|
|
хроматография-лекции. Хроматографические методы. Общая характеристика методов
2. СВОЙСТВА СВЕРХКРИТИЧЕСКИХ ФЛЮИДОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ
В СФХ
Как известно, некоторые свойства сверхкритических флюидов могут быть описаны как промежуточные между свойствами газов и жидкостей. Важными для использования в хроматографии являются следующие из них:
— коэффициенты диффузии в сверхкритических средах больше коэффициентов диффузии в жидкостях;
— вязкость сверхкритических флюидов меньше вязкости жидкостей;
— растворяющая способность сверхкритических флюидов выше растворяющей способности газов.
Применительно к хроматографии это означает, что:
возможно достижение значительно более коротких времен анализа;
оптимальное значение линейной скорости потока в СФХ выше, чем в ВЭЖХ;
спад давления на колонке гораздо меньше, чем в ВЭЖХ;
возможно использование колонок большей длины;
возможно использование гораздо более низких температур, чем в ГХ, без потери эффективности;
возможно проведение разделений веществ с гораздо большими молекулярными массами, чем в ГХ.
Кроме вышеперечисленного, подвижная фаза в СФХ, состоящая в основном из вещества, в нормальных условиях являющегося газом, более сжимаема, чем в ВЭЖХ. Сравним, например, коэффициенты: изотермического сжатия С02 и ацетонитрила:
(С02, 25 °С) = 7,3 • 10 -4 мл/атм;
(С02, 10 °С) = 4,5 • 10 -4 мл/атм;
(СН3СN, 25 °С) = 4,5 • 10 -5 мл/атм.
Было показано [2], что поток мобильной фазы в СФХ не подвержен турбулентности в отличие от подвижной фазы в ВЭЖХ, что увеличивает эффективность разделения в СФХ. Это особенно существенно в препаративной хроматографии, поскольку позволяет использовать в приборах соединительные трубки большей длины без дополнительных потерь эффективности и уширения пиков за счет турбулентных явлений.
В 60—90-е годы было изучено множество «претендентов» на роль основного компонента подвижной фазы в СФХ. Вначале рассматривались вещества, являю щиеся как жидкостями, так и газами в нормальных условиях. Позднее было показано, что, несмотря на хорошие растворяющие способности у полярных жидкостей, жидкости не могут дать серьезных преимуществ по сравнению с ВЭЖХ, поскольку требуемые величины вязкости и коэффициентов диффузии достигаются в слишком жестких условиях ввиду высоких критических параметров этих веществ. Наибольшее внимание было уделено воде и аммиаку как потенциальным раство рителям СФХ, однако в данном случае, помимо жестких условий эксплуатации, возникает также проблема чрезвычайно высокой коррозионной активности подвижной фазы. Среди газов в качестве компонентов подвижной фазы иссле довались такие вещества как N2O, SO2, Xe, SF6, ряд алканов и некоторые другие. К настоящему моменту все они были отброшены по тем или иным причинам. Так, N2O и SO2, хоть и обладают сравнительно высокой полярностью, но обладают также и заметной токсичностью, что фактически исключает их использование в препаративных системах, где невозможна реализация полной герметичности хроматографического пути и гарантированного отсутствия контакта человека с веществом-элюентом. К тому же было показано, что закись азота способна образовывать взрывоопасные вещества при продолжительном контакте с металлом под давлением [3]. Xe — предпочтителен с точки зрения минимизации шумов при УФ-детектировании, но обладает слишком малой растворяющей способностью. Алканы — пожароопасные вещества. Меры предосторожности, которые необходимо предпринимать при наличии опасности их выброса в атмосферу и самовоспламенения, сводят на нет потенциальные выгоды от их использования при разделении неполярных восков, триглицеридов и т. п. В настоящее время 100 % приложений сверхкритической хроматографии реализуются с использованием диоксида углерода в качестве основного компонента элюента.
В 1968 году в работе [4] было предположено, что сжатый СО2 по своей растворяющей способности должен быть сравним с изопропанолом. Это утверждение на долгое время сбило исследователей и производителей оборудования для СФХ с верного пути. Впоследствии, когда стало окончательно ясно, что данное предположение не подтверждается экспериментальными данными, восторжествовало представление о схожести сверхкритического диоксида углерода с гексаном, в основном ввиду неполярности обеих молекул. Однако и этот постулат также не вполне отвечает реальности. Хотя дипольный момент СО2 равен нулю, но эта молекула обладает значительным квадрупольным моментом, и обе связи С=О полярны [5]. Это выражается в способности СО2 проявлять свои полярные свойства на микроуровне в межмолекулярных взаимодействиях. В некоторых случаях вступать во взаимодействие в качестве слабой кислоты Льюиса, в некоторых — в качестве слабого основания Льюиса, а в некоторых — одновременно в обеих этих функциях [5]. На основании значительной экспериментальной базы данных сейчас можно однозначно утверждать, что СО2 не является аналогом гексана по растворяющей способности и что нормально-фазовая хроматография (НФ) с использованием гексана в качестве основного компонента подвижной фазы не эквивалентна СФХ в отношении круга решаемых задач. Особенно ярко это проявляется при разделении перфторированных углеводородов и соединений, содержащих большое количество сложноэфирных групп.
И тем не менее, возможности использования СФХ с чистым СО2 в качестве элюента весьма ограничены ввиду его невысокой растворяющей способности для полярных веществ. Поэтому подавляющее большинство современных методик разделения с помощью сверхкритической хроматографии с насадочными колонками реализовано с использованием сорастворителей, также называемых модификаторами или энтрейнерами. Чаще всего в этом качестве используются низшие спирты как доноры водородных связей — метанол, этанол, изопропанол, 1- и 2-бутанол — и ацетонитрил как акцептор водородных связей. Кроме того, для ряда приложений применяется толуол как компонент, позволяющий увеличить роль ароматических π—π взаимодействий анализируемых веществ (аналита) с подвижной фазой, а также некоторые углеводороды — в тех случаях, когда необходимо понизить полярность растворителя. В большинстве приложений содержание сорастворителя в мобильной фазе невелико — 10
20 объемных процентов, однако иногда эта величина доходит до 55 %. Роль сорастворителя в разделении весьма многогранна и не сводится только к увеличению общей полярности подвижной фазы. Молекулы модификатора сорбируются на активных центрах неподвижной фазы, меняя тем самым взаимодействие аналита с сорбентом и сорбента с растворителем. Модификатор меняет плотность растворителя, что приводит к смещению оптимума линейной скорости и к изменению спада давления по колонке. Наиболее распространенным сорастворителем в СФХ является метанол. Его использование приводит к уменьшению времен удерживания и влияет на селективность разделения. Полярный модификатор выполняет функцию, аналогичную роли силь ного растворителя в обращенно-фазовой (ОФ) ВЭЖХ.
Строго говоря, в сверхкритической хроматографии не играют большой роли физико-химические свойства, присущие собственно сверхкритическому состоянию. Ни отсутствие поверхностного натяжения, ни особые механизмы передачи тепла не оказывают решающего влияния на хроматографические параметры. Единственная характеристика сверхкритического состояния, которую можно назвать необходимой в СФХ, — это наличие гомогенной однофазной системы. Использование значительных количеств сорастворителя при низком давлении либо высокой температуре может привести к расслоению растворителя и возникновению двухфазного режима, что чрезвычайно негативно сказывается на эффективности разделения и уровне шума детекторов (см. рис. 1). Так, критическая точка смеси 86 % С02 : 14 % MeOH — 105 бар/55 °С. Поскольку содержание модификатора в подвижной фазе — параметр, наиболее сильно влияющий на разделение, то при оптимизации условий хроматографисту может понадобиться проводить сканирование его значений в широком диапазоне. При этом следует опираться на фазовые диаграммы двухкомпонентных смесей, чтобы быть уверенным в том, что при изменении состава элюента нет возможности «выпасть» из однофазного режима.
В остальном же подвижная фаза в СФХ не обязательно должна существовать именно в сверхкритическом состоянии. В ранних работах предполагалось, что смена сверхкритических условий на субкритические должна вызывать значительные эффекты в хроматографии, например, в ходе градиентного элюирования с изменением состава мобильной фазы ввиду резких изменений вязкости и коэффициентов диффузии. По мере становления СФХ было показано, что это совсем не так, и при постоянстве плотности элюента, которого можно достичь, удерживая давление не ниже определенной величины, переход, например, через критическую температуру не приводит к серьезным изменениям этих величин. В ряде фармацевтических приложений СФХ с насадочными колонками даже используются специальные колоночные криотермостаты, позволяющие охлаждать колонки и проводить элюирование при отрицательных температурах [6].
В связи с вышеизложенным встает проблема точного наименования обсуждаемой хроматографической техники. По сути, называя СФХ сверхкритической хроматографией, мы поступаем не совсем корректно, поскольку отличительной особенностью данного метода от ГХ (газовой хроматографии) и ВЭЖХ является не использование подвижной фазы в сверхкритическом состоянии, а использование смесей сжатого диоксида углерода и органических сорастворителей в этом качестве. При этом в области низких давлений, высоких температур и малых количеств энтрейнеров хроматографическая система с таким элюентом ведет себя близко к ГХ, при использовании же высоких давлений, относительно низких температур и значительных количеств энтрейнеров — ближе в ВЭЖХ. Разными исследователями предлагались различные наименования для отдельных интервалов диапазона между ГХ и ВЭЖХ — Solvating Gas Chromatography, Hyperbaric Chromatography, Enchanced Fluidity Chromatography, Pressurized Fluid Chromatography и т.п. В работах Честера и Парчера [7] была предложена концепция унифицированной хроматографии как единого метода, вбирающего в себя все промежуточные стадии между классической газовой и классической жидкостной хроматографией. СФХ занимает срединное положение во внутреннем разделении методов, при этом очевидно, что никакие жесткие рамки, разграничивающие пункты такого деления между собой, не могут быть установлены и не имеют никакого практического значения, оставаясь лишь вопросом предпочтительной терминологии. Таким образом, в современной литературе под термином СФХ понимается не столько термодинамическое состояние подвижной фазы, сколько приборное оформление проводимых экспериментов, позволяющее осуществлять поддержание достаточно высокого давления на всем протяжении хроматографического тракта.
Одна из основных отличительных особенностей СФХ — возможность использования больших линейных скоростей потока. Зависимость эффективности разделения от линейной скорости подвижной фазы в хроматографии определяется уравнением Ван-Деемтера
Ввиду небольших значений вязкости подвижной фазы в СФХ коэффициент С в уравнении (1) мал в сравнении с ВЭЖХ-системами, и угол наклона восходящей ветви кривой Ван-Деемтера (см. рис. 3), пропорциональный величине 8dp/100Dm, где dp— диаметр пор в насадочной колонке, а Dm— коэффициент диффузии, оказывается достаточно пологим, чтобы, во-первых, оптимум кривой находился в области более высоких значений |х, чем в ВЭЖХ, а во-вторых, чтобы увеличение скорости потока флюида не приводило к резкому падению эффективности. На рис. 4 приведена зависимость количества теоретических тарелок от скорости потока при разделении энантиомеров оксида транс-стильбена с использованием одного и того же хирального сорбента в ВЭЖХ и СФХ. Как видно, приемлемой эффективности в СФХ можно добиваться при гораздо более высоких скоростях потока подвижной фазы. Этот фактор становится особенно важным при необходимости проведения большого количества однотипных рутинных анализов либо препаративной очистке больших количеств вещества, так как даже небольшая экономия времени может дать значимый суммарный выигрыш. На рис. 5 [8] приведен еще один эксперимент этого рода, из которого можно заключить, сколь велика может быть экономия времени, тратящегося на разделение, при использовании высоких скоростей потока в СФХ 
Помимо возможности сохранения эффективности при увеличении скорости потока, низкая вязкость обусловливает также малый перепад давления по колонке в ходе элюирования в СФХ по сравнению с ВЭЖХ. Зависимость перепада давления от вязкости определяется уравнением Пуазейля
 гдгде с — коэффициент пропорциональности; L— длина хроматографической колонки; µ — линейная скорость потока; ɛт — коэффициент пористости колонки; η — динамическая вязкость; dp— диаметр пор упаковки сорбента.
Вязкость диоксида углерода в типичных для насадочной СФХ условиях примерно в 10 раз меньше вязкости воды. При смешении воды со спиртами вязкость образующейся системы даже увеличивается вследствие сильного водородного взаимодействия между ними, что негативно сказывается на перепаде давления в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ с градиентом состава. СО2 слабо взаимодействует со спиртами, и вязкость подвижной фазы в СФХ полого монотонно растет при градиенте состава с ростом содержания сорастворителя. Типичное значение АР на стандартной колонке 250 х 4,6, заполненной 5-микронным сорбентом, при 25 °С и скорости потока 1,5—2,0 мл/мин — 150 бар для ВЭЖХ и 20 бар для СФХ. Серийно производимое оборудование, как правило, рассчитано на максимальное давление на насосах в 400 бар. Соответственно, объемная скорость потока выше 3 мл/мин в ВЭЖХ используется чрезвычайно редко, большинство же аналитических приложений реализовано на скорости 1—2 мл/мин. В СФХ возможно элюирование через аналитическую колонку 100-5 250 х 4,6 со скоростью до 10 мл/мин при сохранении достаточной эффективности разделения.
Названные факторы вместе с высокими коэффициентами диффузии и высокими коэффициентами сжимаемости обусловливают не только высокую скорость разделения и более высокую эффективность при сравнимой селективности, но и несравнимо более быстрое установление равновесного режима после смены экспериментальных условий. Последнее свойство также становится весомым при необходимости проведения большого количества рутинных экспериментов либо при скрининге сорбентов и сорастворителей с целью поиска оптимальной мето дики разделения. Этот же комплекс свойств позволяет применять более длинные колонки или последовательное соединение нескольких колонок для достижения более эффективного разделения в случаях отсутствия иных неэкстенсивных путей оптимизации методики.
4. ПРИБОРНОЕ ОФОРМЛЕНИЕ
Современная сверхкритическая флюидная хроматография с насадочными колонками — ближайшая родственница ВЭЖХ как в отношении химических и технических приемов, используемых для достижения желаемых результатов, так и в плане приборного оформления. СКФ-хроматограф состоит из насосного блока, колоночного термостата, автосамплера, одного или нескольких детекторов, регулятора давления (back-pressure regulator, BPR, БПР) и системы сбора фракций. Двумя принципиальными техническими отличиями СФХ-систем от ВЭЖХ являются: 1) необходимость контроля давления на всем протяжении пути от насосов до выхода из детектора, осуществляемая регулятором давления БПР, и 2) необходимость охлаждения головок насоса СО2 для предотвращения перехода диоксида углерода в газовую фазу. Первое требование обычно удовлетворяется установкой охлаждающей системы, в которую включается блок предварительного охлаждения жидкого диоксида углерода после выхода из источника перед попаданием в поршневые камеры насоса и охлаждение самих камер. Это может осуществляться либо с использованием охлаждающего циркуляционного термостата с антифризом, либо с помощью элемента Пельтье. Второе требование выполняется встраиванием в контур автоматического регулятора давления на выходе потока из детектора. Существует много различных вариаций БПР. Наибольшее распространение получили системы, базирующиеся на линейных игольчатых клапанах тонкой регулировки, управляемые с помощью мотора. Ряд дополнительных технических особенностей приборов для СФХ — наличие возможности ввода пробы в поток модификатора до смешения его с диоксидом углерода в случае препаративного разделения веществ высокой полярности; необходимость установки УФ-детекто-ров, снабженных смотровой ячейкой высокого давления; наличие камеры смешения потоков флюида и сорастворителя, выполняющей также функцию демпфера пульсаций потока, — не являются непривычными для производителей хромато-графического оборудования, поскольку схожие задачи приходится решать и при конструировании иных типов приборов.
Меры предосторожности при работе с СФХ также во многом схожи с ВЭЖХ. Использование нетипичных, химически агрессивных либо чересчур вязких сора-створителей может привести к повреждению насосов. При температурах существенно выше комнатной (>60 °C) могут пострадать колонки. Единственной отличительной особенностью техники безопасности СФХ по сравнению с иными хроматографическими методами является обращение с эффлюентом. После БПР СО2, теряя давление, адиабатически расширяется примерно в соотношении 1 : 500, что приводит к формированию сильного потока газа с каплями сорастворителя и аналита в нем, а также резко охлаждается благодаря эффекту Джоуля—Томсона.
Поэтому поток эффлюента в СФХ сначала пропускают через газо-жидкостный сепаратор либо уловитель жидкости, в случае препаративной хроматографии нагревают и только после этого направляют на систему сбора фракций. В противном случае вести количественный сбор очищенного продукта становится весьма затруднительно вследствие выпадения большой части выделенного продукта на охлаж даемом благодаря адиабатической декомпрессии участке пути и формирования аэрозоля в сборнике ввиду высокой скорости потока газообразного диоксида углерода.
Насадочная СФХ обычно считается нормально-фазовой техникой, поскольку в ней используется неполярная подвижная фаза и полярные сорбенты. И действительно, большинство приложений, для которых используется эта техника, ранее решались с помощью нормально-фазовой ВЭЖХ. СФХ фактически послужила основой для возрождения нормально-фазовой хроматографии, так как до масштабного внедрения СФХ в лабораторную практику нормально-фазовая ВЭЖХ постепенно теряла популярность и вытеснялась более популярной обращенно-фазовой хроматографией. Это вызвано целым рядом причин, среди которых:
губительное воздействие на разделение даже небольших количеств воды в системе;
очень большие времена установления равновесных условий;
трудности с осуществлением градиентных методик;
генерация большого количества токсичных и взрывоопасных жидких отхо дов при проведении препаративных разделений;
невысокие растворяющие способности доступных элюентов.
Как следует из изложенного выше, насадочная СФХ полностью свободна от всех этих сложностей, поэтому нормально-фазовая хроматография вновь вернулась в активную производственную практику с появлением СФХ. Произошедший в 90-е годы переход от насосов, контролирующих рабочее давление в системе, и пассивных рестрикторов к насосам, контролирующим скорость потока флюида, и автоматическим БПР позволил реализовать градиентное элюирование с вариацией содержания сорастворителя в подвижной фазе. При этом рост вязкости по мере роста процента сорастворителя компенсируется падением линейной скорос ти потока при сохранении эффективности разделения в ходе градиентного элю-ирования. 0днако сверхкритическая хроматография не ограничена этой областью. 0дним из замечательных проявлений двойственной природы полярности диок сида углерода является тот факт, что перевод между НФ и 0Ф режимами осуще ствляется простой сменой колонки при сохранении подвижной фазы. На рис. 6 приведен пример использования СФХ в обращенно-фазовом режиме для разделения смеси олигомеров полиэтилена массами вплоть до С84, достигнутого всего за 7 минут [9]. При этом в СФХ наибольшее влияние на удерживание разделяемых компонентов в обоих режимах оказывает природа подвижной фазы, поскольку в ней отсутствует вода, практически не смешивающаяся с СК-С02. Вода нивелирует слабые межмолекулярные взаимодействия, при наличии ее в элюенте механизмы удерживания преимущественно определяются способностью к участию в водородных связях. В СФХ больший вклад в удерживание дают более слабые диполь-дипольные, к—к, поляризационные и иные типы взаимодействий. 0тчасти поэтому на настоящий момент количество сорбентов, применяемых в СФХ, значительно превышает таковое в ВЭЖХ и разрыв продолжает расти, так как поиск механизмов удерживания и разделения, равно как и способов их реализации в хроматографии, продолжается [10].
|
|
|
Скачать 6.82 Mb.