Саидов М.С. и соавт. Практикум по мед. микробиологии и вирусолог. Исследование при стафилококковых инфекциях(по Борисову Л. Б., 2001)
 Скачать 1.14 Mb.
|
|
ТЕМА: СПИРОХЕТОЗЫ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА СИФИЛИСА. Цель: изучить методы диагностики сифилиса. Спирохеты – тонкие, подвижные бактерии, которые имеют форму спирали с различным числом завитков и длиной 3-500мкм. Протоплазма их спирохетообразно обвита вокруг эластической осевой нити, за счет сокращения которой происходит движение спирохет. Различают поступательное, вращательное и маятникообразные движения спирохет. Обобщающее название заболеваний вызываемых спирохетами – спирохетозы. Спирохеты относятся к семейству Spirochetaceaе. Медицинское значение имеют представители родов Treponema, Borrelia и Leptospira. Трепонемы являются возбудителями сифилиса, фрамбезии. Боррелии вызывают эпидемический и эндемический возвратные тифы, а также болезнь Лайма. Лептоспиры вызывают лептоспирозы – зоонозные заболевания с преимущественным фекально-оральным механизмом передачи, с поражением печени, почек, ЦНС, с общей лихорадкой и интоксикацией. (Табл.24) Таблица 24 Возбудители спирохетозов
Сифилис - венерическая, антропонозная инфекционная болезнь, характеризующаяся первичным аффектом, высыпанием на коже и слизистых оболочках с последующим поражением различных органов и систем. Возбудитель сифилиса - Treponema pallidum (бледная спирохета) был открыт в 1905 году Ф.Шаудином и Э.Гофманом. Бледная трепонема имеет извитую форму с 8-14 равномерными завитками и длиной 6-12 мкм. Спор и капсул не образует. Трепонема по Романовскому-Гимзе окрашивается в слабо-розовый цвет. Бледная трепонема анаэроб. Плохо культивируется даже на специальных средах. Трепонемы очень требовательны к питательным средам и на обычных средах не растут. Выращивается на среде с кроличьей сывороткой и кусочком мозговой ткани, залитой вазелиновым маслом (среда Аристовского-Гельцера). Выросшие на средах трепонемы утрачивают характерную форму, а также иммуногенность и патогенность (трепонемы Рейтера). Тканевые трепонемы, обнаруживаемые в твердом шанкре человека, поддерживают в пассажах на кроликах, заражая их под кожу мошонки или в паренхиму яичка. Тканевые трепонемы (трепонемы Никольса) сохраняют патогенность. Возбудитель не устойчив к факторам окружающей среды. При нагревании до 600С быстро погибает. Под действием антибиотиков (пенициллина) образует L-формы. Сифилис антропонозное заболевание. Источником инфекции является только человек. Заражение сифилисом происходит половым путем, реже бытовым – через посуду и предметы общего пользования. Вследствие внутриутробного заражения плода возможен врожденный сифилис. Инкубационный период равен 3-4 неделям. В течении заболевания различают первичный, вторичный и третичный периоды болезни. Первичный период характеризуется появлением на месте внедрения возбудителя твердого шанкра – безболезненной язвы с плотными краями и основанием, мясо – красного цвета со скудным отделяемым, увеличиваются ближайшие к шанкру лимфоузлы, -первичный комплекс. Длится первичный сифилис 6-7 недель. Затем твердый шанкр заживает и через 2-3 недели от момента возникновения шанкра в крови появляются противосифилитические антитела – серопозитивный сифилис. Затем наступает вторичный период, который характеризуется появлением на коже и слизистых розеолезно-папулезных высыпаний, а также везикул и пустул, в которых также могут быть обнаружены трепонемы, хотя и реже чем в твердом шанкре. Через 3-4 года развивается третичный сифилис, при котором в подкожной клетчатке, внутренних органах, костях образуются гуммы. В гуммах бледные спирохеты не обнаруживаются. У некоторых лиц болезнь заканчивается развитием прогрессивного паралича и спинной сухотки в результате поражения ЦНС. Микробиологическая диагностика сифилиса включает как бактериоскопическое так и серологические исследования. Бактериоскопическое исследование проводят при первичном сифилисе (твердом шанкре) и заключается в микроскопии мазков из тканевой жидкости для обнаружения трепонем. Начиная с 4-5-й недели от момента возникновения твердого шанкра, когда начинается серопозитивный период сифилиса, берут кровь для постановки серологических реакций: РСК – реакции Вассермана, реакции микрокпреципитации, реакции Кана (флокуляционный тест), РПГА, РИФ, ИФА, РИТ и др. Серологические реакции для диагностики сифилиса делятся на отборочные (скрининговые) и подтверждающие. К отборочным тестам относятся реакция Вассермана, микропреципитации, флокуляционные тесты и РПГА с неспецифическим кардиолипиновым антигеном. Эти реакции применяются при массовых обследованиях населения. Эти реакции становятся отрицательными после проведенных курсов лечения и используются для оценки эффективности лечения. При постановке РИФ, РИТ, РПГА, ИФА в качестве антигена используется специфический трепонемный антиген - антиген из трепонем, выращенных в яичке кролика. Это высокочувствительные и высокоспецифичные тесты используются для подтверждения диагноза. Эти реакции остаются положительными и после проведенного лечения и поэтому не могут быть использованы для оценки эффективности лечения. Самостоятельная работа Разобрать схему микробиологической диагностики сифилиса. Микроскопировать и зарисовать готовый препарат из трепонем (окраска по Романовскому-Гимзе). Поставить реакцию микропреципитации для диагностики сифилиса, дать заключение. Произвести учет реакции связывания комплемента (реакции Вассермана) по демонстрационному материалу. Указания к самостоятельной работе 1. Бактериоскопическое исследование наиболее эффективно при первичном сифилисе. Исследуют материал из твердого шанкра. Препарат фиксируют в смеси Никифорова, окрашивают по Романовскому-Гимзе. Используют и темнопольную микроскопию неокрашенных препаратов. Во втором периоде заболевания исследуют материал из кожных высыпаний, но обнаружить в них материал удается редко. Реакция микропреципитации. Осадочные реакции просты в постановке. Обладают высокой специфичностью и чувствительностью. Для постановки необходимо иметь исследуемую сыворотку крови и неспецифический кардиолипиновый антиген. Реакция Вассермана Для постановки реакции связывания комплемента при подозрении на сифилис необходимы следующие компоненты: 1. Исследуемая инактивированная сыворотка больного в разведении 1:5. 2. Неспецифический антиген - (кардиолипиновый антиген) 3. Комплемент - в качестве комплемента используют сыворотку морской свинки. Комплемент берут в рабочей дозе. 4. Гемолитическая система - это смесь гемолитической сыворотки и эритроцитов барана. Реакцию Вассермана ставят по общепринятой методике РСК (табл. 25). Таблица 25 Схема постановки реакции Вассермана
Инкубация при t 370 С - 40 минут
Инкубация при t 370 С - 40 минут
Отсутствие гемолиза в опытной пробирке свидетельствует о положительной реакции Вассермана. Наличие гемолиза в опытной пробирке соответственно трактуется как отрицательная реакция Вассермана. Учет результатов реакции производится по 4+ системе. ++++ - резко положительная реакция (полная задержка гемолиза); +++ - положительная реакция; ++ - слабо положительная реакция; + - сомнительная реакция; Полный гемолиз – отрицательная реакция. Вопросы для самоконтроля Какие Вы знаете спирохетозы? Каковы морфологические признаки патогенных спирохет? Методы окраски спирохет. Источник инфекции и пути передачи сифилиса. Клинические стадии сифилиса. Перечислите методы микробиологической диагностики сифилиса. В чем заключается бактериоскопический метод диагностики? Объясните механизм реакции Вассермана и осадочных реакций. Какие антигены применяются при постановке серологических реакций для диагностики сифилиса? Назовите антибиотики и химиопрепараты для лечения сифилиса. Существуют ли методы специфической профилактики сифилиса? Занятие 18 ТЕМА: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА РИККЕТСИОЗОВ И ХЛАМИДИОЗОВ. Цель: изучить методы микробиологической диагностики риккетсиозов и хламидиозов. Риккетсии - это грамотрицательные неподвижные бактерии, выделенные в отдельный порядок Rickettsiales, отличаются облигатным внутриклеточным паразитизмом. Риккетсии получили свое название в честь американского микробиолога Т. Риккетса, который открыл возбудителя лихорадки “скалистых гор” в 1909 году. Риккетсии полиморфны, образуют кокковидные, палочковидные, бациллярные, нитевидные формы. Размножаются поперечным делением или дроблением нитевидных форм. Спор и капсул не образуют. По типу дыхания-аэробы. Риккетсии относятся к семейству Rickettsiaceae. К этому семейству относятся три рода: Rickettsia, Rochalimaea и Coxiella. Деление риккетсий на роды основано на различии в антигенном строении и локализации в пораженной клетке. Риккетсии имеют два антигена: растворимый (группоспецифический) и корпускулярный (видоспецифический). Возбудители относящиеся к роду Rickettsia, располагаются в цитоплазме, реже в ядре клетки; к роду Coxiella- в фагосомах и фаголизосомах, к роду Rochalimae- в межклеточном пространстве. Патогенные риккетсии не способны размножаться на искусственных питательных средах. Для их культивирования используют: -заражение культур тканей, -куриных эмбрионов, -экспериментальных лабораторных животных. Риккетсиозы, в основном, трансмиссивные инфекции. Природным резервуаром для большинства риккетсий являются грызуны и членистоногие. Возбудитель передается человеку при укусе кровососущих членистоногих- вшей, блох, клещей. Исключения составляет лихорадка Ку, которая передается алиментарным или воздушно-капельным путем, а естественным хозяином возбудителя является домашний скот. Риккетсии поражают клетки ретикулоэндотелиальной системы и эндотелий сосудов. В основе патогенеза риккетсиозов лежит интоксикация и развитие характерных изменений сосудов в виде эндоваскулита. Заболевания, вызываемые риккетсиями, называются риккетсиозами. Риккетсиозы человека делятся на 3 группы (табл. 26). Таблица 26 Риккетсиозы человека
Эпидемический сыпной тиф - острое антропонозное заболевание, вызываемое Rickettsia prowazekii и характеризующееся лихорадкой, явлениями интоксикации и поражением внутренних органов- печени, селезенки, миокарда, ЦНС и т.д. Возбудителем эпидемического сыпного тифа является риккетсия Провачека (Rickettsia prowazekii), который открыт чешским ученым Провачеком в 1913 году. Источником инфекции является больной человек, кровь которого заразна в течение 20-25 дней с начала заболевания. Переносчиком является платяная вошь. Риккетсии размножаются в эпителии кишечника вши и выделяются в наружу с экскрементами. Заражение человека происходит при расчесывании места укуса и втирании экскрементов вши. Вспышки сыпного тифа сопровождают войны, голод, социальные потрясения. Инкубационный период в среднем составляет 2 недели. Заболевание начинается остро, с резкого озноба, повышения температуры до 39-40ºС, мучительной головной боли, бессонницы. На высоте лихорадки возможно нарушение сознания- бред, галлюцинации. На 4-5-е дни появляется сыпь, вследствие расширения капилляров кожи и их повреждения. Болезнь Брилля-Цинссера возникает у людей перенесших в прошлом сыпной тиф и характеризуется более легким течением. Микробиологическая диагностика. Для культивирования риккетсий Провачека применяют заражение куриного эмбриона, культур клеток. Из лабораторных животных заражают белых мышей, морских свинок. Для диагностики сыпного тифа широко применяются серологические методы: РА, РНГА, РСК, РИФ, ИФА. Таблица 28 Схема постановки РСК при сыпном тифе
Для дифференциации болезни Брилля-Цинссера от сыпного тифа применяется дифференцированное определение IgM и JgG. При сыпном тифе вначале образуются IgM, которые сменяются IgG, а при болезни Брилля-Цинссера наблюдается быстрое образование IgG. Разработана ПЦР- диагностика сыпного тифа. Специфическая профилактика основана на введении сухой живой комбинированной вакцины ЖКВСЕ. Возбудителем эндемического или крысиного сыпного тифа является риккетсия Музера (R. typhi), которая по основным биологическим свойствам близка к риккетсии Провачека. Природным резервуаром являются крысы, полевые и домовые мыши. Переносчиком возбудителей служат блохи, гамазовые клещи. Заболевания у людей в виде единичных случаев встречаются в местностях, где наблюдаются заболевания крыс. Проявления заболевания сходны с эпидемическим сыпным тифом. Для микробиологической диагностики используют – биологическую пробу- заражение материалом от больных морских свинок- самцов. При эндемическом сыпном тифе у морских свинок развиваются признаки периорхита (скротальный феномен). -Серологическая диагностика- реакция агглютинации с диагностикумом Музера(R. typhi), РСК, ИФМ. Серодиагностика- реакция агглютинации с диагностикумом Провачека и Музера, позволяет поставить диагноз крысиного сыпного тифа и дифференцировать его от эпидемического сыпного тифа. Специфическая профилактика не разработана. Ку-лихорадка (от англ. Query- неясный, неопределенный)- зоонозная инфекционная болезнь, возбудителем, которой является Coxiella burnetti. Ку-лихорадка распространена повсеместно, в том числе и в России. В эпидемическом отношении опасность представляют домашние животные, грызуны. Передача происходит трансмиссивным путем (клещи). Возможны воздушно-пылевой путь заражения при обработке шерсти, кожи животных, а также алиментарный путь при употреблении молока и молочных продуктов больных животных. Возбудитель, попадая в кровь распространяется по органам и тканям, вызывая поражение многих органов, чаще всего легких. Размножение микробов происходит в гистиоцитах и микрофагах, после разрушения которых отмечаются генерализация процесса и токсинемия. В процессе инфекции развивается гипречувствительность замедленного типа (ГЗТ). Протекает как лихорадочное заболевание. Иммунитет после перенесенного заболевания достаточно прочный. Микробиологическая диагностика основана на выделении возбудителя из крови, мокроты и мочи. Материал вводят морским свинкам, белым мышам. Из селезенки морской свинки возбудителя выделяют путем культивирования на курином эмбрионе. С целью серодиагностики применяются РА, РСК, ИФМ. С диагностической целью применяется кожно-аллергическая проба. Специфическая профилактика проводится живой ослабленной вакциной штамма М-44. Хламидии относятся к семейству Chlamydiaceae к роду Chlamydia. Хламидии представляют собой мелкие кокковидные бактерии (0,3-1,5 мкм.), которые являются облигатными внутриклеточными паразитами. Они неподвижны, капсул не образуют, грамотрицательны. Для них характерен уникальный цикл развития, включающий две различные по морфологическим и биологическим свойствам формы существования: 1) элементарные тельца (ЭТ) - инфекционная форма паразита, которые имеют сферическую форму диаметром 250-ЗООнм и приспособлены для внутриклеточного существования. По Романовскому- Гимза окрашиваются в пурпурный цвет. 2)ретикулярные тельца (РТ) - вегетативная форма, имеют более крупные размеры (800 нм до 1 мкм), овальную форму. Развивается из элементарного тельца, проникшего в цитоплазму в течение 5-6 часов. В начале из ЭТ образуется инициальное тельце (вегетативное тельце), затем из вегетативного тельца образуется ретикулярное тельце (РТ). Такой цикл продолжается 40-72 часа и завершается разрывом клетки и выходом ЭТ в межклеточное пространство. Согласно последней классификации различают два рода хламидий : род Chlamydia, включает вид C. trachomatis и род Chlamydophila, в который включены C. psittaci, C.pneumoniae.  Рис 1. Жизненный цикл хламидий Хламидии имеют родоспецифический, видоспецифический, вариантоспецифический- антигены: - родоспецифический термостабильный ЛПС, находящийся в клеточной стенке; - видоспецифический антиген белковой природы, расположенный в наружной мембране; - вариантоспецифический антиген белковой природы. Факторы патогенности: компоненты поверхности клетки – белки наружной мембраны обладают адгезивными и антифагоцитарными свойствами. Эндотоксин - ЛПС, аналогично как у грамнегативных бактерий. Ряд исследований предполагает наличие экзотоксина, который вызывает гибель мышей. Патогенные хламидии вызывают такие заболевания как орнитоз, трахома, урогенитальный хламидиоз. Орнитоз (от греч- ornis- птица) - инфекционное заболевание, вызываемое Chlamidia psittaci и характеризующаяся интоксикацией, поражениями легких, нервной системы, гепатоспленомегалией. Резервуаром инфекции являются различные птицы. В дикой природе- водоплавающие птицы, среди синантропных- голуби. Основной путь передачи- воздушно-капельный, воздушно- пылевой, возможны контактные и алиминтарные пути. Инкубационный период 8-12 дней. Для клиники характерно многообразие проявлений: пневмония, бронхопневмония, миокардипатия, увеличение печени, развитие серозного менингита и др. Постинфекционный иммунитет не стойкий. Для выделения возбудителя применяется культуральный метод- заражения культур клеток, куриного эмбриона. Ведущее значение в диагностике орнитоза имеют серологические методы - РСК, РНГА, РИФ, ИФА, и др. Для диагностики орнитоза предложена внутрикожная аллергическая проба. Трахома хроническое инфекционное заболевание, вызываемое Chlamidia trachomatis и характеризующееся поражением конъюнктивы и роговицы глаз, которое может привести к слепоте. Возбудителем трахомы является Chlamidia trachomatis, который был открыт в 1907 году Провачеком, Хальберштедтером. Заболевание известно с древнейших времен, в настоящее время встречается в ряде развивающихся стран. В Дагестане трахома раннее была распространена и до 70-х г существовал противотрахоматозный диспансер. C. trachomatis характеризуется всеми вышеперечисленными свойствами. Трахому вызывают серовары A, Ba, B, C, эти же серовары могут быть причиной конъюнктивитов с включениями. Трахома распространена в Азии, Африке, Южной Америке, особенно в странах с низким уровнем санитарной культуры. Урогенитальный хламидиоз- острое или инфекционное заболевание, вызываемое различными сероварами Chlamуdia trachomatis и характеризующееся избирательным поражением мочеполовой системы. Возбудитель урогенитального хламидиоза- Chlamуdia trachomatis, относящийся к семейству Chlamуdiaсеа, к роду Chlamуdia. Представляет собой мелкие грамотрицательные кокковидные бактерии, не имеет спор, капсулы, неподвижна. По антигенной структуре различают 18 сероваров Ch. trachomatis. К факторам патогенности относятся адгезины – белки наружной мембраны и эндотоксин (ЛПС), который освобождается после гибели хламидий. Источником инфекции являются больные люди. Как источник инфекции наиболее опасны лица, у которых заболевание протекает бессимптомно. Основной механизм заражения- контактный, путь передачи- половой. Редко, но возможно инфицирование через предметы обихода- белье, мочалка и т.д. Новорожденные могут заразиться от больной матери при прохождении через родовые пути- хламидиоз глаз, дыхательных путей. Возможна также трансплацентарная передача хламидий от матери плоду (врожденный хламидиоз). Входные ворота инфекции, как правило, слизистые половых органов. Возбудитель поражает не только эпителиальные клетки, но и обладают лимфотропностью. Хламидии венерической лимфогранулемы характеризуется высокой инвазивностью. Инкубационный период 1-2 недели, иногда до 1 месяца. Таблица 27 Заболевания, вызываемые различными сероварами C. trachomatis
У мужчин заболевание наиболее часто характеризуется признаками уретрита. Жалобы на зуд и жжение в уретре, дизурические явления. Объективно- гиперемия наружного отверстия уретры, скудные слизистые или слизисто- гнойные выделения, лейкоцитоз. У женщин- незначительные слизистые или слизисто-гнойные выделения из цервикального канала, наличие фолликулярного цервицита, повышенная кровоточивость слизистой шейки матки, лейкоцитоз. Далее развивается восходящая инфекция, которая может привести к внематочной беременности, к мужскому и женскому бесплодию. Материал для исследования: соскобы эпителия из уретры, влагалища, шейки матки, биоптаты из половых органов, сыворотка крови. Методы диагностики: - культуральный- заражение культур клеток (например, типа Мак- Кой); - РИФ, ИФА - ДНК-диагностика- ПЦР, ДНК- гибридизация. - серологический метод для определения антител в парных сыворотках крови (РНГА, ИФА). Специфическая терапия и профилактика. Для лечения урогенитального хламидиоза применяются антибиотики, способные проникать в эпителиальные клетки и создавать там достаточные концентрации для направленного бактерицидного и бактериостатического действия на хламидии. В основном применяются антибиотики тетрациклинового ряда, макролиды, фторхинолоны. Специфическая профилактика не разработана. Схема 14. Микробиологическое исследование при риккетсиозах (по Борисову Л.Б., 2001)  Самостоятельная работа Разобрать схему микробиологической диагностики риккетсиозов, зарисовать в тетрадь. Поставить реакцию агглютинации с сывороткой больного и с риккетсиозными диагностикумами Провачека и Музера. Произвести учет реакции агглютинации по демонстрационному материалу. Разобрать схему микробиологической диагностики Ку-лихорадки. Демонстрация препаратов для диагностики, лечения и профилактики возвратного и сыпного тифов, лихорадки КУ. Произвести учет прямой РИФ для обнаружения хламидийного антигена. Указания к самостоятельной работе Прямой иммунофлюоресцентный метод (РИФ) Методпредпологает выявление антигенов хламидий в исследуемом клиническом метериале. Для нанесения материала применяются деколированные предметные стекла. При их отуствии применются чистые, обезжиренные предметные стекла без царапин. Мазок фиксируют охлажденным (4°) ацетоном или метанолом в течении 5-10 минут. На фиксированный мазок наносят раствор флюоресцирующих антител (раствором моноклональных или поликлональных, меченных Фитц с синькой Эванса) в колличестве 20-50мкл. Мазок инкубируют во влажной камере 20-25 минут, затем препарат опаласкивают фосфатнобуферным раствором 2 раза по 5 минут. После высушивания препарат исследуют в люминесцентном микроскопе. Микроскопию производят с использованием нефлюоресцирующего иммерсионного масла, объектива 90-х, окуляра – 7х. Результат считается положительным, если в мазке обнаруживают ярко-зеленое свечение в виде точки (для элиминтарного тельца) или овала (для ритикуляционных телец). Тельца распологаются отдельно, на поверхности эпителиальных клетокили внутриклеточно. Эпителиальные клетки окрашены в ярко оранжевый цвет. В этих случаях положительная оценка теста предполагает выявление в препарате не менее 10 элиментарных телец четко выделяющихся на красном фоне контрастно-окрашенных клеток. Результат считается отрицательным, если в мазке отсуствует специфическое свеение при обязательном наличии не менее 50 эпителиальных клеток. При ограниченном колличестве эпителиальных клеток в клинических образцах цитоплазматические включения обнаруживаются редко. При отсуствии в препарате эпителиальных клеток , но при обнаружении образований, схожих с хламидиями , следует повторить исследование, чтобы устранить сомнения в правильности взятия материала. Таблица 29 Препараты для специфической профилактики риккетсиозов
Вопросы для самоконтроля Общая характеристика риккетсии. Их таксономическое положение в систематике микроорганизмов. Что общего у риккетсии с бактериями, и какие свойства их сближают с вирусами? Назовите методы культивирования риккетсий. Каков механизм заражения эпидемическим сыпным тифом? Какие микробиологические методы применяются для диагностики сыпного тифа (эпидемического и эндемического)? Как отличить болезнь Брилля - Цинссера от сыпного тифа? Перечислите методы диагностики Ку - лихорадки. Таксономическое положение хламидий. Их роль в патологии человека. Методы лабораторной диагностики хламидиозов. Занятие 19 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||