хроматография-лекции. Хроматографические методы. Общая характеристика методов
 Скачать 6.82 Mb.
|
|
α = lB/ lA (6.6) Если α = 1, то компоненты А и В не разделяются. Основное оборудование для ТСХ Для проведения анализа применяют пластины марки «Sorbfil» или «Силуфол» с УФ-индикатором: ПТСХ-АФ-В-УФ (с подложкой из алюминиевой фольги) или ПТСХ-П-В-УФ (с полимерной подложкой) размером 10×10 см или 10×15 см. Хроматографическая камера 190×195×65 мм может использоваться как для пластин 10×10 см, так и 10×15 см. Стеклянный капилляр применяются для нанесения анализируемых растворов на пластину. Для ускоренной сушки пластин (как после нанесения анализируемых растворов, так и после хроматографирования) можно применять нагревательные устройства различных конструкций, сушильный шкаф либо промышленные марки сушильных пистолетов. Для определения положения пятен анализируемых веществ (детектирование) после хроматографирования применяется УФ-облучатель УФС-254/365 (ТУ 42154-004-16943778-99). Техника эксперимента в ТСХ Активация пластин. Для повышения точности анализов рекомендуется проводить активацию пластин. Это связано с тем, что адсорбционная способность силикагеля и оксида алюминия уменьшается с возрастанием содержания воды и зависит от условий хранения пластин. Для активации в хроматографическую камеру наливают ацетон или 10% раствор аммиака. Пластину помещают в камеру и накрывают крышкой. Фронт растворителя должен достичь ее верхнего края. После этого пластину с помощью пинцета (необходимо избегать прикосновения руками к слою сорбента) извлекают из хроматографической камеры и выдерживают в сушильном шкафу при температуре 100°С в течение 1 ч. Режим сушки должен быть таким, чтобы в слое адсорбента не образовалось трещин. Активированные пластины хранят в эксикаторе над осушителем (прокаленный CaCl2 или безводный силикагель) или в плотно закрытом герметичном пакете. Перед активацией в верхнем углу пластины карандашом рисуют стрелку направления движения растворителя, чтобы при хроматографировании оно было таким же, как и при активации пластин. Приготовление подвижной фазы. В колбу с притертой пробкой при перемешивании добавляют указанные растворители до получения однородного прозрачного раствора. Дозирование компонентов проводят мерным цилиндром. Общий объем элюента составляет около 3050 мл. Готовить элюент необходимо непосредственно перед анализом. Заблаговременное приготовление элюента не рекомендуется, так как при хранении происходит его частичное испарение, что меняет соотношение растворителей, либо протекают химические реакции (растворы аммиака). Использовать одну порцию элюента для последовательного проведения нескольких анализов нежелательно по соображениям воспроизводимости. В этом случае приготавливают рассчитанный большой объем элюента и для каждого анализа отбирают от него свежую порцию. Насыщение хроматографической камеры. Перед хроматографированием необходимо насытить хроматографическую камеру парами растворителей, чтобы не нарушать состав элюента в процессе развития хроматограммы за счет испарения с пластинки и поверхности раствора. Для этого приготовленную смесь растворителей выливают в камеру, накрывают крышкой и выдерживают около 20 мин. Рекомендуется обложить стенки камеры фильтровальной бумагой для быстрого и равномерного насыщения воздуха парами растворителей. Однако в таких камерах трудно получить воспроизводимые результаты, так как по мере поднятия элюента по пластине происходят фронтальное разделение элюента в слое сорбента (полизональная ТСХ), адсорбция и капиллярная конденсация компонентов элюента из паровой фазы на сухую часть пластины и другие процессы. Нанесение проб. Карандашом, не повреждая слой сорбента, помечают на активированной пластине линию старта на расстоянии 1 см от нижнего края пластины и линию финиша ниже верхнего края пластины. Пробы испытуемого раствора и раствора сравнения наносят на линию старта стеклянным капилляром, осторожно касаясь сорбента. При этом пробы наносят таким образом, чтобы расстояние от места нанесения до левого (раствор сравнения) или правого (испытуемый раствор) края пластины составляло около 1 см. Расстояние между соседними пятнами также должно быть около 1 см. Подобным образом на пластину можно нанести, например, раствор сравнения и 3-4 испытуемых раствора, приготовленных из нескольких различных препаратов, содержащих одно действующее вещество (при массовых анализах). При нанесении проб надо стремиться получать компактные «стартовые пятна» диаметром до 4-5 мм, что повышает эффективность и четкость разделения. Для этого используется дробное нанесение (по частям) с сушкой пластин до полного испарения растворителя. Пробу можно сконцентрировать в узкую стартовую зону при погружении пластины в растворитель, для которого значения Rf всех компонентов близки к 1, и пропусканием его несколько выше зоны нанесения пробы, после чего элюирование прекращают, а пластину быстро высушивают. Подобную операцию повторяют несколько раз. Вследствие нанесения чрезмерно большого количества пробы, адсорбционной емкости неподвижной фазы может оказаться недостаточно, и вещество не адсорбируется на носителе в полной мере. При прохождении элюента через стартовое пятно высокой концентрации компоненты пробы просто растворяются в элюенте, а не десорбируются, как в процессе нормального развития хроматограммы. В этом случае, а также при нанесении вещества в виде большого пятна, получаются сильно вытянутые пятна (зоны) в виде «хвостов», что способствует сливанию зон соединений с близкой хроматографической подвижностью в одно большое сильно вытянутое пятно. Минимальное количество исследуемой пробы лимитируется порогом чувствительности метода проявления пятен на пластине. Рекомендуется перед началом хроматографирования срезать углы в нижней части пластины на расстоянии 6-8 мм от края под углом 45° для обеспечения равномерного подъема фронта растворителя. Для предотвращения смешения проб между собой капилляр необходимо тщательно промывать в растворителе не менее 3 5 раз. Развитие хроматограммы (хроматографирование). При хроматографировании камера должна находиться на устойчивой поверхности. Пластину с нанесенными пробами помещают с помощью пинцета в хроматографическую камеру, таким образом, чтобы уровень элюента был ниже линии старта. Помещение пластины в камеру необходимо проводить аккуратно и быстро, чтобы не нарушить установившееся при насыщении равновесие. Под действием капиллярных сил элюент перемещается вдоль пластины к линии финиша, увлекая за собой вещества, содержащиеся в пробах. Крышку камеры закрывают и проводят хроматографирование до тех пор, пока фронт растворителя не дойдет до линии финиша. После этого пластину пинцетом вынимают из камеры и помещают в сушильный шкаф для удаления растворителя. Проявление хроматограммы (детектирование пятен). Многие органические вещества образуют невидимые зоны, поэтому для их обнаружения хроматограмму обрабатывают растворами органических и неорганических реагентов-проявителей (табл. 2). Цветные реакции в ТСХ используются чрезвычайно широко. Они служат для определения местоположения разделенных компонентов, установления класса веществ, а также для идентификации (при наличии индивидуальных реакций). При совпадении всех качественных реакций и полученных значений Rfвещества в трех различных системах с литературными данными, вещество идентифицировано. Пятна анализируемых веществ на поверхности пластины можно увидеть и при ее облучении УФ-светом. Высушенную пластину помещают в облучатель хроматографический УФС-254/365 и рассматривают пятна веществ в свете УФ-лампы при 254 или 365 нм. Сорбент обычно содержит флуоресцентные индикаторы (силикаты цинка, сульфиды цинка или кадмия, вольфраматы щелочноземельных металлов), и пластина при УФ-облучении 254 нм светится бледно-голубым светом. В присутствии веществ, способных поглощать УФ-излучение (ароматические и содержащие сопряженные С=С-связи соединения), происходит ингибирование флуоресценции,и эти соединения проступают в виде темных пятен. При длинноволновом УФ-излучении с длиной волны 365 нм разделенные вещества на пластинах флюоресцируют яркими пятнами, часто разного цвета, на темном фоне. Чувствительность детектирования в таком свете увеличивается с ростом интенсивности облучения. Таблица 1. Проявление пятен веществ на хроматограммах
После высушивания пластинки ТСХ проявление пятен окисляющихся веществ проводят с помощью раствора KMnO4. Пятна также проявляются при взаимодействии с парами йода. В этом случае пластину кладут в чашку Петри с йодом или в сосуд со смесью силикагеля и йода и оставляют на некоторое время до момента, когда соединения начнут проявляться в виде коричневых пятен. Проявление фосфорномолибденовой кислотой проводят путем опускания пластинки в спиртовой раствор реагента с последующим высушиванием и прогреванием в токе горячего воздуха до появления окрашенных пятен. Преимуществом ТСХ по сравнению с бумажной хроматографией является возможность использования агрессивных реагентов для проявления пятен (например, серной кислоты). После проявления хроматограммы необходимо обозначить карандашом положение линии фронта растворителя и пятен. Качество хроматографирования определяет отсутствие «хвостов» разделяемых веществ или перекрытие их пятен, правильная форма и размеры пятен, отсутствие слияния хроматографических дорожек и т.д. При необходимости хроматограмму зарисовывают, фиксируют цвет, форму и размер пятен анализируемых веществ, а также рассчитывают величины Rf компонентов. Если пятно, полученное от испытуемого раствора, находится на одном уровне с пятном от раствора сравнения, это с высокой вероятностью означает, что данные растворы содержат одно и то же действующее вещество и это свидетельствует об обнаружении испытуемого вещества. Если же пятно от испытуемого раствора значительно отличается по положению от пятна раствора сравнения или вообще отсутствует, то это говорит об отсутствии испытуемого вещества.
В сверхкритической флюидной хроматографии (СФХ) подвижной фазой служит сверхкритический флюид – вещество, находящееся в сверхкритическом состоянии и имеющее показатели, промежуточные между характеристиками газов и жидкостей, благодаря тому, что находится при так называемой критической температуре Тс и критическом давлении рс. Наиболее важными характеристиками используемых в хроматографии подвижных фаз являются плотность, вязкость и коэффициент диффузии. В табл. 1.3 сопоставляются эти характеристики для газов, сверхкритических флюидов и жидкостей. Аномально высокая плотность сверхкритических флюидов обусловливает чрезвычайно высокую растворяющую способность в них большинства нелетучих веществ. Например, диоксид углерода в сверхкритическом состоянии растворяет н-алканы с числом С-атомов от 5 до 40, а также очень многие полициклические ароматические углеводороды. Величины критической температуры и критического давления для некоторых веществ, наиболее часто используемых в качестве подвижных фаз в СФХ, приведены в табл. 1.4. Оптимальными для Таблица 1.3 Важнейшие характеристики газов, сверхкритических флюидов и жидкостей
СФХ параметрами являются температура около 1,2 Тс и давление от 1 до 3 рс, т. е. находятся в диапазоне обычных для ГХ и ВЭЖХ условий, и, следовательно, хроматограф для СФХ может состоять из блоков, аналогичных применяемым в ГХ и ЖХ. Таблица 1.4 Критические величины для подвижных фаз в СФХ
Наиболее часто в качестве подвижной фазы в СФХ используют диоксид углерода, поскольку это достаточно дешевый, нетоксичный, не имеющий запаха, удобный в обращении реагент, не поглощающий УФ-излучение вплоть до 190 нм. Критические параметры диоксида углерода таковы, что температура и давление могут варьироваться в достаточно широких пределах. При его применении в качестве подвижной фазы оптимизация разделения компонентов смеси может быть достигнута введением органического модификатора, например метанола или диоксана. Неподвижные фазы в СФХ могут находиться в набивных или капиллярных колонках. Набивные колонки заполняются адсорбентами с диаметром частиц 3–10 мкм, в капиллярных колонках из плавленого кварца в качестве неподвижных фаз используют жидкие или химически привитые на внутренних стенках силоксаны. Толщина слоя неподвижной фазы в капилляре составляет 0,05–1 мкм. Следует обратить внимание на важную роль точной установки температуры и давления при проведении СФХ. Температура может поддерживаться с помощью обычных для ГХ колоночных термостатов. Давление в колонке необходимо точно контролировать, поскольку плотность сверхкритического флюида зависит от давления и изменения давления приводят к изменению коэффициентов емкости. Более высокое давление обеспечивает большую плотность флюида. Это повышает элюирующую силу подвижной фазы и снижает время удерживания компонентов разделяемой смеси. Например, увеличение давления диоксида углерода с 7 до 9 Мпа сокращает время удерживания компонентов некоторых смесей примерно в 5 раз. Благодаря этому в СФХ используют градиентное программирование давления, по достигаемому эффекту аналогичное программированию температурв в газовой хроматографии и градиентному элюированию в жидкостной. Благодаря тому, что СФХ объединила преимущества газовой и жидкостной хроматографии, она особенно полезна при установлениии соединений, которые не могут быть определены ни ГХ, ни ЖХ. Это, с одной стороны, нелетучие вещества, которые не могут испаряться без разложения, и, с другой стороны, вещества, не содержащие функциональных групп и, следовательно, не дающие сигнал при использовании обычных для жидкостной хроматографии спектроскопических или электрохимических детекторов. Примеров применения СФХ для определения нелетучих веществ с относительно высокой молекулярной массой достаточно много уже в настоящее время. С ее помощью эффективно анализируются многие природные продукты, лекарства, пищевые продукты, поверхностно-активные вещества, полимеры, сырая нефть и продукты ее переработки и многие другие объекты. Сверхкритическая флюидная хроматография (СФХ) — вид элюентной хроматографии, в которой в качестве основного компонента подвижной фазы используется вещество в сверхкритическом или околокритическом состоянии. Впервые возможность использования растворителя при температурах выше критической в качестве элюента в хроматографии была показана в работе Клеспера 1962 года [1], однако долгое время этот метод не находил серьезного применения ввиду недостаточного развития приборной базы. Настоящее становление данной техники пришлось на 80—90-е годы, в немалой степени благодаря обострившемуся вниманию общества к проблемам природопользования и ресурсосбережения. В ходе поиска альтернативных, более экологически приемлемых и экономически выгодных лабораторных и промышленных технологий сверхкритические флюидные технологии, и в частности СФХ, стали пропагандироваться и использоваться не только в среде исследователей-энтузиастов. Так, например, газета Нью-Йорк Таймс 19 мая 1987 года писала: «Выше определенной температуры и давления вещество может быть переведено в некое особое состояние, называемое сверх критическим флюидом... которое нельзя встретить на Земле в обычных условиях». В 1990—2000-е годы пристальное внимание было сконцентрировано на методах раз деления энантиомеров с использованием сверхкритической хроматографии, поскольку именно в этой области экономические преимущества препаративной СФХ над ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография) дают особо заметный эффект. Однако в последнее время осваивается все больше новых сфер применения этого метода, ранее казавшихся недостижимыми для сверхкритической хроматографии. Ниже будет разобрано несколько примеров такого рода. |