хроматография-лекции. Хроматографические методы. Общая характеристика методов

• Название: Хроматографические методы. Общая характеристика методов
• Анкор: хроматография-лекции.docx
• Дата: 27.03.2017
• Размер: 6.82 Mb.
• Имя файла: хроматография-лекции.docx
• Тип: Документы; #4243
• страница: 16 из 26

Характеристики растворителей, используемых в жидкостной хроматографии

Растворитель	Индекс полярности	Элюирующая сила (SiO2)	Коротковолновая граница прозрачности
Фторалкан	 –2	–0,2	200
Циклогексан	0,04	0,03	200
н-Гексан	0,1	0,01	195
Тетрахлорметан	1,6	0,11	265
Диизопропиловый эфир	2,4	0,22	220
Толуол	2,4	0,22	285
Диэтиловый эфир	2,8	0,38	215
Дихлорметан	3,1	0,34	230
Тетрагидрофуран	4,0	0,35	210
Хлороформ	4,1	0,26	235
Этанол	4,3	0,68	205
Уксусная кислота	4,4	0,38	255
Диоксан	4,8	0,49	215
Метанол	5,1	0,73	205
Ацетонитрил	5,8	0,50	190
Нитрометан	6,0	0,49	380
Вода	10,2	Высокая	170

В жидкостной хроматографии часто используют не индивидуальные растворители, а их смеси. Часто незначительные добавки другого растворителя, особенно воды, существенно увеличивают элюирующую силу элюента.

При разделении многокомпонентных смесей одна подвижная фаза в качестве элюента может не разделить все компоненты пробы за приемлемое время. В этом случае применяют метод ступенчатого, или градиентного, элюирования, при котором в процессе хроматографирования последовательно используют все более сильные элюенты, что позволяет элюировать сильноудерживаемые вещества за меньшее время.

В жидкостной хроматографии существуют некоторые эмпирические правила, которые очень полезны при выборе элюента:

 сорбция соединения, как правило, увеличивается с ростом в нем количества двойных связей и ОН-групп;

 сорбция уменьшается в ряду органических соединений: кислоты  спирты  альдегиды  кетоны  сложные эфиры  ненасыщенные углеводороды  насыщенные углеводороды;

 для разделения веществ разной полярности и разделения веществ разных классов применяют нормально-фазовую хроматографию: анализируемая проба растворяется и элюируется неполярным элюентом, соединения разных классов выходят из колонки с полярным адсорбентом за разное время, при этом время удерживания соединений с разными функциональными группами увеличивается при переходе от неполярных соединений к слабополярным. Для очень полярных молекул значения времени удерживания так велики, что при использовании неполярного элюента анализ невозможен. Для уменьшения времени удерживания полярных компонентов переходят к полярным элюентам;

 в обращенно-фазовом варианте неподвижная фаза (неполярный адсорбент) сильнее адсорбирует неполярный компонент из полярных элюентов, например из воды;

 снижая полярность элюента добавлением менее полярного растворителя, можно уменьшить удерживание компонентов.
1.6.2. Распределительная жидкостная хроматография. В распределительной или жидкость-жидкостной хроматографии разделение компонентов анализируемой пробы обусловлено различиями в коэффициентах их распределения между двумя не смешивающимися между собой жидкими фазами, одна из которых неподвижная и находится на поверхности или в порах твердого неподвижного носителя, а вторая  подвижная.

По характеру сил взаимодействия, обусловливающих различное распределение между двумя фазами веществ, отличающихся своим химическим строением, распределительная хроматография подобна адсорбционной, т. е. и здесь разделение основано на различии в силах межмолекулярного взаимодействия компонентов анализируемой пробы с неподвижной и подвижной жидкими фазами.

В зависимости от техники выполнения распределительная хроматография, как и адсорбционная, может быть колоночной или плоскостной (бумажной или тонкослойной).

В качестве твердых носителей используют вещества, индифферентные по отношению к подвижному растворителю и компонентам анализируемой пробы, но способные удерживать на поверхности и в порах неподвижную фазу. Чаще всего в качестве носителей применяют полярные вещества (целлюлозу, силикагель, крахмал). На них наносят неподвижную фазу  полярный растворитель, чаще всего воду или спирт. В качестве подвижных фаз в этом случае используют менее полярные или неполярные вещества (спирты, амины, кетоны, углеводороды и др.). Такой вариант распределительной хроматографии называется нормально-фазовым. Он применяется для разделения полярных веществ.

Второй вариант распределительной хроматографии отличается тем, что в качестве неподвижной твердой фазы используют неполярные носители (резину, фторопласт, гидрофобизированный силикагель), в качестве неподвижной жидкой фазы  неполярные растворители (углеводороды), а в качестве подвижной жидкой фазы  полярные растворители (спирты, альдегиды, кетоны и др., часто вода). Этот вариант распределительной хроматографии называется обращенно-фазовой и используется для разделения неполярных веществ.

Для достижения оптимального разделения компонентов анализируемой пробы очень важное значение имеет подбор подвижной фазы. Растворители (подвижные и неподвижные жидкие фазы) должны подбираться так, чтобы коэффициенты распределения компонентов смеси различались достаточно существенно. К жидким фазам предъявляются следующие требования:

1) используемые растворители должны хорошо растворять разделяемые вещества, причем их растворимость в неподвижной фазе должна быть больше, чем в подвижной;

2) растворители, используемые в качестве подвижной и неподвижной фаз, должны быть взаимонасыщаемы, т. е. состав растворителя должен быть постоянным во время прохождения через колонку;

3) взаимодействие растворителей, используемых в качестве подвижной фазы, с неподвижной фазой должно быть минимальным.



Чаще всего в распределительной жидкостной хроматографии в качестве подвижных жидких фаз применяют не индивидуальные вещества, а их смеси в различных соотношениях. Это позволяет регулировать полярность подвижной фазы, изменять соотношение полярностей подвижной и неподвижной фаз и добиваться оптимальных условий разделения компонентов конкретной анализируемой смеси.

Существенным недостатком этого хроматографического метода является достаточно быстрое смывание нанесённой неподвижной жидкой фазы с носителя. Для его устранения растворитель, используемый в качестве подвижной фазы, насыщают веществом, применяемым в качестве неподвижной жидкой фазы, или стабилизируют неподвижную жидкую фазу прививкой ее к носителю.

Разновидностью распределительной жидкостной хроматографии является широко используемый метод ВЭЖХ.





Самыми распространенными хроматографическими системами являются системы, имеющие модульный принцип сборки. Насосы, дегазирующие устройства, детекторы, дозаторы (автосамплеры), термостаты для колонок, коллекторы фракций, блоки управления хроматографической системой и регистрирующие устройства выпускаются в виде отдельных модулей. Широкий выбор модулей позволяет гибко решать различные аналитические задачи, быстро менять при необходимости конфигурацию системы с минимальными расходами. Вместе с тем выпускаются и мономодульные (интегрированные) ЖХ, главным преимуществом которых является миниатюризация отдельных блоков, компактность прибора.

В зависимости от способа элюирования жидкостные хроматографы делятся на изократические и градиентные.

 Схема изократического хроматографа
 

 

Подвижная фаза из емкости (1) через входной фильтр (9) подается прецизионным насосом высокого давления (2) в систему ввода образца (3) - ручной инжектор или автосамплер, туда же вводится проба. Далее, через in-line фильтр (8), образец с током подвижной фазы поступает в элемент (элементы) разделения (4) - через предколонку в разделительную колонку. Затем, элюат поступает в детектор (5) и удаляется в сливную емкость (7). При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на аналоговый регистратор (самописец) (6) или иную систему сбора и обработки хроматографических данных (интегратор или компьютер). В зависимости от конструкции функциональных модулей управление системой может осуществляться с клавиатуры управляющего модуля (как правило насоса или системного контролера), с клавиатур каждого из модулей системы или производиться управляющей программой с персонального компьютера.

В случае градиентного элюирования используются два принципиально различных типа жидкостных хроматографов. Они отличаются точкой формирования градиента состава подвижной фазы.

Схема градиентного хроматографа с формированием градиента состава подвижной фазы на линии низкого давления.



 

Подвижная фаза из емкостей (1) через входные фильтры (9) и программатор градиента (10) подается прецизионным насосом высокого давления (2) в систему ввода образца (3) - ручной инжектор или автосамплер, туда же вводится проба. Работой клапанов программатора градиента управляет либо управляющий модуль системы (насос или контроллер), либо управляющая программа ПК. Системы такого типа формируют бинарный, трехмерный и четырехмерный градиент. Форма функции отработки градиента зависит от конкретного управляющего модуля или программы управления, а также функциональных возможностей управляемых и управляющих модулей. Далее, через in-line фильтр (8), образец с током подвижной фазы поступает в элемент (элементы) разделения (4) - через предколонку в разделительную колонку. Затем, элюат поступает в детектор (5) и удаляется в сливную емкость (7). При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на аналоговый регистратор (самописец) (6) или иную систему сбора и обработки хроматографических данных (интегратор или компьютер). В зависимости от конструкции функциональных модулей управление системой может осуществляться с клавиатуры управляющего модуля (как правило, насоса или системного контролера), или производиться управляющей программой с персонального компьютера. В случае управления управляющим модулем возможно независимое управление детектором с его собственной клавиатуры.

Несмотря на кажущуюся привлекательность таких систем (в них используется всего лишь один прецизионный насос высокого давления), данные системы обладают рядом недостатков, среди которых основным, пожалуй, является жесткая необходимость тщательной дегазации компонентов подвижной фазы еще до смесителя низкого давления (камеры программатора градиента). Она осуществляется с помощью специальных проточных дегазаторов. Из-за этого факта стоимость их становится сравнимой с другим типом градиентных систем - систем с формированием состава градиента подвижной фазы на линии высокого давления.

Принципиальным отличием систем с формированием состава градиента подвижной фазы на линии высокого давления является смешение компонентов в линии высокого давления, естественно, что при данном подходе количество прецизионных насосов определяется количеством резервуаров для смешивания подвижной фазы. При таком подходе требования к тщательности дегазации компонентов существенно снижаются.

 

Схема градиентного хроматографа с формированием градиента состава подвижной фазы на линии высокого давления.



Подвижная фаза из емкостей (1) через входные фильтры (9) подается прецизионными насосами высокого давления (2 и 11) через статический или динамический смеситель потока (10) в систему ввода образца (3) - ручной инжектор или автосамплер, туда же вводится проба. Работой управляемых насосов управляет либо управляющий модуль системы (насос “master pump” или контроллер), либо управляющая программа ПК. В этом случае все насосы являются управляемыми. Системы такого типа формируют бинарный или трехмерный градиент. Форма функции отработки градиента зависит от конкретного управляющего модуля или программы управления, а также функциональных возможностей управляемых и управляющих модулей. Далее, через in-line фильтр(8), образец с током подвижной фазы поступает в элемент (элементы) разделения (4) - через предколонку в разделительную колонку. Затем элюат поступает в детектор (5) и удаляется в сливную емкость (7). При протекании элюата через измерительный контур детектора происходит регистрация хроматограммы и передача данных на аналоговый регистратор (самописец) (6) или иную систему сбора и обработки хроматографических данных (интегратор или компьютер). В зависимости от конструкции функциональных модулей управление системой может осуществляться с клавиатуры управляющего модуля (как правило, насоса или системного контролера), или производиться управляющей программой с персонального компьютера. В случае управления управляющим модулем возможно независимое управление детектором с его собственной клавиатуры.

Предложенные схемы являются достаточно упрощенными. В состав систем могут быть включены дополнительные устройства - термостат колонок, системы постколоночной дериватизации, системы пробоподготовки и концентрирования образца, рециклер растворителя, мембранные системы подавления фоновой электропроводности (для ионной хроматографии), дополнительные защитные системы (фильтры, колонки) и т.д. На схемах, также отдельно не показаны манометрические модули. Как правило, эти устройства встраиваются в насосные блоки. Эти блоки могут объединять в себе несколько насосов, насос с программатором градиента, а также общий системный контроллер. Структура системы зависит от ее комплектации и каждого конкретного производителя.

Такое радикальное усложнение технического сопровождения хроматографического процесса приводит к возникновению ряда требований к свойствам подвижной фазы, отсутствующих в классической колоночной и планарной хроматографии. Жидкая фаза должна быть пригодна для детектирования (быть прозрачной в заданной области спектра или иметь низкий показатель преломления, определенную электропроводность или диэлектрическую проницаемость и т.д.), инертна к материалам деталей хроматографического тракта, не образовывать газовых пузырей в клапанах насоса и ячейке детектора, не иметь механических примесей.



В жидкостной хроматографии используют множество типов насосов. При ЖХ низкого  давления зачастую используют перистальтические насосы (Рис.1).



Рис.1 Програмируемый перистальтический насос MasterFlex.

При ВЭЖХ для обеспечения расхода подвижной фазы через колонку с указанными параметрами используются насосы высокого давления.

К наиболее важным техническим характеристикам насосов для ВЭЖХ относятся: диапазон расхода; максимальное рабочее давление; воспроизводимость расхода; диапазон пульсаций подачи растворителя.

По характеру подачи растворителя насосы могут быть постоянной подачи (расхода) и постоянного давления. В основном при аналитической работе используется режим постоянного расхода, при заполнении колонок - постоянного давления.

По принципу действия насосы для ВЭЖХ делятся на шприцевые и на плунжерныевозвратно-поступательные.

               

Шприцевые насосы

Основной отличительной особенностью данных насосов является цикличность их работы, в связи с чем хроматографы, в которых применяются данные насосы, также отличаются цикличностью работы.



Рис. 2. Принципиальное устройство шприцевого насоса для ВЭЖХ.



Рис. 2А. Шприцевой насос.

Блок управления БУ подает напряжение на двигатель Д, определяющее скорость и направление его вращения. Вращение двигателя с помощью редуктора Р преобразуется в перемещение поршня П внутри цилиндра Д. Работа насоса осуществляется в 2 цикла. В цикл заполнения клапан К2 закрыт, К1 - открыт, растворитель поступает из резервуара в цилиндр Ц. В режиме подачи клапан К1 закрыт, а через клапан К2 подвижная фаза поступает в дозирующее устройство.

Для насосов этого типа характерно практически полное отсутствие пульсаций потока подвижной фазы в ходе работы.

Недостатки насоса:

а)  большой расход времени и растворителя на промывку при смене растворителя;

б) ограниченный объемом шприца объем ПФ, а следовательно ограниченное время разделения;

в) приостановка разделения во время заполнения насоса;

г) большие габариты и вес при обеспечении большого расхода и давления (нужен
мощный двигатель и большое усилие поршня с его большой площадью).

 

Плунжерные возвратно-поступательные насосы.

 



Рис. 3. Принципиальное устройство плунжерного насоса.

Принцип действия.

Двигатель Д через редуктор Р приводит в возвратно-поступательное движение плунжер П, перемещающийся в рабочей головке насоса. Клапаны К1 и К2 открываются, когда насос находится в фазе всасывания и подачи соответственно. Величина объемной подачи определяется тремя параметрами: диаметром плунжера (обычно 3.13; 5.0; 7.0 мм), его амплитудой (12-18 мм)и частотой(что зависит от скорости вращения двигателя и редуктора).



Насосы этого типа обеспечивают постоянную объемную подачу подвижной фазы длительное время. Максимальное рабочее давление 300-500 атм, расход 0.01-10 мл/мин. Воспроизводимость объемной подачи -0.5%. Основной недостаток - растворитель подается в систему в виде серии последовательных импульсов, поэтому существуют пульсации давления и потока (Рис.4). Это является основной причиной повышенного шума и снижения чувствительности почти всех детекторов, применяемых в ЖХ, особенно электрохимического.



 

Рис.4. Пульсации плунжерного насоса.