хроматография-лекции. Хроматографические методы. Общая характеристика методов
 Скачать 6.82 Mb.
|
|
7.4. ВЛИЯНИЕ ТОЛЩИНЫ ПЛЕНКИ НЕПОДВИЖНОЙ ЖИДКОЙ ФАЗЫ НА ЭФФЕКТИВНОСТЬ КАПИЛЛЯРНОЙ КОЛОНКИ При исследовании этого вопроса для капиллярной газовой хроматографии необходимо принимать во внимание следующие два обстоятельства:
 , (49)а, следовательно, изменяется и величина коэффициента емкости колонки  , определяемая соотношением . (50)Следовательно, при выборе конкретной капиллярной колонки всегда следует учитывать, какая практическая цель при этом преследуется с учетом следующих положений:
В этой связи толщина пленки неподвижной жидкой фазы должна соответствовать некоторой оптимальной величине, удовлетворяющей отмеченным требованиям. Обычно это десятые доли микрометра. 4.4. ОСНОВНЫЕ ПРЕИМУЩЕСТВА И НЕДОСТАТКИ ГАЗО-ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ В заключение отметим основные преимущества и недостатки варианта газо-жидкостной хроматографии. Основные преимущества:
Основным недостатком варианта газо-жидкостной хроматографии является возможная высокая летучесть и, следовательно, нестабиль- ность жидких фаз, что затрудняет анализ микропримесей, анализ при высоких температурах, анализ с программированием температуры. 2.8 Двумерная хроматография Улучшение качества разделения компонентов смеси с использованием единственной колонки не безгранично. Во-первых, любая отдельно взятая колонка обладает определённой селективностью, то есть лучше разделяет одну группу компонентов, и хуже — другую. Во-вторых, применение всё более длинных высокоэффективных колонок приводит к увеличению продолжительности анализа. При анализе летучих веществ растительного происхождения приходится иметь дело со смесями, которые невозможно полностью разделить с использованием ни одной из самых современных колонок. В таких случаях можно использовать многомерную хроматографию — разделение на нескольких соединённых друг с другом колонок. Благодаря прогрессу в области приборостроения и изготовления колонок многомерная газовая хроматография стала широко применяться для проведения сложных анализов. Частным случаем многомерной хроматографии является двумерная газовая хроматография (двумерная ГЖХ, англ.: 2D GC, GC х GC), которая появилась как мощный инструментальный метод исследования чуть более 10 лет тому назад [292] и которая находит всё более широкое применение в исследовании летучих растительных веществ [293]. Основные принципы и применение двумерной ГЖХ описаны в обзорах [235, 294, 292]. Общая схема функционирования системы для двумерной газовой хроматографии показана на рис. 2.6-1. Анализируемую пробу через испаритель вводят в колонку 1, в которой происходит первое разделение. Поток, выходящий из колонки, с помощью специального крана-переключателя может направляться либо в детектор 1, либо в специальную ловушку, где происходит в течение определённого времени накопление «вырезаемой» таким образом фракции, которая далее поступает в колонку 2, где происходит второе разделение. Элюат из колонки 2 подаётся в детектор 2. Очевидно, что нет смысла применять две однотипные колонки, и положительный эффект использования двумерного варианта достигается тогда, когда колонка 1 и колонка 2 различаются по селективности. Как правило, колонка 1 используется как предколонка (англ.: precolumn), на которой проводится «грубое» разделение исходной смеси и выделяется более или менее узкая фракция для последующего прецизионного анализа на" колонке 2. Предколонка, как правило, представляет собой обычную капиллярную колонку длиной 10-30 м с малополярной полисилоксановой фазой. Особое значение для исследования летучих веществ растений имеет использование в качестве колонки 2 колонки с хиральной фазой, что открывает широкие возможности прямого энантиоселективного анализа компонентов сложных смесей природных соединений [293]. Двумерная хиральная ГЖХ, благодаря прогрессу в области приборостроения и изготовления колонок, стала широко применяться для проведения анализов смесей очень большой сложности. Пример использования двумерной хираль-ной ГЖХ приведен в разделе 3.9 на с. 136.  Рис. 2.6. Принципиальная схема устройства для двумерной ГЖХ: варианты GC х GC с расположением двух колонок в одном термостате 1 и в разных термостатах 2, а также вариант GC х 2GC 3. Обозначения узлов: И — испаритель, К — колонка, Т — термостат колонок, КР — кран - переключатель потоков, Л — ловушка, Д — детектор (см. пояснения в разделе 2.8). Что касается аппаратурного оформления процесса, то существует два принципиально различных варианта размещения предколонки и основной колонки: в одном термостате (рис. 2.6-1) и в разных термостатах (рис. 2.6-2). В настоящее время производители газо-хроматографического оборудования предлагают готовые простые решения для двумерной хроматографии в виде прибора, у которого обе колонки размещены в одном и том же термостате. Однако такая простота (и выигрыш в цене) достигается за счёт потери гибкости в настройке. Применительно к двумерной хиральной ГЖХ в подавляющем большинстве случаев предколонка и основная колонка с хиральной фазой должны работать в разных температурных режимах для достижения оптимального разделения, чего на практике невозможно достичь с использованием прибора, у которого обе колонки размещаются в одном термостате. Эффективным комбинированным методом является также он-лайн сочетание жидкостной и газовой хроматографии (LC-GC), однако из вестно лишь несколько успешных примеров его применения [295]. При двумерной ГЖХ возникают проблемы с определением истинного времени удерживания и мёртвого времени в обоих измерениях, а также в вычислении индексов удерживания в условиях ввода при постоянном давлении, однако к настоящему времени предложены методы 3. Жидкостная хроматография Жидкостная хроматография это метод разделения и анализа сложных смесей веществ, в котором подвижной фазой служит жидкость. Он применим для разделения более широкого круга веществ, чем метод газовой хроматографии. Это связано с тем, что большинство веществ не обладает летучестью, многие из них неустойчивы при высоких температурах (особенно высокомолекулярные соединения) и разлагаются при переводе в газообразное состояние. Разделение веществ жидкостной хроматографией чаще всего производится при комнатной температуре.  Особенности всех видов жидкостной хроматографии обусловлены тем, что подвижной фазой в ней является жидкость, а сорбция компонентов из газообразного и жидкого элюента протекает по-разному. Если в газовой хроматографии газ-носитель выполняет только транспортную функцию и неподвижной фазой не сорбируется, то жидкая подвижная фаза в жидкостной хроматографии является активным элюентом, его молекулы могут сорбироваться неподвижной фазой. При прохождении через колонку молекулы компонентов анализируемой смеси, находящиеся в элюенте, должны вытеснить молекулы элюента из поверхностного слоя сорбента, что приводит к уменьшению энергии взаимодействия молекул анализируемого вещества с поверхностью сорбента. Поэтому величины удерживаемых объемов VR, пропорциональные изменению свободной энергии системы, в жидкостной хроматографии меньше, чем в газовой, а диапазон линейности изотермы сорбции в жидкостной хроматографии шире. Применяя различные элюенты, можно изменять параметры удерживания и селективность хроматографической системы. Селективность в жидкостной хроматографии в отличие от газовой определяется не одним, а двумя факторами природой подвижной (элюент) и неподвижной фаз. H V Рис.1.9. Зависимость эффективности Н от линейной скорости потока подвижной фазы Жидкая подвижная фаза имеет большую плотность и вязкость, чем газообразная, коэффициенты диффузии Dж на 34 порядка ниже, чем в газе. Это приводит к замедлению массообмена в жидкостной хроматографии по сравнению с газовой. Уравнение Ван-Деемтера в связи с тем, что член В в жидкостной хроматографии роли не играет (Dж Dг), видоизменяется и графическая зависимость эффективности Н от линейной скорости потока подвижной фазы имеет вид, представленный на рис. 1.9.  В классическом варианте колоночной жидкостной хроматографии в стеклянную колонку высотой 1–2 м, заполненную сорбентом с размером частиц 100 мкм и элюентом, вводят анализируемую пробу, растворенную в элюенте, и пропускают элюент, отбирая на выходе из колонки порции элюата. Этот вариант жидкостной хроматографии до настоящего времени применяют в лабораторной практике, но так как скорость прохождения элюента под действием силы тяжести мала, анализ продолжителен. Современный вариант жидкостной хроматографии так называемая высокоэффективная жидкостная хроматография ВЭЖХ использует объемно- и поверхностно-пористые сорбенты с размером частиц 5–10 мкм, нагнетательные насосы, обеспечивающие давление в системе до 400 атм., высокочувствительные детекторы. Быстрый массоперенос и высокая эффективность разделения позволяют использовать ВЭЖХ для разделения молекул (жидкостно-адсорбционная и жидкость-жидкостная распределительная хроматографии), для разделения ионов (ионообменная, ионная, ион-парная хроматография), для разделения макромолекул (эксклюзионная хроматографии). 1.3. УДЕРЖИВАНИЕ И СИЛА РАСТВОРИТЕЛЯ Для того чтобы анализируемые вещества разделялись на колонке, как уже упоминалось выше, коэффициент емкости k' должен быть больше 0, т.е. вещества должны удерживаться неподвижной фазой, сорбентом. Однако коэффициент емкости недолжен быть и слишком большим, чтобы получить приемлемое время элюирования. Если для данной смеси веществ выбрана неподвижная фаза, которая их удерживает, то дальнейшая работа по разработке методики анализа заключается в выборе такого растворителя, который обеспечил бы в идеальном случае различные для всех компонентов, но приемлемо не очень большие k'. Этого добиваются, меняя элюирующую силу растворителя.  В случае адсорбционной хроматографии на силикагеле или оксиде алюминия, как правило, силу двухкомпонентного растворителя (например, гексана с добавкой изопропанола) увеличивают, увеличивая в нем содержание полярного компонента (изопропанола), или же уменьшают, уменьшая содержание изопропанола. Если содержание полярного компонента становится слишком малым (менее 0,1%), следует заменить его более слабым по элюирующей силе. Так же поступают, заменяя на другие либо полярную, либо неполярную составляющую и в том случае, если данная система не обеспечивает желаемой селективности по отношению к интересующим компонентам смеси. При подборе систем растворителей принимают во внимание как растворимости компонентов смеси, так и элюотропные ряды растворителей, составленные разными авторами. Примерно так же подбирают силу растворителя в случае использования привитых полярных фаз (нитрил, амино, диол, нитро и др.), учитывая возможные химические реакции и исключая опасные для фазы растворители (например, альдегиды и кетоны для аминофазы). В случае обращенно-фазной хроматографии силу растворителя увеличивают, повышая содержание в элюенте органической составляющей (метанола, ацетонитрила или ТГФ) и уменьшают, добавляя больше воды. Если не удается добиться желаемой селективности, используют другую органическую составляющую либо пытаются изменить ее с помощью разных добавок (кислот, ион-парных реагентов и др.). При разделениях методом ионообменной хроматографии силу растворителя меняют, увеличивая или уменьшая концентрацию буферного раствора или меняя рН, в некоторых случаях используют модификацию органическими веществами. Однако, особенно в случае сложных природных и биологических смесей, зачастую не удается подобрать силу растворителя таким образом, чтобы все компоненты пробы элюировались за приемлемый срок. Тогда приходится прибегать к градиентному элюированию, т.е. использовать растворитель, элюирующая сила которого в процессе анализа изменяется так, что она постоянно увеличивается по заранее заданной программе. Таким приемом удается добиться элюирования всех компонентов сложных смесей за относительно короткий промежуток времени и их разделения на компоненты в виде узких пиков. 1.6.1. Адсорбционная жидкостная хроматография. Адсорбционная жидкостная хроматография в зависимости от полярности неподвижной и подвижной фаз подразделяется на нормально-фазовую (НФХ) и обращенно-фазовую (ОФХ) хроматографии. В НФХ используют полярный адсорбент и неполярные подвижные фазы, в ОФХ неполярный адсорбент и полярные подвижные фазы, но в обоих вариантах выбор подвижной фазы часто важнее, чем выбор неподвижной. Неподвижная фаза должна удерживать разделяемые вещества. Подвижная фаза, т. е. растворитель, должна обеспечивать различную емкость колонки и эффективное разделение за приемлемое время.  В качестве неподвижной фазы в адсорбционной жидкостной хроматографии применяют полярные и неполярные тонкодисперсные пористые материалы с удельной поверхностью более 50 м2/г. Полярные адсорбенты (SiO2, Al2O3, флорисил и др.) имеют на поверхности слабокислотные группы, способные удерживать вещества с основными свойствами. Эти адсорбенты используют главным образом для разделения неполярных и среднеполярных соединений. Их недостаток высокая чувствительность к содержанию воды в применяемых элюентах. Для устранения этого недостатка полярные сорбенты обрабатывают аминами, диолами и другими реагентами, в результате чего происходит поверхностная прививка этих реагентов, модифицирование поверхности и изменение селективности по отношению к анализируемым веществам. Неполярные адсорбенты (графитированные сажи, диатомит, кизельгур) неселективны к полярным молекулам. Для получения неполярных адсорбентов часто на поверхность, например, силикагеля прививают неполярные группы, например, алкилсилильные SiR3, где R алкильные группы С2 С22. Подвижная фаза должна полностью растворять анализируемую пробу, обладать невысокой вязкостью (чтобы коэффициенты диффузии были достаточно большими), желательно, чтобы из нее было возможно выделить разделенные компоненты. Она должна быть инертной по отношению к материалам всех частей хроматографа, безопасной, дешевой, подходящей для детектора. Подвижные фазы, применяемые в жидкостной хроматографии, различаются по своей элюирующей силе. Элюирующая сила растворителя показывает, во сколько раз энергия сорбции данного элюента на данном адсорбенте больше, чем энергия сорбции элюента, выбранного в качестве стандарта, например н-гептана. Слабые растворители плохо адсорбируются неподвижной фазой, поэтому коэффициенты распределения сорбируемых веществ (сорбата) высокие. Наоборот, сильные растворители адсорбируются хорошо, поэтому коэффициенты распределения сорбата низкие. Растворитель тем сильнее, чем выше растворимость в нем анализируемой пробы, чем сильнее взаимодействие растворитель – сорбат. Для обеспечения высокой эффективности разделения на колонке необходимо подобрать такую подвижную фазу, которая имеет полярность, оптимальную для разделяемой смеси в выбранных условиях разделения. Обычно сначала выбирают неподвижную фазу, которая имеет полярность, близкую к полярности разделяемых компонентов. Затем подбирают подвижную фазу, добиваясь того, чтобы коэффициент емкости k' оказался в интервале от 2 до 5. Если полярность подвижной фазы слишком близка к полярности неподвижной, время удерживания компонентов будет слишком малым, а если полярности подвижной и неподвижной фаз различаются очень сильно, время удерживания становится слишком большим. При подборе подвижных фаз ориентируются на так называемые элюотропные ряды, основанные на применении индексов полярности Снайдера Р', который подразделяет все растворители на сильные (полярные) и слабые (слабополярные и неполярные). В основе шкалы полярности лежит растворимость веществ, используемых в качестве подвижных фаз, в диоксане, нитрометане и этаноле. В таблице 1.2 приведены значения индексов полярности и элюирующей силы (по отношению к SiO2) ряда растворителей, наиболее часто применяемых в жидкостной хроматографии в качестве подвижных фаз. Здесь же указаны коротковолновые границы прозрачности этих растворителей, что облегчает подбор условий детектирования компонентов смеси. Таблица 1.2 |