Глик Молекулярная биотехнология. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. Пер с англ. М. Мир, 2002. 589 с
 Скачать 9.74 Mb.
|
ГЛАВА 13. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| Таблица 13. 1. Плазмиды Pseudomonas, их размер и соединения, за разрушение которых ответственны кодируемые ими ферменты1) | ||
| Плазмида2) | Деградируемое соединение | Размер плазмиды, т. п. н. |
| SAL | Салицилат | 69 |
| SAL | Салицилат | 72 |
| SAL | Салицилат | 83 |
| TOL | Ксилол и толуол | 113 |
| pJP1 | 2 ,4 - дихлорфеноксиуксусная | 87 |
| | кислота | |
| pJP2 | 2,4-дихлорфеноксиуксусная | 54 |
| | кислота | |
| pJP3 | 2 ,4- дихлорфеноксиуксусная кислота | 78 |
| | ||
| CAM | Камфара | 225 |
| XYL | Ксилол | 15 |
| pAC31 | 3,5-дихлорбензоат | 108 |
| pAC25 | 3-хлорбензоат | 102 |
| pWWO | Ксилол и толуол | 176 |
| NAH | Нафталин | 69 |
| XYL-K | Ксилол и толуол | 135 |
| 1) Из работы Cork, Krueger, Adv. Appl. Microbiol. 36: 1-66, 1991, с изменениями. | ||
| 2) Плазмиды с одинаковым названием кодируют ферменты одного и того же катаболического пути, хотя могут быть получены в разных лабораториях и иметь разные размеры. | ||
Биодеградация и утилизация биомассы 277
 |
| Рис. 13.1. Пути ферментативного превращения ароматических соединений в катехол бактериями, разрушающими ксенобиотики. |
278 ГЛАВА 13
 |
| Рис. 13.2. Пути ферментативного превращения ароматических соединений в протокатехоат бактериями, разрушающими ксенобиотики. |
Биодеградация и утилизация биомассы 279
| Рис. 13.3. Путь орто-расщепления при ферментативном превращении катехола и протокатехоата в ацетил-СоА и сукцинат. |  |
несли плазмилу САМ в штамм, несущий плазмиду ОСТ. Эти две плазмиды несовместимы (не могут существовать в одной клетке в виде отдельных плазмид), но в результате происходящей между ними рекомбинации образуется одна плазмида, объединяющая их функции. Затем аналогичным путем плазмиду NAH перенесли в штамм, несущий плазмиду XYL. Эти плазмиды совместимы и могут сосуществовать в одной клетке-хозяине. И наконец, гибридную плазмиду перенесли в штамм, несущий плазмиды NAH и XYL. В результате всех этих манипуляций получили штамм, который растет на неочищенной нефти лучше исходных штаммов, взятых по отдельности или вместе.
Хотя сам этот штамм не использовали для ликвидации нефтяных загрязнений, он сыграл важную роль в становлении биотехнологиче-
280 глава 13
 | Рис. 13.4. Путь мета-расщепления при ферментативном превращении катехола и протокатехоата в пируват и ацетальдегид. |
ской промышленности. Изобретатель «супербациллы» получил патент США, описывающий структуру данного штамма и возможности его применения. Это был первый патент, выданный за создание генетически модифицированного микроорганизма и подтвержденный Верховным судом США, который проиллюстрировал, что биотехнологические компании могут защищать свои изобретения точно так же, как химические и фармацевтические.
Большинство разрушающих ксенобиотики бактерий, модифицированных путем переноса плазм ид, являются мезофильными микроорганизмами (хорошо растут при 20—40 °С), а температура воды в загрязненных реках, озерах и океанах обычно лежит в диапазоне от 0 до 20 °С.
Биодеградация и утилизация биомассы 281
 |
| Рис. 13.5. Создание бактериального штамма, способного разрушать камфару, октан, ксилол и нафталин. Штамм А, несущий плазмиду САМ (она детерминирует разрушение камфары), скрещивают со штаммом В, несущим плазмиду ОСТ (разрушение октана). При этом образуется штамм Е, который содержит гибридную плазмиду, образовавшуюся в результате гомологичной рекомбинации между исходными плазмидам и и обладающую функциями каждой из них. Штамм С, содержащий плазмиду XYL (разрушение ксилола), скрешивают со штаммом D. содержащим плазмиду NAH (разрушение нафталина), и получают штамм F, который несет обе эти плазмиды. Наконец, скрещивают штаммы E и F, в результате чего образуется штамм G, содержащий плазмиды САМ/ОСТ, XYL и NAH. |
Чтобы проверить, можно ли создать бактерию, обладающую более широкими катаболическими возможностями и в то же время способную расти и развиваться при низких температурах, плазмиду TOL (детерминирует разрушение толуола) мезофильного штамма Pseudomonas putida перенесли с помощью конъюгации в психрофильный (с низким температурным оптимумом) штамм, утилизирующий салицилат при температуре, близкой к О °С. Трансформированный штамм содержал введенную в него плазмиду TOL и собственную плазмиду SAL, детерминирующую разрушение салицилата, и был способен утилизировать как салицилат, так и толуол в качестве единственного источника углерода при 0°С (табл. 13.2). Психрофильный штамм дикого типа (нетрансформированный) не мог расти при любой температуре, если единственным источником углерода был толуол (толуат). Эта работа показала принципиальную возможность создания психрофильных штаммов бактерий, эффективно разрушающих ксенобиотики в природных условиях, но для их реального получения необходимо провести дополнительные исследования,
Изменение генов
Объединение разных метаболических путей в одном микроорганизме с помощью конъюгации - это лишь один из способов создания бактерий с новыми свойствами. Расширить их катаболические возможности можно идругим путем, модифицируя гены, кодирующие ферменты того или
282 ГЛАВА 13
| Таблица 13.2. Время генерации дикого и трансформированного психрофильных штаммов P. putida, использующих в качестве единственного источника углерода салицилат или толуат, при разных температурах1) | |||
| Температура, °С | Время генерации, ч | ||
| | штамм дикого типа, салицилат2) | трансформированный штамм, салицинaт | трансфирмированный штамм, толуат |
| 37 | Не растет | Не растет | Не растет |
| 30 | 2,2 | 2,5 | 2,0 |
| 25 | 2,1 | 3,2 | 1.3 |
| 20 | 2,6 | 3,8 | 1,9 |
| 15 | 3,2 | 4,2 | 2,9 |
| 10 | 6,3 | 5,6 | 3,3 |
| 5 | 13,9 | 12,9 | 12,2 |
| 0 | 18,6 | 18,1 | 24.4 |
| 1) Из работы Кolenc et al, Appl. Environ. Microbiol. 54:638 Ml, 1988, с изменениями. | |||
| 2) Штамм дикого типа не может утилизировать толуат ни при какой температуре, поскольку у него отсутствуют необходимые для этого ферменты. | |||
иного метаболического пути. Осуществимость этого подхода проверяли на примере плазмиды pWWO, 12 генов которой кодируют мета-расщепление толуола и ксилола. Обладающие этой плазмидой псевдомонады могут использовать в качестве источника углерода алкилбензоаты (рис. 13.6). Указанные гены входят в состав одного xyl-оперона, находящегося под контролем Pm-промотора. Транскрипционная активность последнего находится под позитивным контролем продукта гена xylS, активируемого почти всеми субстратами данного метаболического пути (например, бензоатом и 3-метилбензоатом) (рис. 13.6). Детальный биохимический и генетический анализ показал, что несущие pWWO-плазмиду бактерии могут расщеплять 4-этилбензоат только до 4-этилкатехола, который инактивирует один из основных ферментов данного метаболического пути, катехол-2,3-диоксигеназу, являющуюся продуктом гена xylE, и поэтому не разрушается и накапливается в среде. Кроме того, 4-этилбензоат, в отличие от остальных алкилбензоатов, не активирует XylS-белок; поэтому, если он является единственным субстратом, xyl-оперон не транскрибируется. Для усовершенствования природной системы мета-расщепления алкилбензоатов необходимо решить две основные задачи: 1) предотвратить инактивацию катехол-2,3-диоксигеназы 4-этил-бензоатом; 2) индуцировать транскрипцию генов xyl-оперона в том случае, если единственным субстратом является 4-этилбензоат.
Для решения второй задачи был проведен поиск мутантной плазмиды. Для этого в плазми-ду, несущую ген устойчивости к ампициллину, встроили ген устойчивости к тетрациклину, находящийся под контролем Pm-промотора. В другую плазмиду, несущую ген устойчивости к ка-намицину, встроили ген xylS. Полученными конструкциями трансформировали E. соli, отобрали клетки, содержащие обе плазмиды, по признаку устойчивости к ампициллину и канамицину (рис, 13.7, А), обработали их мутагеном этилметансульфонатом и вырастили на среде, содержащей тетрациклин и 4-этилбензоат. Растущие на этой среде клетки содержат мутантный ген xylSипродуцируют измененный XylS-белок (S*), который способен взаимодействовать с 4-этилбензоатом и активировать транскрипцию гена устойчивости к тетрациклину. Чтобы решить проблему инактивации катехол-2,3-диоксигеназы, мутантный ген xylS встроили в плазмиду с широким кругом хозяев, несущую ген устойчивости к канамицину, и ввели ее в клетки P. putida, содержащие плазмиду pWWO (рис. 13,7, Б). Трансформированные клетки высеяли с высокой плотностью на чашки с минимальной средой, содержащей 4-этилбензоат в качестве единственного источника углерода, канамицин для отбора клеток с плазмидой и этилметансульфонат. Клетки, растущие на этой среде, вырабатывают измененную катехол-2,3-диоксигеназу, которая не ингибируется 4-этил-катехолом. Дополнительный анализ подтвер-
Биодеградация и утилизация биомассы 283
 |
| Рис. 13.6. Путь мета-расщеплениятолуола и ксилола и хуl-оперон плазмиды pWWO. xyl-Oпepoннаходится под контролем Pm-промотора, который регулируется с помощью продукта гена xylS, в свою очередь активируемого одним из исходных субстратов. Гены xylX—xylHнаходятся под контролем Pm-промотора. Ген хуSневходит в состав оперона и экспрессируется конститутивно. Исходным субстратом может быть бензоат (R и R' — это Н), 3-метилбензоат (R — это H, R' — это СН3), 3-этилбензоат (R — это H, R' — это СН2СН3) и 4-метилбензоат(R — это СН3, R' — это Н). Гены xylXYZкодируют толуолдиоксигеназу, xylL — дигидроксициклогексадиенкарбоксилатдегидрогеназу, xylE— катехол-2,3-диоксигеназу, xylF— гидролазу полуальдегида гидроксимуконовой кислоты, xylG— дигидрогеназу полуальдегида гидроксимуконовой кислоты, xylH — 4-оксалокротонат-таутомеразу, xyll — 4-оксалокротонатдекарбоксилазу, xylJ — 2-оксопента-4-еноатгидратазу, xylK—2-оксо-4-гидроксипентонатальдолазу. |
дил, что в гене катехол-2,3-диоксигеназы pWWO действительно произошла мутация и что два мутантных гена (xylSи ген катехол-2,3-диоксигеназы) обеспечивают расщепление 4-этилбензоата.
Оба модифицированных гена участвуют в процессе деградации всех субстратов данного метаболического пути. Поэтому стратегия, использованная для повышения эффективности расщепления 4-этилбензоата, применима и в случае других соединений: мутация, приводящая к гиперпродукции XylS-белка, может усиливать активацию Рт-промотора и повышать скорость разрушения субстрата; кроме того, можно избирательно модифицировать Рm-промотор, чтобы он стал более сильным, сохранив способность взаимодействовать с XylS-белком. Таким образом, проведенная работа показывает, что вполне реально усовершенствование того или иного катаболического пути с помощью технологии рекомбинантных ДНК, традиционного мутагенеза и соответствующих методов отбора.
Одним из наиболее распространенных веществ, загрязняющих почву и воду, является трихлорэтилен, широко использующийся в качестве растворителя и обезжиривающего средства. Он длительное время остается в окружающей среде и считается канцерогеном. Кроме того, анаэробные почвенные бактерии могут дегалогенировать его, превращая в еще более токсичное соединение винилхлорид.
Было показано, что некоторые штаммы P. putida, разрушающие ароматические соединения, такие как толуол, разрушают и трихлорэтилен. С помощью проведенных генетических исследований удалось установить, что для полной детоксикации трихлорэтилена не нужны все ферменты мета-расщепления ксилола и толуо-
284 ГЛАВА 13
| Л  | Рис. 13.7. А. Создание системы синтеза XylS- белка, активируемого 4-этилбензоатом. Сначала заменяют промотор гена устойчивости к тетрациклину в плазмиде pBR322 Рт- промотором и получают плазмиду pJLR200. Затем ген xylScсобственным промотором встраивают в плазмиду с широким кругом хозяев, несущую ген устойчивости к канамицину. Полученными плазмидами трансформируют E. coli. Отбирают трансформированные клетки по признаку устойчивости к ампициллину и канамицину и подвергают мутагенному действию этилметансульфоната. В клетках, несущих мутантный ген xylS (S*), XylS-белок активируется 4-этилбензоатом (ЭБ), активируя в свою очередь Рm-промотор, поэтому они могут расти на среде, содержащей 4-этилбенэоат и тетрациклин. |
Биодеградация и утилизация биомассы 285
| Рис. 13.7. (Продолжение) Б. Создание системы синтеза модифицированной катехол2,3-диоксигеназы, которая не ингибируется 4-этилкатехолом. Штамм Р, putida, несущий плазмиду pWWO, трансформируют плазмидой с широким кругом хозяев, содержащей мутантный гeн xylS*, продукт которого активирует Рm- промотор. Проводят химический мутагенез трансформированных клеток и выращивают их на минимальной среде, содержащей 4-этилбензоат и канамицин. Клетки, растущие на этой среде, содержат мутантный ген катехол2,3-диоксигеназы (мутация X в середине xyl-оперона). |  |
ла, достаточно лишь толуолдиоксигеназы, которая в норме катализирует реакцию окисления толуола до цис-толуолдигидродиола.
Образование функциональной толуолдиоксигеназы кодируется четырьмя генами (рис. 13.8, А). Их выделили и экспрессировали в Е. coliпод контролем сильного индуцибельного tac-промотора, который активируется изопропил-ß-D-тиогалактопиранозидом (ИПТГ), в результате чего трихлорэтилен разлагается до безвредных соединений. Исходная скорость деградации трихлорэтилена в E. coli ниже, чем в P. putida, но она сохраняется в Е. соliдольше. С этим различием может быть связана меньшая, чем у P. putida, чувствительность E. coli к повреждающему действию трихлорэтилена.
В одном из вариантов этого эксперимента был создан рекомбинантный штамм Pseudomonas, в котором были объединены элементы двух разных катаболических путей. Бактериальные штаммы, способные разрушать бифенил, содержат бифенилдиоксигеназу. В состав этого ферментного комплекса входят состоящая из двух субъединиц терминальная диоксигеназа, ферредоксин и ферредоксинредуктаза. По своим структуре и функции бифенилдиоксигеназа сходна с толуолдиоксигеназой, однако утилизирующие бифенил псевдомонады не могут расти на толуоле, а штаммы, утилизирующие толуол, не растут на бифениле. После того как в штамме KF715 P. putida ген bphAq, кодирующий большую субъединицу бифенилдиоксигеназы, был
286 ГЛАВА 13
 |
| Рис. 13.8. А. Клонированный оперон толуол диоксигеназы, находящийся под контролем tac-промотора E, coli. Образование толуолдиоксигеназы обеспечивают четыре гена (todA, todB, todC1 и todC2). Ген todAкодирует флавопротеин, который акцептирует электроны с восстановленного никотинамидадениндинуклеотида (NADH) и переносит их на ферредоксин. Последний кодируется геном todBи восстанавливает терминальную диоксигеназу, кодируемую генами todCîw todC2. Эти гены эквивалентны генам xylXYZna рис. 13.6, Б. Превращение толуола в цис-толуолдигидродиол в результате совместного действия Tod-белков. |
заменен с помощью гомологичной рекомбинации на кодирующий большую субъединицу толуолдиоксигеназы ген todC1 из штамма F1 P, putida, получили штамм, способный эффективно разрушать трихлорэтилен (табл. 13.3), Кроме того, этот штамм растет на многих ароматических соединениях, а следовательно, есть возможность создания микроорганизмов, способных разрушать сразу несколько разных соединений.