хроматография-лекции. Хроматографические методы. Общая характеристика методов

• Название: Хроматографические методы. Общая характеристика методов
• Анкор: хроматография-лекции.docx
• Дата: 27.03.2017
• Размер: 6.82 Mb.
• Имя файла: хроматография-лекции.docx
• Тип: Документы; #4243
• страница: 20 из 26

5. СОВРЕМЕННЫЕ ЗАДАЧИ СФХ С НАСАДОЧНЫМИ КОЛОНКАМИ

Долгое время с помощью сверхкритической флюидной хроматографии решались преимущественно задачи разделения энантиомерных смесей слабо- и среднеполярных органических соединений в нормально-фазовом режиме. Но по мере выявления хроматографистами инструментальных преимуществ, возникающих при переходе на СФХ, сформировался тренд на расширение областей ее применения. Выгоды, связанные с экономией дорогих органических элюентов, отсутствием необходимости иметь дело с большими количествами отработанных жидкостей, 3—5-кратным увеличением скорости элюирования, дают столь заметный эффект, что желание применять его при решении как можно большего числа задач абсолютно естественно. Основным ограничением здесь является низкая растворимость полярных субстанций в сверхкритическом диоксиде углерода. Подходы к решению этой проблемы сводятся к четырем базовым приемам:

• 
  использование более полярного флюида;
  
• 
  использование более полярных сорастворителей;
  
• 
  деактивация неподвижной фазы;
  
• 
  использование полярных динамических модификаторов.
  

Первый прием, как уже обсуждалось, в настоящее время не рассматривается как магистральная траектория развития СФХ. Сочетание физико-химических, экономических и экологических характеристик СО2-СФХ таково, что альтернативы в обозримом будущем не предвидится. Возможности второго пути в значительной степени отработаны, так как наиболее полярным растворителем, способным неограниченно смешиваться с СК-СО₂, является метанол, и большая часть того, что может быть сделано с использованием этой смеси, уже реализовано. Деактивация неподвижной фазы также не работает в данном случае. Поскольку при разделении полярных субстанций в СФХ реализуется нормально-фазовый механизм разделения, то уменьшение полярности колонок не позволит добиться приемлемых величин эффективности. Напротив, использование четвертого приема приводит к весьма впечатляющим результатам и сулит большие перспективы в отношении расширения сфер применимости сверхкритической хроматографии.

Динамическая модификация — хроматографический прием, заключающийся во введении малого количества (доли процента) активного вещества, которое прочно адсорбируется на неподвижной фазе и изменяет механизмы взаимодействия аналита с сорбентом, аналита с элюентом и элюента с сорбентом. Это вещество называется динамическим модификатором (ДМ). Данный подход, как и многое другое, пришел в СФХ из практики ВЭЖХ. Как правило, динамическими модификаторами в распределительной хроматографии являются кислоты и основания средней силы, но бывают и иные субстанции, используемые в качестве ДМ. Роль ДМ в СФХ, как и роль сорастворителей, сложна и не сводится к кэппированию остаточных силанольных групп на колонках или к подавлению кислотного либо основного сольволиза аналита в мобильной фазе. 0ни также способны изменять растворяющую способность флюида по отношению к анализируемым объектам, модифицировать преимущественный тип удерживания веществ на колонке, формировать ионные пары с ионными аналитами, альтернировать энантиоселек-тивность и пр. Наиболее распространенные группы ныне используемых динамических модификаторов:

• 
  основания — триэтиламин, диэтиламин, изопропиламин;
  
• 
  кислоты — трифторуксусная, алкилсульфоновые, лимонная;
  
• 
  соли — ацетат аммония, алкилсульфонат натрия.
  

Динамическая модификация, проходящая непосредственно в ходе эксперимента, обратима в отличие от химической, которая проводится предварительно. Тщательная промывка сорбента после элюирования подвижной фазой, свободной от модификатора, как правило, позволяет полностью восстановить первоначальные характеристики колонки. Ниже мы кратко обсудим ряд групп профессора Тейлора в Virginia Tech последних достижений в области применения динамической модификации в СФХ для разделения полярных субстанций.
6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СФХ — мощный хроматографический инструмент, находящий все более широкое применение как в препаративной практике, так и в аналитической. Его преимущества перед высокоэффективной жидкостной хроматографией базируются на свойствах диоксида углерода в конденсированном состоянии, которые в случае возможности элюирования рассматриваемого аналита в условиях СФХ делают эту технику предпочтительным выбором хроматографиста. Долгое время рассматривавшаяся как нормально-фазовая хроматография для разделения исключительно слабополярных энантиомерных смесей, в последнее время СФХ получила мощный импульс к развитию благодаря всестороннему внедрению различных методов динамического модифицирования, которые позволили расширить область ее применимости на целый круг задач, ранее казавшихся недоступными для метода со столь неполярной подвижной фазой. Дальнейшее развитие метода в этом направлении в сочетании c работой по увеличению чувствительности детектирования в СФХ способно привести к существенному вытеснению позиций ВЭЖХ не только в сфере препаративного разделения, но и в области тонкого химического анализа.

1.8.3. Хроматографические колонки.

В практической жидкостной хроматографии применяют обычные аналитические колонки диаметром 3–5 мм и длиной 5–25 см и микроколонки диаметром 0,51 мм и длиной от 5 до 10 см. Большинство стандартных колонок длиной 2530 см заполнены сорбентом с размером частиц 510 мкм, число теоретических тарелок в них может достигать (510)  10³ по неудерживаемому компоненту.

Колонку заполняют и закрывают с обеих сторон металлокерамическими фильтрами (фриттами) для предотвращения высыпания сорбента. Один из вариантов заполнения колонок заключается в создании суспензии подходящего сорбента. Чтобы полностью удалить суспендирующую жидкость и уплотнить насадку, колонку некоторое время промывают элюентом при повышенном давлении. Этот метод получил название метода сбалансированной плотности. Особенно сложен процесс создания обращенно-фазных колонок, и главная опасность при этом заключается в неоднородности упаковки. При заполнении колонок такими сорбентами возникает большой электрокинетический потенциал, а так как привитые сорбенты являются диэлектриками, то на их поверхности скапливается избыточный заряд, «расталкивающий» частицы. Для снятия заряда в суспензию добавляется электролит (ацетат натрия).

Между дозатором и жидкостной аналитической колонкой помещается предколонка, заполненная тем же сорбентом, что и основная, и предохраняющая основную колонку от влаги и сильносорбирующихся примесей (это особенно важно при анализе биологических объектов).

Поскольку разделение компонентов анализируемой пробы в газовом хроматографе в абсолютном большинстве проводится при повышенных температурах, газовые хроматографические колонки помещаются в камеру термостатирования, в которой заданная температура колонки должна поддерживаться с точностью 0,10,5^оС, а иногда и точнее.

Хроматографические колонки для жидкостной хроматографии рассчитаны, в основном, на комнатную температуру. Однако в ряде случаев, например при анализе полимерных систем, необходимо работать при повышенных температурах (для увеличения растворимости полимеров в подвижной фазе). Максимальная рабочая температура для силикагелевых колонок составляет 120°С, а для модифицированных сорбентов на основе силикагеля  80°С. В последнее время успешно развивается метод высокотемпературной жидкостной хроматографии (от 100 до 200°С), налажен выпуск соответствующей аппаратуры.

Выход колонки соединен с детектором. Особенностью жидкостной хроматографии является то обстоятельство, что она почти всегда сочетает разделение с препаративным выделением разделенных фракций. Поэтому выход колонки во многих случаях соединяется также и с коллектором фракций.

Коллектор фракций включает узел распределения, блок перемещения пробирок, кассету с пробирками и систему автоматизации всего процесса сбора фракций. При выполнении анализа через заданные временные интервалы происходит перемещение пробирок для сбора фракций. Число пробирок в различных коллекторах фракций составляет 100200.
Устройство колонок

В связи с вышеперечисленными методами колонки для жидкостной хроматографии (КЖХ) выполняются из высокопрочных устойчивых к действию агресивных сред металлов (легированной стали, титана и т.д.) или из кварцевого стекла с полированными внутренними стенками. Реже выпускают колонки изготовленные из химически стойких пластиков. Как уже отмечалось, существует множество типов колонок: для хроматографии низкого и высокого давления;  для аналитической, препаративной или промышленной хроматографии; для радиальной или аксиальной хроматографии. Также колонки подразделяют на неразборные  (упакованные в заводских условиях) и  разборные с подвижными и не подвижными адапторами. Каждый тип колонки имеет свои конструкционные особенности. Ниже будут описаны основные составные части  КЖХ и, по возможности,  конструкционные отличия основных типов.
Конструкционно КЖХ состоит из обязательных частей: трубки и адапторов, и не обязательных частей: рубашки термостата, гидравлической системы для упаковки колонки и т.д.

Неразборные колонки

Данный тип колонок в основном используется в аналитической высокоэффективной жидкостной хроматографии, так как данный метод в основном используется для качественного и количественного анализа, при котором особенно важна воспроизводимость результатов. Наилучшим способом достижения данного результата является использование масштабного фабричного поризводства унитарных колонок со строго соблюдаемыми параметрами всех комплектующих. На рынке представлено огромное количество колонок данного типа  различных производителей очень высокого качества, различающимися, главным образом, используемыми в них сорбентами. Не смотря на то, что многие фирмы предлагают примерно одинаковый спектр КЖХ как по физическим размерам колонок, так и по заявленному составу неподвижной фазы, тем не менее именно новшества, привносимые каждой фирмой в производство своих сорбентов иногда приводят к очень значительным различиям по селективности, долговечности и воспроизводимости на конкретных смесях.
Поэтому при подборе ЖКХ для анализа конкретной смеси необходимо:
1) определиться с типом будущего хроматографического анализа (нормальнофазная или обращеннофазная. или ионообменная и т.д.);
2) провести сравнительные тесты колонок различных производителей с выбранным типом сорбента.
Конструктивно данные колонки представляют собой трубки из не подверженных коррозии сплавов (Рис. 1) или пластика в которые запрессован сорбент. С двух сторон колонки имеют резьбовые отверстия с коническим углублением для фитингов. Внутренний диаметр от 1  до 10 мм, длина 10-400 мм.



Рис. 1. Аналитические колонки для ВЭЖХ.


К данному типу КЖХ также можно отнести колонки (картриджи) для проведения двердофазной экстракции и схожие с ними по принципу  картриджи для выделения нуклеиновых килот. Принципиальным отличием данных колонок от применяемых в аналитических хроматогрофах является черезвычайно малое количество (от десятков до сотен миллиграмм) адсорбционного материала, размещенного в ячейке с большим соотношением диаметр/длина. Смыв аналитов с адсорбента осуществляется сравнительно небольшим объемом растворителя (в пределах десяти миллилитров), что дает возможность сильно сконцентрировать аналит, но не позволяет провести полноценную хроматографию.

Разборные колонки

Как ясно из названия колонки данного типа разбираются на составные части: на трубку и адапторы. Это свойство позволяет самостоятельно заполнять колонки  необходимым сорбентом. Практически все колонки для хроматографии низкого давления производятся именно в таком исполнении, как аналитические, так и препаративные. В ВЭЖХ данный вид колонок применяется в высокопроизводительных хроматографах (препаративных и промышленных). Адапторы бывают подвижные и не подвижные, и колонки, в зависимости от исполнения бывают с двумя неподвижными адапторами, с одним подвижным и одним неподвижным адапторам (самая распространенная комплектация) и с двумя подвижными адапторами.

Адапторы

Для удержания сорбента, поддержания постоянного внутреннего объема и создания равномерного и ламинарного потока ПФ через все поперечное сечение колонки используются адапторы.

Подвижные адапторы используются для регулирования внутреннего объема колонки. Принципиальная конструкция подвижного адаптора для аксиальных колонок представлена на риунке 2.




Рис. 2. Конструкция   адаптера. 1— корпус; 2— фильтр (мембрана); 3— прижим; 4— уплотнительное кольцо; 5 — уплотнение трубки; 6 — гайка прижима;   7— трубка для поступления (выхода) ПФ.

Материалы колонки

Материалы из которых выполнены составные части адаптора различаться могут сильно различаться в зависимости от цели и условий хроматографии. Так при ВЭЖХ практически все части как адапторов (даже мембрана), так и колонки выполняются из металла. При хроматографии низкого давления колонка зачастую выполняется из стекла, а детали адаптора из химически стойкой пластмассы (полиэтилена, тефлона и т.д.).

Набивка колонки

Набивка колонки - очень ответственный процесс, от качества выполнения которого практически полностью зависит успех дальнейшего эксперимента. Основной опасностью при набивке являются неоднородности, которые могут образоваться по разным причинам и привести к размыванию пиков и, в конечном итоге, к неудовлетварительному результату хроматографии. Неоднородности могут образовываться от:

1) неравномерного заполнения колонки в результате слишком быстрого осаждения сорбента или неравномерности осаждающего потока;

2) посторонних включений в сорбент (пузырьки воздуха, грязь, колонии микроорганизмов и т.д.);

3) неоднородности размеров гранул сорбента.

Для недопущения неравномерного заполнения колонки необходимо заполнять колонку однородной, свежеприготовленной  суспензией постепенно добавляя новые порции суспензии до заполнения сорбентом требуемого объема колонки, после этого следует установить верхний адаптор не допуская образования пузырьков воздуха и пустить поток подвижной фазы для окончательного осаждения сорбента. Следует отметить, что для достижения нужного результата обязательным условием является чистота мембран и одинаковая проницаемость по всей площади.

Посторонние включения такие как грязь и колонии микроорганизмов образуются в результате неправильных условий хранения или неправильной регенерации сорбента и предупреждаются только полным соблюдением регламента или заменой сорбента. Пузырьки воздуха могут образовываться в двух случаях: при слишком интенсивном суспензировании или при неаккуратном вливании суспензии в колонку. В обоих случаях происходит расплескивание суспензии и таким образом происходит захват трудноотделимых пузырьков. Зачастую, в данном случае необходимо перенабивать колонку.

Неоднородноти размеров гранул встречаются при использовании сорбентов старых марок, экспериментальных сорбентов или использованных ранее сорбентов, в которых присутствует мелкодисперсная фракция разрушенных гранул. При всех приведенных случаях необходимо производить отмучивание (декантацию) суспензии.  Для этого разбавленную суспензию набухшего, промытого и переведенного в нужный буфер (см. ниже) сорбента заливают доверху в мерный цилиндр, объем которого в 5—6 раз больше, чем объем упакованного влажного сорбента, и дают ему осесть до того момента, когда между слоем сорбента и мутной жидкостью над ним обозначится резкая граница. Гранулы смолы или сефадексов оседают относительно быстро — за несколько минут (в зависимости от их среднего размера), а целлюлоза — медленнее (за 10—30 мин). Жидкость над осадком вместе со взвешенными в ней мелкими частицами отсасывают и отбрасывают. Снова дополняют цилиндр буфером, осторожно палочкой взмучивают осадок по всему объему цилиндра и повторяют описанную операцию до тех пор (3—5 раз), пока жидкость над только что образовавшимся осадком не будет совершенно прозрачной. Затем выжидают еще некоторое время (до полного оседания слоя сорбента), измеряют его высоту линейкой и отсасывают буфер — на этот раз не полностью, а до такого уровня, чтобы слой жидкости составлял половину высоты осадка. Такое соотношение при взмучивании позволяет получить кашицу («slurry»), консистенция которой наиболее удобна для заливки в колонку.

В преперативной хроматографии (особенно ВЭЖХ) для забивки колонки используют гидравлические системы, позволяющие равномерно уплотнять сорбент и удерживать его в заданном объеме во время хроматографии. В этом случае, для достижения оптимального результата необходимо строго придерживаться руководства производителя по используемому при упаковке давлению на сорбент. В случае отклонений от заданных условий упаковки может произойти или пережатие сорбента (при превышении давления), или образовываться полотсти (при меньшем давлении).



1.8.6. Детекторы, используемые в жидкостных хроматографах.

Основные типы детекторов для ЖХ

 Фотометрические детекторы

Ультрафиолетовый детектор

Рефрактометрический детектор

Интерферометрический детектор

Флуориметрический детектор

Электрохимические детекторы

Вольтамперометрический детектор

Потенциометрический детектор

Полярографический детектор

Кулонометрический детектор