антигеном, затем с помощью клеточного сортера провели обогащение образца В-лимфоцитами, вырабатывающими эти антитела. Поскольку В-клетки плохо растут в культуре, для улучшения роста их трансформировали вирусом Эпштейна—Барр. Некоторые клоны трансформированных В-кле-

Микробиологическое производство лекарственных средств           215

Полипептид, обладающий действием лейкоцитарного интерферона человека, синтезируется в Е. coli.

S. Nagata, H, Taira, A. Hall, L. Johnsrud, M. Streuli, J. Ecsödi, W. Boll, K. Cantell, C. Weissmann Nature 284: 316-320, 1980

В конце 70-х— начале 80-х гг. молекулярная    биотехнология    стала Привлекать к себе внимание общественности и крупных инвесторов. Одним   из   биотехнологических продуктов был интерферон, на который в то время возлагали надежды как на чудодейственное средство против множества вирусных заболеваний и рака. О выделении кДНК интерферона человека и его последующей экспрессии в Escherichia coli сообщали газеты и журналы всего мира. Некоторые особенности интерферона сделали выделение его кДНК особенно сложным.  Во-	первых, несмотря на то что интерферон был очищен более чем в 80 000 раз, его удавалось получать лишь в очень небольших количествах, поэтому в то время не  была  известна  его точная мол. масса. Во-вторых, в отличие от многих белков интерферон не обладает легко идентифицируемой  химической   или биологической активностью: ее оценивали только по снижению цитопатического действия вируса животных на культуру клеток, а это сложный и длительный    процесс.    В-третьих,    в отличие от инсулина было неиз-		вестно, есть ли клетки человека, способные вырабатывать интерферон в достаточно больших количествах, т, е. существует ли источник    мРНК    интерферона. Несмотря на все эти трудности, в конце концов была выделена и охарактеризована кДНК, кодирующая интерферон. С тех пор было обнаружено несколько разных типов интерферонов. Были выделены гены нескольких интерферонов и показана их эффективность при лечении различных вирусных заболеваний, но, к сожалению,  интерферон  не стал панацеей.

ток вырабатывают моноклональные антитела человека, взаимодействующие с селектирующим антигеном. К сожалению, выход моноклональных антител был очень небольшим и они обладали низкой антиген связывающей активностью. К тому же вероятность того, что в неиммунизированном организме найдутся секретирующие антитела клетки, которые будут распознавать селектирующий антиген, очень мала.

Еще один подход заключается во введении иммунных клеток человека мутантным мышам, которые практически лишены собственной иммунной системы. После трансплантации иммунных стволовых клеток человека таким мышам, страдающим тяжелым сочетанным иммунодефицитом (scid-мыши), они приобретают клетки иммунной системы человека и в ответ на введение антигена могут вырабатывать антитела человека.

Предпринимаются попытки ввести зародышам мышей гены иммуноглобулинов человека с целью создания транс генных мышей, которые в ответ на иммунизацию конкретным антигеном смогут вырабатывать иммуноглобулины человека. Чтобы получить от трансгенных животных клетки, секретирующие специфические моноклональные антитела, можно использовать стандартную гибридомную технологию, затем провести скрининг таких положительных клеточных линий и определить, какие из них вырабатывают антитела, кодируемые генами иммуноглобулинов человека. Недавно появилось сообщение о том, что уже получена трансгенная мышь, экспрессирующая нативные формы Н- и L-цепей иммуноглобулинов человека.

Трансплантация стволовых клеток иммунной системы человека scid-мышам и получение линий трансгенных мышей — весьма трудоемкие способы производства моноклональных антител человека. Поэтому ученые пытаются создать генноинженерные методы получения антител человека, которые можно использовать в качестве терапевтических средств, и эффективных бифункциональных белков, способных связываться с мишенью и разрушать ее.

Гибридные моноклональные антитела человека и мыши

Тот факт, что разные участки молекулы иммуноглобулина выполняют разные функции, позволяет модифицировать моноклональное антитело

216             ГЛАВА 10
мыши таким образом, что оно приобретает некоторые сегменты антитела человека, сохраняя в то же время свою исходную антигенсвязывающую специфичность. Такое гибридное антитело называют химерным. Первым участком моноклонального антитела мыши, который был заменен соответствующим участком антитела человека, был Fc-фрагмент. Выбор объяснялся тем, что Fc-фрагмент антитела мыши выполнял роль эффектора иммунного ответа у человека недостаточно хорошо; кроме того, он с большой вероятностью индуцировал образование антител в организме человека. Чтобы снизить иммуногенность и усилить эффекторные функции, провели замену последовательностей ДНК, кодирующих Fv-области L- и Η-цепей иммуноглобулина человека, на аналогичные фрагменты специфического моноклонального антитела мыши (рис. 10.9). Такую замену можно осуществить разными путями: реплицировать ДНК in vitro с применением олигонуклеотидов в качестве затравки либо использовать субклониро-ванные фрагменты ДНК. Сегменты ДНК, кодирующие химерные цепи, встраивали в экспрессирующий вектор и вводили в культуру В-лимфоцитов, из которой выделяли наработанные антитела.

Химерные антитела, несущие антигенсвязы-вающий участок моноклонального антитела мыши к поверхностному антигену клеток рака толстой кишки человека, тестировали на больных с раком толстой и прямой кишки. Антитела оставались в кровотоке примерно в шесть раз дольше обычных антител мыши, тем самым оказывая свое действие в течение большего времени. При этом лишь у одного пациента из 10 наблюдался слабо выраженный иммунный ответ. К сожалению, в этих испытаниях не удалось получить противоопухолевого эффекта антител; возможно, это было связано с введением их в слишком малых дозах или с тем, что раковый процесс находился на поздних стадиях. В опытах in vitro химерные антитела проявляли высокую эффекторную активность, что позволяет надеяться на успешное их применение в других случаях.

Конструирование химерных молекул, о которых шла речь выше, — это первый этап в создании моноклональных антител мышей и крыс, обладающих сходством с антителами человека. Другой подход состоит в замещении только CDR-участков человеческих антител фрагмента-

Рис. 10.9. Полученное методом генной инженерии антитело, сходное по своей структуре с антителом человека. Участки генов L- и Η-цепей иммуноглобулина человека,  кодирующие  VL- и  vh -домены,  заменены последовательностями ДНК, кодирующими VL- и VH-домены иммуноглобулина мыши. Продуктом рекомбинантных генов является химерный иммуноглобулин, обладающий антигенсвязывающей   специфичностью моноклонального антитела  мыши, эффекторными свойствами Fc-фрагмента иммуноглобулина человека и пониженной иммуногенностью для человека.

Микробиологическое производство лекарственных средств           217

Рис. 10.10. Полученное методом генной инженерии антитело, сходное по своей структуре с антителом человека. Сегменты ДНК, кодирующие CDR-участки (CDR1, CDR2 и CDR3) антитела человека, заменены на последовательности, кодирующие CDR-участки Н- и L-цепей иммуноглобулина мыши. Продуктом   этого   рекомбинантного гена является иммуноглобулин с антигене вязы вающей  специфичностью моноклонапьного антитела мыши (участки, выделенные розовым цветом) и остальными свойствами антитела человека (участки,  выделенные голубым цветом).

ми моноклональных антител грызунов (рис. 10.10). Такие «восстановившие форму» антитела человека могут стать эффективным терапевтическим средством, поскольку они по своей антигенсвязывающей способности приближены к исходным моноклональным антителам грызунов.

Моноклональные антитела грызунов, сходные с антителами человека, можно получить, выделив кДНК L- и H-цепей из клеточной линии гиб p ид омы грызунов и амплифицировав их вариабельные области с помощью ΠЦР. В качестве праймеров для амплификации можно использовать олигонуклеотиды, комплементарные высококонсервативным сегментам ДНК, фланкирующим с 5'- и 3’-концов последовательность, кодирующую вариабельную область. Зная нуклеотидные последовательности кДНК вариабельных областей легкой и тяжелой цепей (V_L и V_H), легко определить границы CDR, основываясь на том, что соответствующие им последовательности гипервариабельны, в то время как каркасные области относительно консервативны. Исходя из данных о нуклеотидных последовательностях ДНК, кодирующих CDR грызунов, синтезировали шесть пар олигонуклеотидных праймеров. Каждая пара инициировала синтез ДНК, кодирующей одну из шести CDR грызунов: три, локализованных на L-цепи, и три — на Η-цепи. Кроме того, на 5'-конце каждого прай-мера находилось 12 дополнительных нуклеотидов, комплементарных фланкирующим последовательностям каркасных участков ДНК человека, по которым происходило встраивание CDR-ДНК грызунов (рис. 10.11). Далее с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза осуществляли последовательную замену CDR-ДНК человека амплифицированной CDR-ДНК грызунов — фактическую «пересадку» CDR от грызунов в каркасные участки молекулы антитела человека. Модифицированную таким образом кДНК антител встраивали в векторы экспрессии и трансформировали ими подходящие клетки-хозяева, обычно Е. coltили клетки млекопитающих, в которых и вырабатывались антитела.

Данный метод предполагает, что за антигенсвязывающую способность антитела отвечают только CDR-участки, а не каркасные области. Однако, если связывание «гибридного» антитела с антигеном происходит недостаточно эффективно, может возникнуть необходимость в замене некоторых аминокислот в каркасных областях с помощью олигонуклеотид-направленного мутагенеза.

К настоящему времени этим методом получено более 50 различных моноклональных антител, обладающих сходством с антителами человека. К сожалению, данная технология, являясь весьма эффективной и универсальной, довольно дорогостоящая и требует больших затрат вре-

218            ГЛАВА 10

Рис. 10.11. ПЦР-амплификация CDRl-участка, входящего в состав кДНК L-цепи моноклонального антитела грызуна. Олигонуклеотидные праймеры Р1 и Р2 комплементарны последовательностям ДНК CDRl-участка антитела грызуна. Кроме того, каждый праймер содержит на 5'-конце 12 нуклеотидов, комплементарных каркасным участкам (framework region, FR) кДНК L-цепи антитела человека. Используя шесть пар олигонуклеотидных праймеров — три для VL- и три для Vн-областей, — с помощью ПЦР амплифицировали отдельно каждый из ДНК-сегментов, кодирующих CDR-участки антитела грызуна. Затем, используя олигонуклеотид-направленный мутагенез, заменили ими соответствующие сегменты генов антитела человека. Такая замена оказалась возможной благодаря тому, что амплифицированные фрагменты содержали участки, комплементарные каркасным областям гена антитела человека.

мени. Возможно, более предпочтительным способом получения антител человека и их фрагментов окажется метод, основанный на использовании фаговых «комбинаторных» библиотек, созданных на основе мРНК, полученной из В-клеток неиммунизированных доноров.

Производство антител с помощью Е. соli

Гибридомы, подобно большинству других клеточных культур животных, растут относительно медленно, не достигают высокой плотности и требуют сложных и дорогих сред. Получаемые таким образом моноклональные антитела очень дороги, что не позволяет широко использовать их в клинике. Чтобы решить эту проблему, были предприняты попытки создания своего рода «биореакторов" на основе генетически модифицированных бактерий, растений и животных. Для эффективной доставки и функционирования некоторых иммунотерапевтических средств зачастую достаточно одной антигенсвязывающей области антитела (Fab- или Fv-фрагмента), т. е. присутствие Fc-фрагмента антитела необязательно.

На рис. 10.12 представлена методика получения функциональных антител с помощью E. coli (рис. 10.12).

1.   Используя мРНК, выделенную из вырабатывающих антитела клеток (В-лимфоцитов) мыши или человека, синтезируют кДНК.

2.   Проводят раздельную ПЦР-амплифицикацию кДНК, кодирующих Н- и L-цепи.

3.  Амплифицированные кДНК обрабатывают специфическими рестрицирующими эндонуклеазами, а затем встраивают в вектор на основе бактериофага λ. кДНК Н- и L-цепей содержат разные, характерные для каждой из них эндонуклеазные сайты, что облегчает специфическое встраивание каждой нуклеотидной последовательности в свой вектор. На этом этапе происходит клонирование множества разных сегментов Н- и L-цепей (рис. 10.13, А и Е).

4.   кДНК одной Н- и одной L-цепи встраивают в общий «комбинаторный» вектор, так что в бактериофаге синтезируются обе цепи и образуется   «полноценный»    Fv-фрагмент (рис. 10.13,5).

Синтез Н- и L-цепей происходит во время литического цикла бактериофага λ, поэтому можно провести скрининг библиотеки клонов комбинаторных бактериофагов с целью определения их антигенсвязывающей активности.

Микробиологическое производство лекарственных средств           219

Рис. 10.12. Создание с помощью Е. соli комбинаторной библиотеки кДНК VL- и Vн-областей антитела.

На этапе соединения кДНК Н- и L-цепей в одном векторе образуется широкий спектр генов различных антител. Некоторые из них кодируют уникальные сайты связывания, получить которые с помощью обычной гибридомной технологии было бы невозможно. Пул антител млекопитающих включает 10⁶—10⁸ разных антител. Фаговая библиотека содержит примерно столько же клонов, поэтому можно ожидать, что одна комбинаторная библиотека будет вырабатывать такое же количество различных антител (Fv-молекул), как любое млекопитающее. Кроме того, однажды создав исходную комбинаторную библиотеку, можно комбинировать L- и Η-цепи и получать Fv-фрагменты, распознающие необычные эпитопы. Еще большего разнообразия можно достичь, используя неспецифический мутагенез. Поскольку за относительно короткое время можно провести скрининг миллионов фаговых бляшек, идентификация Fv-фрагментов с нужной специфичностью занимает от 7 до 14 дней. Для сравнения: скрининг нескольких сотен гибридомных клеточных линий обычно занимает месяцы.

Векторы на основе бактериофага λ не очень пригодны для получения больших количеств белковых молекул. Чтобы решить эту проблему, сконструировали такой вектор, в котором ДНК Н-и L-цепей встраиваются в сайт, фланкированный плазмидной ДНК. Такую плазмиду, содержащую ДНК Н- и L-цепи, можно вырезать из вектора и трансформировать ею E. coli (рис. 10.12). Являясь частью плазмиды, ДНК Fv-фрагментов будет многократно реплицироваться в клетках Е. colicобразованием большого количества продукта, который можно использовать как в диагностических, таки в терапевтических целях.

При создании комбинаторных библиотек вместо фага λ можно использовать нитевидные бактериофаги М13 или fd (рис. 10.14). В этих случаях соответствующий фрагмент антитела синтезируется как часть химерного белка, локализованного на поверхности фаговой частицы. Скрининг комбинаторной библиотеки фрагментов антител можно провести при помощи ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA). Суть метода состоит в следующем: образцы (аликвоты) из библиотеки помещают в ячейки планшеты, содержащие антиген-мишень. Ячейки промывают, чтобы удалить несвязанные фаговые частицы. В каждую ячейку вносят конъюгат, состоящий из антитела, связывающегося с белком фаговой оболочки, и фермента. Ячейки промывают для удаления несвязанного конъюгата и добавляют в каждую из них хромогенный субстрат, который расщепляется ферментом, связанным с фагом, и окраши-

220             ГЛАВА 10

Рис. 10.13. Сконструированные участки ДНК из комбинаторной библиотеки кДНК Fv-фрагмента, клонированные в бактериофаг а. А и Б. Фрагменты ДНК L-(A) и Н-(Б) цепей раздельно встроили в векторы на основе бактериофага а. В. Провели рестрикцию каждой EcoRl- библиотеки и лигировали фрагменты ДНК из библиотеки Η-цепи с фрагментами ДНК из библиотеки L-цепи, в результате чего получили комбинаторную библиотеку, содержащую все возможные сочетания фрагментов L- и H -цепей с экспрессией соединенного фрагмента в одном векторе. pLac — laс-промотор Е. соli, ССР - сайт связывания с рибосомой.

вает те ячейки, в которых находятся фаговые частицы, несущие антитела к антигену-мишени. Процесс отбора и последующая очистка бактериофагов, синтезирующих фрагмент антитела, специфичный к нужному антигену, в этом случае гораздо проще, чем тогда, когда проводится подсчет бляшек бактериофага λ. Выделив фаг, синтезирующий желаемый фрагмент антитела, можно экстрагировать кодирующую этот фрагмент ДНК и субклонировать ее в экспрессирующем векторе. Разные варианты антител с повышенным сродством к антигену-мишени можно получать замещением фрагментов ДНК v_l- и V_н-областей или с помощью неспецифического мутагенеза.

Разработав методы получения Fv-фрагментов, исследователи попытались определить, способна ли отдельная белковая цепочка, состоящая только из V_L-и V_н-доменов, образовать функциональную молекулу, связывающую антиген. Компьютерное моделирование трехмерной структуры предполагаемого одноцепочечного антитела показало, что для образования конформации, необходимой для связывания антигена, V_L- и V_н-домены должны быть разделены линкерным пептидом. Имея это в виду, V_L- и V_Н-ДНК, синтезированные на кДНК-матрице клонированного моноклонального антитела, присоединили к химически синтезированному ДНК-линкеру, создав конструкцию V_L-ДНК—линкер—V_Н-ДНК. Соответствующий одноцепочечный белок синтезировали в Е. coli, очистили и обнаружили, что его сродство и специфичность к антигену сходны с таковыми ин-тактного моноклонального антитела. Таким образом, с помощью Е. coli можно без труда получать функциональные одноцепочечные антитела.

Одноцепочечные антитела могут найти широкое применение в клинике в тех случаях, когда проявление Fc-эффекторных функций не является необходимым, а малый размер молекулы (мол. масса одноцепочечного антитела составляет примерно 27 кДа, а иммуноглобулина G — 150 кДа) дает определенные преимущества. Кроме того, к одноцепочечному антителу можно присоединить последовательность, кодирующую тот или иной белок, получив бифункциональную молекулу, которая сможет связываться с определенной мишенью, проявляя при этом специфическую активность.

Микробиологическое производство лекарственных средств            221

Рис. 10.14. Создание комбинаторной библиотеки кДНК Fv-фрагментов антител с помощью нитевидного бактериофага М13. кДНК VL-  и VH-областей амплифицировали методом ПЦР, а затем лигировали. используя ДНК короткого линкерного пептида.  Полученные фрагменты ДНК, составляющие комбинаторную        библиотеку кДНК одноцепочечных антител, встроили в геном фага М13 с присоединением их к фаговому гену 3, который кодирует поверхностный фаговый белок. В М13 с гена 3 синтезируется три белковых молекулы, поэтому каждый рекомбинантный фаг M 13, содержащий комбинаторную библиотеку кДНК одноцепочечных антител, будет нести три    молекулы    химерного белка, состоящего из продуктa гена 3 и одно цепочечного антитела.

Был проведен также еще один эксперимент: вместо того чтобы соединять V_L- и V_н-цепи коротким пептидом, аминокислоты каркасной области модифицировали таким образом, чтобы между ними образовывался дисульфидный мостик. Эффективность такой стабилизированной дисульфидной связью fv-молекулы, связанной с токсином, разрушающим раковые клетки, сравнили с эффективностью одноцепочечной Fv-молекулы, связанной с тем же токсином (рис. 10.15). Обнаружилось, что стабилизированный дисульфидной связью и одноцепочечный Fv-иммунотоксины обладают одинаковой активностью и специфичностью, но первый в несколько раз стабильнее. Можно предположить, что в каких-то ситуациях стабилизированные Fv-молекулы могут оказаться предпочтительнее одноцепочечных Fv-молекул.

Рис. 10.15. Схематическое изображение одноцепочечного Fv-иммунотоксина (А) и Fv-иммунотоксина, стабилизированного дисульфидной связью (Б).

222             ГЛАВА 10

Лекарственные средства против ВИЧ

Ученым пока не удалось получить вакцину, достаточно эффективную против вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), который вызывает развитие синдрома приобретенного иммунодефицита (СПИД). Параллельно с созданием такой вакцины идет поиск других средств, позволяющих замедлить патологический процесс.

ВИЧ поражает один из видов лимфоцитов, а именно Т-хелперы (Т_н-клетки). В норме в процессе развития иммунного ответа Т_н-клетки связывают продукты деградации специфических антигенов и высвобождают факторы, стимулирующие другие клетки иммунной системы к участию в иммунном ответе. Т_н-клетки играют в этом процессе ключевую роль, а при ВИЧ-инфекции они перестают функционировать. Как только вирус внедряется в Т_н-клетку, он становится защищенным от иммунной системы организма и начинает оказывать свое разрушающее действие на Т_н-клетки.

•   В результате размножения вируса в инфицированной клетке происходит ее лизис.

•   Пораженная клетка действует как фабрика по      производству      ВИЧ-гликопротеина (gpl20), который вызывает разрушение Т_н-клеток и других Т-лимфоцитов.

•   Пораженная клетка сливается с другими Т_н-клетками, формируя синцитий, который не способен выполнять функции, свойственные индивидуальным Т_н-клеткам.

Основным следствием ВИЧ инфекции явля ется неспособность иммунной системы организма обеспечивать его защиту от обычных бактериальных и вирусных инфекций, которые в конце концов приводят к гибели больного, несмотря на лечение антибиотиками и другими средствами.

На первом этапе ВИЧ-инфекции происходит взаимодействие между гликопротеином оболочки вируса мол. массой 120 кДа (gpl20) и рецептором на поверхности Т_н-клеток — CD4 (рис. 10.l6, A). In vitro поражение t_h-клеток блокируется антителами к СЕМ; процесс замедляется также при избытке свободного белка CD4. Однако ни один из этих способов не приводит к

Рис. 10.16. ВИЧ-инфекция и ее терапия, А. Связывание ВИЧ с Тн-клеткой опосредуется контактированием вирусного белка gp120 с Тн-клеточным поверхностным    белком    CD4.     Б.     На     поверхности ВИЧ-инфицированной    клетки   находится   белок gp120, с которым может связываться свободный химерный комплекс С D4— токсин. Попав внутрь инфицированной клетки, токсиновая часть химерной молекулы убивает ее.

уничтожению вируса. Один из подходов, обеспечивающих как защиту Т_н-клеток, так и инактивацию вируса, заключается в создании химерного белка, состоящего из фрагмента молекулы CD4 и Fc-фрагмента иммуноглобулина. Свойства этого белка, называемого СВ4-иммуноад-гезином, определяются составными частями его молекулы: СD4-компонент связывает gp120 и блокирует ВИЧ, а иммуноглобулиновый обеспечивает замедление разрушения молекулы в плазме и ее связывание с клетками, несущими

Микробиологическое производство лекарственных средств           223
рецептор к антителу. После присоединения СD4-иммуноадгезина к свободной вирусной частице или к инфицированной клетке запускается реакция опосредованной антителами клеточной цитотоксичности, которая обеспечивает уничтожение вируса или пораженной им клетки.

Другой подход, позволяющий контролировать развитие ВИЧ-инфекции, заключается в создании системы мечения ВИЧ-пораженных клеток для их специфического уничтожения. Например, если сшить два фрагмента ДНК, один из которых кодирует рецептор CD4, а другой — внутриклеточный токсин Pseitdomonas(экзотоксин А), то мы получим ген, кодирующий химерный белок с комбинированными свойствами (рис. 10.17). Экзотоксин A Pseudomonas -это белок с мол. массой 66 кДа, состоящий из трех доменов: домен I отвечает за связывание с клеткой, II — за проникновение белка в клетку, III — за присоединение ADP-рибозы к эукарио-тическому фактору элонгации (EF-2), что приводит к его инактивации. Химерный белок CD4—экзотоксин A Pseudomonasвместо домена I содержит большую часть последовательности CD4 (рис. 10.17), в результате чего обладает и цитотоксической активностью экзотоксина Pseudomonas, и gp120-связывающей активностью CD4. На поверхности всех ВИЧ-поражен-ных клеток находится гликопротеин gp120, поэтому СD4-домен химерного белка соединяется исключительно с этими клетками. Присоединившись к инфицированной клетке, химерный белок проникает внутрь нее при участии домена II экзотоксина A Pseudomonas. Затем экзотоксиновая часть химерного белка инактивирует фактор элонгации EF-2, участвующий в синтезе белка. Это препятствует дальнейшему синтезу белка, что в конце концов приводит к гибели клетки. Таким образом, CD4-домен «помечает» ВИЧ-пораженные клетки, а экзотоксин выступает в роли «наемного убийцы».

Синтезируясь в Е. coli, химерный белок образует нерастворимые цитоплазматические включения. Их растворяют в гуанидингидрохлориде и выделяют с помощью быстрого разведения и анион-обменной хроматографии. Полученный таким образом белок с успехом выдержал проверку в контрольной культуре клеток. Однако в организме человека на Рsеиdотопаs-компонент химерного белка может возникнуть иммунная реакция, и не исключено, что его придется вводить вместе с каким-либо иммуносупрессантом, например циклоспорином. Нужно иметь в виду, что описанный выше способ борьбы с ВИЧ-инфекцией находится на начальной стадии разработки, хотя в будущем и может оказаться весьма эффективным.

Подобные иммунопрепараты обладают достаточно высокой эффективностью, что позволяет применять их в низких дозах и свести к минимуму побочное действие на иммунную систему. Кроме того, они могут оказаться полезными для лечения различных новообразований, а иногда и заменять химиотерапию. На пораженные клетки можно «нацелить" и другие цитотоксичные белки, например дифтерийный токсин или растительный токсин рицин. Впрочем, даже при

Рис. 10.17. Генетически сконструированный    химерным    комплекс СD4— экзотоксин   A   Pseudomonas. Использован промотор бактериофага Т7 E. coli.

224             ГЛАВА 10
оптимальном развитии событий пройдет еще несколько лет, прежде чем терапевтическое применение рекомбинантных экзотоксинов станет рутинным.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

С помощью клонирования специфических генов и последующей их экспрессии в бактериях получен целый ряд белков, которые можно будет использовать в качестве лекарственных препаратов. Большинство этих белков имеют эукариотическое происхождение, так что для выделения нужного гена сначала получают препарат мРНК, обогащенный интересующими исследователя фракциями, затем создают кДНК-библиотеку и встраивают соответствующую ДНК в подходящий вектор для экспрессии. Произведя обмен участков родственных генов, кодирующих аналогичные белковые домены, или прямо заменяя сегменты клонированного гена, кодирующие функциональные части белка, можно создавать новые модификации таких белков. В качестве лекарственных средств можно использовать и некоторые ферменты. Например, для снижения вязкости слизи, которая накапливается в легких больных муковисцидозом, применяют в виде аэрозоля рекомбинантную ДНКазу I и альгинатлиазу.

С развитием технологии рекомбинантных ДНК и разработкой способов получения моноклональных антител, а также с установлением структуры и функций иммуноглобулинов появился интерес к использованию специфических антител для лечения различных заболеваний. Работа с генами антител облегчается тем, что отдельные домены молекулы антитела выполняют разные функции.

Лекарственные вещества или ферменты можно присоединять к моноклональным антителам или их Fv-фрагментам, специфичным в отношении поверхностных белков определенных клеток, например опухолевых. При этом лекарственное вещество может находиться в инертной форме. Если предполагаются многократные введения таких комплексов, то их иммуноглобулиновый компонент должен представлять собой антитело или фрагмент антитела человека; это позволяет предотвратить развитие перекрестной иммунной реакции и сенсибилизацию больного. Если же предполагается использовать в этих целях моноклональные антитела грызунов, их структуру следует максимально приблизить к структуре антител человека. Для этого в последних достаточно заменить CDR-участки на аналогичные фрагменты антител грызунов. Недавно удалось провести отбор и синтез моноклональных антител человека с помощью Е. colt.

Генноинженерные методы позволяют получать уникальные лекарственные средства, которые представляют собой комплекс белка, связывающегося со специфическими клетками, например ВИЧ-инфицированными, и токсина. Этот подход пока только разрабатывается, но его перспективы обнадеживают.

ЛИТЕРАТУРА

Barbas C.F., III, D. R. Burton. 1996. Selection and evolution of high-affinity human anti-viral antibodies. Trends Biotechno\. 14: 230-234.

Bird R. E., B. W. Walker. 1991. Single chain antibody variable regions. Trends Btotechnol. 9: 132-137.

Brinkmann U., L. H. Pai, D. J. FitzCerald, M. Wülingham, 1. Pastan. 1991. B3Proc. Natl. Acad, Sei. f/&488: 8616-8620.

Brüggemann M., H. M. Caskey, С. Teale, II. Waldmann, G. T. Williams, M. A. Surani, M. S. Mcubcrgcr. 1989. A repertoire of monoclonal antibodies with human heavy chains from transgenic mice. Proc. Nail. Acad. Sei. USA 86: 6709-6713.

Bryn R. A., J. Mordenti, C. Lucas, D. Smith, S. A. Marslers, J. S. Johnson, P. Cossum, S. M. Chamow, F. M. Wurm, T. Gregory, J. E. Gronpman, D. J. Capon. 1990. Biological properties of a CD4 immunoadhesin. Nature 344: 667-670.

Buchner J., R. Rudolph. 1991. Renaturation, purification and characterization of recombinant Fab-fragmnnls produced in E. coli. Bio/Technology 9: 157-162.

Микробиологическое производство лекарственных средств           225
Burton D. R. 1991- Human and mouse monoclonal antibodies by repertoire cloning. Trends Biotechnol. 9: 169-175.

Capon D. J., S. M. Chamow, J. Mordent!, S. A. Marsters, T. Gregory, H, Mitsuya, R. A, Bym, С Lucas, F. M. Wurm, J. E. Groopraan, S. Broder, D. H. Smith. 1989. Designing CD4 immunoadhesins for AIDS therapy. Nature 337: 525-530.

Chamow S. M., A. Ashkenazi. 1996. Immunoadhesins: principles and applications. Trends Biotechnol. 14: 52-60.

Chaudhary V, K., T. Mizukami, T. R. Fuerst, D. J. FitzGerald, B. Moss, L Pastan, Έ, A. Berger, 1988. Selective killing of HlV-infected cells by recombinant human CD4-Pseudomonas exotoxin hybrid protein. Nature 335: 369-372.

Chester K. A-, R. E. Hawkins. 1995. Clinical issues in antibody design. Trends Biotechnol. 13: 294—300.

Chiswell D. J., J. McCafferty. 1992. Phage antibodies: will new 'coliclonal' antibodies replace monoclonal antibodies? Trends ßiotechnol. 10: 80-84.

Collet T. A., P. Roben, R. О Kennedy, C. F. Barbas III, D. R. Burton, R. A. Lerner. 1992. A binary plasmid system for shuffling combinatorial antibody libraries. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89: 10026-10030.

Cunningham B. C., J. A. Wells. 1991. Rational design of receptor-specific variants of human growth hormone. Pn>c. Natl. Acad. Set. USA 88: 3407-3411.

Davis G. T., W. D. Bedzyk, E. W. Voss, T. W. Jacobs. 1991. Single chain antibody (SCA) encoding genes: one-step construction and expression in eukaryotic cells, Bio/Technology 9:165-169.

Dewerchin M., D. Collen. 1991. Enhancement of the thrombolytic potency of plasminogen activators by conjugation with clot-specific monoclonal antobodics. Bioconjugaie Chem. 2: 293—300.

Gram H., L. A. Marconi, C. F. Barbas ΙΠ, T. A. Collet, R. A. Lerner, A. S. Kang. 1992. In vitro selection and affinity maturation of antibodies from a naive combinatorial immunoglobulin library. Proc. Natl. Acad. Sei. Î/&489: 3576-3580.

Harris W. J. 1994. Humanizing monoclonal antibodies for in vivo use. Animal Cell Biotechnol. 6: 259-279.

Hodgson ,1. 1991, Making monoclonals in microbes. Bio/Technology 9:421^125.

Huennekens F. M. 1994. Tumor targeting: activation of prodrugs by enzymemonoclonal antibody con-jugates. Trends Biotechnol. 12: 234-239.

Huse W. D., L. Sastry, S. A. Iverson, A. S. Kang, M. Alting-Mees, D. R. Burton, S. J. Benkovfc, R. A. Lerner. 1989. Generation of a large combinatorial library of the immunoglobulin repertoire in phage lambda. Science 246: 1275-1281.

Johnson I. S. 1983, Human insulin from recombinant DNA technology. Science 219: 632-637.

Little M., F. Breitling, S. Dübel, P. Fuchs, M. ßramiage). 1995. Human antibody libraries in Escherichia coli. J. Biotechnol. 41: 187-195.

LoBuglio A. G., R. H. Wheeler, J. Trang, A. Haynes, K. Rogers, E. B. Harvey, L. Sun, J. Ghraycb, M. B. Khazaeli. 1989. Mouse/human chimeric monoclonal antibody in man: kinetics and immune response, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 4220-4224.

Marks J. D., A. D. Griffiths, M. Malmqvist, T. P. Oackson, J. M. Bye, G. Winter. 19У2. By-passing immunization: building high affinity antibodies by chain shuffling. Bio/Technology 10: 779-783.

Meyer F., A. Hinnen, A. Meister, M. G. Grutier, S. Alkan. December 1989. Hybrid inlerlcrons. U.S. patent 4, 885,166.

Mullinax R. L., Ε. Λ. Gross, J. R. Amberg, B. N. Hay, H. H. Hogrefe, M. M. Kubitz, A. Greener, M. Alting-Mees, D. Ardourel, J. M. Short, J. A. Sorge, B. Shopes. 1990. identification of human antibody fragment clones specific for tetanus toxoid in a bacteriophage λ immunoex-pression library. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87: 8095-8099.

Murata K., T. Inose, T. Hisano, S. Abe, Y. Yonemnto, T. Yaniashita, M. Takagi, K. Sakaguchi, A. Kimura, T. Imanaka. 1993. Bacterial alginate lyase: enzymology, genetics and appb'cation. /. Ferment. Bioeng. 76:427-437,

Nagata S., H. Taira, A. Hall, L. Johnsrucl, M. Streu«, J. Escodi, W. Boll, K. CanteU, C. Weismann. 1980. Synthesis in E. coli of a polypeptide with human leukocyte interferon activity. Nature 284: 316-320.

Pastan I., D. FitzGerald. 1991. Recombinant toxins for cancer treatment. Science 254: 1173-1177.

Pluckthun A. 1991. Antibody engineering: advances from the use of E. coli expression systems, Bio/Technology 9; 545-551.

226             ГЛАВА 10
Primrose S. B. 1986. The application of genetically engineered microorganisms in the production of drugs. / Appl. Bacterial. 61:99-116.

Queen C., W. P. Schneider, H. E. Selfck, P. W. Payne, N. F. Landolf, J. F. Duncan, N. M. Avdalovlc, IVL Levitt, R. P. Junghans, T. A. WaWmanih 1989. A humanized antibody that binds to the inter-leukin 2 receptor. Proc. Nail. Acad. Sa. USA 86: 10029-10033.

Reiter Y., U. Brinkmann, К. О. Webber, S.-H. Jung, I. Pastan. 1994. Engineering interchain disulftde bonds into conserved framework regions of Fv fragments: improved biochemical characteristics of recombinant immunotoxins containing disul-fide-stabilized Fv. Protein Eng. 7:697-704.

Riechmann L., M. Clark, H. Waldmann, and G. Winter. 1988. Reshaping human antibodies for therapy. Nature 332: 323-327.

Taniguchi T._t Y. Fiyii-Kuriyama, M. Muramatsu. 1980, Molecular cloning of human Interferon cDNA. Proc. Nat!. Acad. Sei. USA 77:4003-4006.

van Leen R. W., J. G. Bakhuis, R. F. W. С. van Bedthorcn, H. Burger, L· С J. Dorssers, R. W. J. Hommes, P. J. Lemson, B. Noordam, N. L. M. Persoon, G. Wagemaker, 1991. Production of human inter-leukin-3 using industrial microorganisms. Bio/Technology 9: 47-52.

Vaughan T. J., A. J. Williams, K. Pritchard, J. K. Osbourn, A. R. Pope, J. C. Earnshaw, J. MA. Hodits, J. WiKon, K S. Johnson. 19%. Human antibodies with sub-nanomolar affinities isolated from a large non-immunized phage display library, Nat. Biotechnol. 14: 309-314.

Waldmann T. A, 1991, Monoclonal antibodies in diagnosis and therapy. Scietice252i 1657—1662.

Winter G., C. Milstein. 1991. Man-made antibodies, Nature 349: 293-299.

КОНТРОЛЬНЫЕ ВОПРОСЫ

1. Вам нужно клонировать и экспрессировать фрагмент ДНК, кодирующий интерферон человека, У вас нет нужного ДНК-зонда для гибридизации, но вам удалось выделить линию клеток человека, в которых можно индуцировать синтез интерферона с интенсивностью,       превышающей      фоновую примерно в 100 раз. Какую стратегию клонирования и экспрессии этой ДНК вы выберете?

2. Что такое Fc-фрагмент молекулы антитела? Fab-фрагмент? Fv-фрагмент? CDR-участок?

3. Как   осуществляется   координированный синтез легкой и тяжелой цепей антитела в Е. соli

4. Какова роль ДНКазы I и альгинатлиазы при лечении муковисцидоза?

5. Как зарегистрировать синтез альгинатлиазы, кодируемой клонированным геном, в трансформированных клетках Е. coif?

6. Что    такое    комбинаторная    библиотека кДНК?

7.  Как с помощью бактериофага М13 можно отбирать Fv-фрагменты, связывающиеся со специфическими антигенами-мишенями?

8. Что такое стабилизированная дисульфидными связями и одноцепочечная Fv-молекулы?

9.  Как, присоединяя ферменты к моноклональным антителам или их Fv-фрагментам, можно получать лекарственные средства?

10.  Как получить моноклональные мышиные антитела, максимально близкие по структуре к антителам человека? Почему они необходимы?

11.  Опишите способ получения терапевтического средства, которое «помечает» и уничтожает специфические клетки.