Саидов М.С. и соавт. Практикум по мед. микробиологии и вирусолог. Исследование при стафилококковых инфекциях(по Борисову Л. Б., 2001)
 Скачать 1.14 Mb.
|
|
ТЕМА: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ЭНТЕРОВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ПОЛИОМИЕЛИТА. Цель: иметь представление о биологических особенностях энтеровирусов, их классификация. Изучить методы лабораторной диагностики полиомиелита и других энтеровирусных инфекций. В семейство пикорнавирусов (pico - мелкие, rna –содержащие РНК) включены энтеровирусы (вирус полиомиелита, Коксаки, ECHO), вирус ящура, риновирусы и некоторые неклассифицированные агенты. Всего более 100 вирусов. Энтеровирусы – группа вирусов, обитающих преимущественно в кишечнике человека, и вызывающих разнообразные по клиническим признакам болезни. Для энтеровирусов характерен фекально-оральный механизм заражения. Местом их первичной локализации является кишечник (или носоглотка), они могут проникать в кровь и гематогенно попадать в другие органы. К энтеровирусам относятся вирусы полиомиелита, вирусы Коксаки А и В, вирусы ЕСНО, энтеровирусы серотипов 68-71 и вирус гепатита А (энтеровирус серотип 72). Полиомиелит (старое название детский паралич или болезнь Гейне-Медине) - заболевание известное с древнейших времен. Вирус полиомиелита имеет мельчайшие размеры, РНК-содержащий. Вирион имеет сферическую форму, капсид состоит из 60 капсомеров, располагающихся по кубическому типу симметрии, в виде икосаэдров, не имеет суперкапсидной оболочки. В его составе нет углеводов и липидов, поэтому он не чувствителен к эфиру. По антигенным и биологическим свойствам различают 3 типа вируса полиомиелита - I, II и III типа. Паралитическую форму чаще вызывает серовар I. Вирус полиомиелита - размножается как в первичных, так и перевиваемых (например, Неlа) культурах клеток, что сопровождается ЦПД и образованием внутриклеточных включений. Вирус не обладает гемагглютинирующей активностью. Вирус устойчив к факторам внешней среды, к действию эфира, 70% спирта, к детергентам, формальдегиду, хлору. В канализационных водах, в фекалиях при 0°С вирус сохраняет инфекционную активность в течение месяца. Источником инфекции является больной человек, который выделяет возбудителя в течение всего периода заболевания и даже после выздоровления. Наиболее заразительными являются последние 3-5 дней инкубационного периода и первые 3-5 дней заболевания. Основной механизм передачи - фекально-оральный. Заражение происходит через пищу, воду, грязные руки. Мухи играют роль как механический переносчик. Входными воротами инфекции являются слизистые полости рта. Еще до появления клинических признаков возбудителя можно обнаружить в носоглотке. В эти ранние сроки вирус может передаваться при кашле, чихании, т.е. воздушно-капельным путем. Но этот путь не основной и кратковременный. Из полости рта, носоглотки вирус попадает в лимфатические узлы, затем в кровь и гематогенно поражает клетки передних рогов спинного мозга, т.е. двигательный нейрон, и вызывает параличи. Полиовирус может поражать и двигательные клетки продолговатого мозга, варолиева моста, мозжечка. По течению заболевания различают 4 клинические формы полиомиелита: паралитическую (около 1% случаев), непаралитическую (менингеальную), абортивную (кишечную форму с маловыраженной симптоматикой) и инаппарантную (скрытую). Инкубационный период продолжается в среднем 1-2 недели. Заболевание начинается с повышения температуры тела, общего недомогания, головных болей, рвоты, болей в горле. Параличи развиваются внезапно, на 1-6-й день болезни, в первые часы после понижения температуры. Восстановительный период длится 3-6 месяцев. Иммунитет после перенесенного заболевания стойкий к соответствующему серотипу, носит гуморальный и клеточный характер. Важная роль принадлежит местным секреторным IgA кишечника. Вирусы Коксаки выделены от больных с полиомиелитоподобным заболеванием в 1948 году в США в местечке Коксаки. Вирусы Коксаки делятся на подгруппы А и В. Вирусы Коксаки А имеют 1- 24 серовара, а В 1 - 6 сероваров. Некоторые серовары обладают гемагглютинирующей активностью, в отличие от вируса полиомиелита. Клинические формы инфекции, вызванной вирусами Коксаки, разнообразны. Вирусы Коксаки А вызывают заболевания, характеризующиеся лихорадкой, менингеальными явлениями, «герпетической» ангиной, перикардитами. Вирусы Коксаки В в силу своей нейротропности вызывают энцефаломиелиты, менингиты, полиомиелитоподобные заболевания. Вирусы ЕСНО(enteric cytopathogenic human orphan в дословном переводе: кишечные цитопатогенные человеческие вирусы – сироты) насчитывают более 30 сероваров этих вирусов, отличающихся по антигенным свойствам. В 1951-53г были выделены из фекалий Дж. Мельником, их роль была неизвестна поэтому назвали вирусами – «сиротами». Большинство из них обладают гемагглютинирующей активностью, непатогенны для белых мышей, а в культуре тканей дают выраженное цитопатическое действие. Вирусы ЕСНО вызывают кишечные инфекции, ОРВИ у детей, а также полиомиелитоподобные заболевания с синдромами поражения ЦНС-асептический менингит, иногда энцефалит. ЕСНО вызывают также гастроэнтериты и диареи у детей. Микробиологическая диагностика энтеровирусных инфекций. Лабораторный диагноз полиомиелита может быть поставлен на основании: 1. Вирусологического метода - обнаружение вируса в испражнениях больного или носителя путем заражения первичных культур почек обезьян, клеток HELA и др., 2. Иммунноиндикации – обнаружение антигена вируса в носоглоточном смыве с помощью ПЦР, ИФА и РИМ. 3. Серологической диагностики - используется РБН (реакция биологической нейтрализации методом «цветной пробы»), РСК, ИФА, обнаружение противовирусных антител с помощью реакции преципитации. Самостоятельная работа студентов: Изучить и зарисовать схему микробиологической диагностики энтеровирусных инфекций (полиомиелита, вирусов Коксаки, ECHO и др.). Зарисовать в тетради модель строения вириона полиомиелита, обозначить на рисунке НК, капсид, капсомеры, нуклеокапсид. Изучить результаты идентификации энтеровирусов в реакции нейтрализации со специфическими иммунными сыворотками. Дать заключение. Зарисовать в тетради схему РБН (реакция биологической нейтрализации) для идентификации вируса. Оценить результаты титрования вируснейтрализующих антител в РБН парными сыворотками. Дать заключение. Разобрать схему обнаружения противовирусных антител или антигенов с помощью реакции преципитации. Указания к самостоятельной работе: 1. Схема микробиологической диагностики энтеровирусных инфекций (таблица). 2. Обнаружение вируса в культуре ткани методом «цветной пробы». В основу «цветной реакции» положено, то обстоятельство, что в процессе размножения и роста клеток в питательной среде накапливаются кислые продукты обмена веществ, сдвигающие рН среды, в кислую сторону. В ткани, зараженной вирусом, наступает дегенерация клеток, метаболизм их подавляется и не происходит изменения рН среды. Для выявления этих изменений в питательную среду добавляют индикатор феноловый. При рН выше 7 цвет индикатора красный, при рН 7- оранжевый, рН ниже 7- желтый. Если клетки не заражены вирусом (или он нейтрализован специфической сывороткой), то рН питательной среды сдвигается в кислую сторону, и она становится желтой. Если вирус размножается, то клетки дегенерируют и среда сохраняет исходный красный цвет. Таблица №33 3. Схема определения титра антител методом цветной пробы
4. Обнаружение противовирусных антигенов с помощью реакции преципитации. Реакция преципитации в агаре широко используется для диагностики вирусных заболеваний (полиомиелита, Коксаки и др.) Реакция может быть поставлена в чашках Петри, на предметных стеклах и в капиллярах. Постановка реакций преципитации на предметных стеклах для выявления антигена вируса полиомиелита. На обычные предметные стекла наносят 2 мл расплавленного и охлажденного до 60º агара (I % - ый агар на физиологическом растворе с 1:20000 мертиолята). Толщина слоя агара на стекле составляет около I мм. После застывания агара в нем вырезают лунки диаметром 3-4мм с расстоянием между центрами луночек 5-6 мм. Количество луночек и их расположение на стекле могуть быть различными в зависимости от условий опыта. Объем используемых ингредиентов 0,02 мл. Реакция ставится с несколькими контролями. Для определения антигена вируса вырезают 4 лунки (см. схему) и каждую из них наливают соответственно следующие ингредиенты: специфическая сыворотка, специфический антиген, нормальная сыворотка, искомый антиген. Если искомый интиген соответствует сыворотке, то между соответствующими луночками должна появиться линия преципитации. Линия преципитации должна также появиться между лунками со специфической сывороткой и специфическим антигеном. Преципитация наблюдается через 4-5 часов инкубации в термостате во влажной камере. Схема постановки реакции преципитации в агаре для выявления вирусного антигена (рис. 7).  Сс - сыворотка специфическая; Сн - сыворотка нормальная; Ас - антиген специфический; Аи - антиген искомый. Рис.№7. Реакция преципитации для обнаружения противовирусных антигенов Таблица №34 Препараты для специфической профилактики полиомиелита
Примечание: курсивом выделен более используемый препарат. Вопросы для самоконтроля: Какие вирусы относятся к энтеровирусам? Дайте общую характеристику рода энтеровирусов? Принципы антигенной классификации энтеровирусов. Дайте характеристику вируса полиомиелита. Сколько существует серотипов полиовируса? Какие вирусологические методы применяют для диагностики полиомиелита и других энтеровирусных заболеваний? Какие серологические методы диагностики могут быть использованы при заболевании полиомиелитом? Можно ли провести серодиагностику полиомиелита, располагая лишь одной сывороткой, полученной от больного в остром периоде заболевания? Укажите препараты, применяемые для специфической профилактики полиомиелита. Какие вирусы относятся к пикорновирусам? Перечислите заболевания, вызаемые вирусами Коксаки и ECHO. Методы диагностики вирусной инфекции Коксаки и ECHO. Занятие 22 ТЕМА: МИКРОБИЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ВИРУСНЫХ ГЕПАТИТОВ. МИКРОБИЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ВИЧ- ИНФЕКЦИИ (ВИРУС ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА). Цель: иметь представление о биологических особенностях возбудителей вирусных гепатитов. Изучить методы микробиологической диагностики вирусных гепатитов. Иметь представление о биологических особенностях возбудителя вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Изучить методы микробиологической диагностики ВИЧ. Возбудители вирусных гепатитов. Вирусные гепатиты являются важнейшей проблемой инфекционной патологии. Это системные инфекционные заболевания с преимущественным поражением клеток печени. В зависимости от основных путей заражения вирусные гепатиты делятся на энтеральные, к которым относятся вирусы гепатитов А и Е, и парентеральные, к которым относятся вирусы гепатитов B, C, D, G и др. Вирусный гепатит А - антропонозное острое инфекционное заболевание, вызывается РНК содержащим вирусом гепатита А и характеризуется лихорадкой, поражением печени, интоксикацией. Вирус гепатита А - обозначается HAV (Hepatis A Virus) и относится к семейству Picornaviridae, к роду Enterovirus. Открыт Фейнстоном в 1973 году в фекалиях методом ИЭМ. Вирион гепатита А представляет однонитевую + РНК, окруженную белковой оболочкой. Как и другие представители семейства пикорнавирусов, имеет мелкие размеры 27 - 32 нм. Капсид состоит из 60 капсомеров, суперкапсидной оболочки не имеет. Вирус гепатита А не размножается в куриных эмбрионах и организме лабораторных животных. В отличие от других энтеровирусов плохо размножается в культурах тканей. Вирус устойчив к действию температуры (600 С в течение 12 часов), инактивируется при 1000 в течение 5 минут. Быстро погибает при действии дезинфицирующих веществ. Источником инфекции являются больные с явной клинической картиной и со скрытой инфекцией. Вирус выделяется с фекалиями в течение последней недели инкубационного периода и в поджелтушном периоде. Хроническое носительство при гепатите А не установлено. Механизм передачи фекально - оральный. Пути передачи: через воду, пищу, предметы обихода. Нередко отмечаются водные вспышки заболевания в связи с фекальным загрязнением открытых водоемов. Распространен повсеместно, чаще в странах с дефицитом воды, с низкой санитарной культурой населения. Наиболее восприимчивы дети от 4 до 15 лет (60% заболевших - это дети до 14 лет). Исход благоприятный 90% полного выздоровления, после перенесенного заболевания формируется стойкий иммунитет. Вирусный гепатит Е антропонозная инфекция с фекально- оральным механизмом передачи и преимущественным поражением печени, вызывается вирусом гепатита E (HEV). HЕV - РНК содержащий вирус, выделен в отдельный род Hepevirus. Вирион безоболочечный, сферический, диаметром 27 - 34 нм. Геном – однонитевая плюс - РНК. Источник инфекции- больной человек. Механизм передачи фекально-оральный. Пути передачи - через пищу, воду. Инкубационный период 2 - 6 недель. Заболевание сопровождается умеренным поражением печени, интоксикацией, реже желтухой. Прогноз благоприятный. Заболевание тяжело протекает у беременных, летальность у них достигает 20%. Иммунитет после перенесенного заболевания стойкий. Возбудители парентеральных гепатитов. Гепатит В -антропонозная инфекция, вызываемая ДНК содержащимвирусом с преимущественным парентеральным механизмом заражения и поражением печени в виде острого и хронического гепатита с переходом в цирроз или первичный рак печени. Возбудитель гепатита В (HВV) относится к семейству Hepadnaviridae. В 1970 году Дейн впервые обнаружил частицы сферической формы в сыворотке крови больных гепатитом методом электронной микроскопии. Возбудитель гепатита В - ДНК- содержащий вирус, имеющий суперкапсид сферической формы, диаметром 42 нм. Сердцевина вируса Нвс, окружена оболочкой, содержащей поверхностный Нвs аг (австралийский аг). Таким образом при вирусном гепатите B обнаруживаются Нвs, Нвс, Нве, и иногда обнаруживается Нвx аг. Нвs – аг (австралийский аг) представляет собой гликопротеин с липидным компонентом, который содержится во внешней оболочке вируса. Нвс – является нуклеопротеином. Содержится в сердцевине вирионов, находится в ядрах гематоцитов, но не постоянно в крови. Нве – аг – отщепляетя от Нвс аг при прохождении через мембрану гепацитов, вследствие чего обнаруживается в крови. Вирусы чувствительны к эфиру, детергентам. Необычным свойством вируса является устойчивость к высокой температуре. Они выдерживают нагревание до 100о с 1 – 2 мин., устойчивость повышается при нахождении в сыворотке крови. Источником инфекции являются больные с острой и хронической формами гепатита, а также вирусоносители. Основной путь заражения - парентеральный. Механизм передачи - при переливании крови, ее препаратов, массовые прививки, хирургические вмешательства, зубоврачебные манипуляции и пр). Заражение возможно при близком бытовом контакте, половым путем. Возможна передача вируса от матери плоду трансплацентарно, а также после родов через молоко, слюну и т.д. , т.е. почти все биологические жидкости больных гепатитом В содержат вирус. Вирус проникает в кровь парентерально, с кровью переносится в печень и размножается в гепатоцитах. Вирус гепатита D. был открыт в 1977 году Ризетто. Вирус гепатита D неклассифицирован. Было установлено, что ВГD является сателлитом вируса гепатита В, дефектным вирусом. Дефектом его является отсутствие собственной оболочки, поэтому для проявления патогенного действия он должен использовать оболочку вируса гепатита В. Вирион имеет сферическую форму, диаметр-36 нм, однонитчатую РНК, сердцевинный дельта антиген (НДс-антиген). Резервуаром вируса гепатита D являются носители ВГВ. Передается парентерально, также как и вирус В, но распространен реже. Вирус гепатита D может вызвать поражение печени лишь у людей, уже инфицированных вирусом гепатита В (супер-инфекция). Инфицирование вирусом гепатита больных с хроническим гепатитом В вызывает тяжелые формы заболевания с развитием печеночной недостаточности и цирроза печени. Одновременное заражение вирусом гепатита В и ГD (коинфекция) обычно приводит к развитию умеренной формы болезни. Диагностика заключается в выявлении антител к ВГD с помощью иммуноферментного метода. Разработана также полимеразная цепная реакция (ПЦР). Вакцина против гепатита В защищает и от гепатита D. Гепатит С.(иначе его называли гепатит ни А ни В). Вирус гепатита С относится к семейству Flaviviridae род Нерасivirus. Это РНКсодержащий вирус диаметром - 55 - 60 нм. вирион сферической формы. Вирус имеет сложную структуру. Имеет поверхностные гликопротеидные антигены, сердцевинный антиген (НСс-антиген). Источником инфекции являются больные и носители гепатита С.Пути передачи такие же, как для вируса ГВ. Наиболее часто заболевают лица после повторных переливаний крови. Антитела к вирусу гепатита С обнаружены у 0,5 - 1% доноров. Заболевание протекает легче, чем вызванное вирусом ГВ, лишь в четверти случаев сопровождается желтухой. Гепатит G. Вирус гепатита G предположительно относится к семейству к Feaviviridae к роду Hepacivirus. известно 5 генотипов вируса – GB-A, GB-B, GB-C и др. Микробиологическая диагностика вирусных гепатитов. Гепатит А Для лабораторной диагностики гепатита А применяются методы: ИЭМ (иммунной электронной микроскопии). Принцип метода ИЭМ основан на формировании комплексов антиген- антитело (при смешивании исследуемого антигена и заведомо известный специфической антисыворотки или заведомо известного антигена и исследуемой сыворотки). Образующиеся специфические комплексы выявляются в электронно- микроскопических препаратах. Основной метод диагностики серологический. Серологическая диагностика основана на использовании РИМ и ИФА обнаружении Ig M. Выявление в сыворотке больного анти- HAV Ig M дает основание установить диагноз гепатита А, т.к. антитела этого класса появляются еще в инкубационном периоде и сохраняются на протяжении 1,5- 6 мес. Ig G, обнаруживаемые в периоде реконвалесценции имеет анамнестическое значение. Гепатит E - серологический метод, с помощью ИФА в сыворотке крови определяют анти- HЕV антитела- Ig M и Ig G. - молекулярно- генетический метод, который заключается в определении РНК вируса с помощью ПЦР в кале и сыворотке крови больных в острой фазе инфекции. Гепатит B Диагностика основана на обнаружении специфических антигенов и антител с использованием ИФА (РИМ, РНГА): Нвs – аг, анти Нвs, Нве – аг, анти Нве, Нвс– аг, анти Нвс. Определяющим является обнаружение Нвs – аг, который выявляется в сыворотке больных через 3-5 недель от момента инфицирования и сохраняется в течение всей болезни. Наибольшее количество Нвs – аг в разгар заболевания продолжает оставаться на высоком уровне 2-3 месяца, исчезает через 6-8 месяцев. Обнаружение Нвs – аг через год свидетельствует о развитии хронического гепатита или бессимптомного носительства. Показателем острой инфекции является одновременное обнаружение Нвs – аг и Нве – аг. Присутствие в крови анти- Нвс – аг класса Ig M достоверно свидетельствует об остром гепатите В. Гепатиты C,D. Диагностируют серологическим методом в парных сыворотках путем постановки ИФА, и путем обнаружения вируса в крови с помощью ПЦР. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) относится к семейству ретровирусов. Имеется два типа ВИЧ- ВИЧ-1 и ВИЧ-2, вызывающие ВИЧ-инфекцию. ВИЧ-1 является основным возбудителем и вызывает до 90% ВИЧ-инфекции. ВИЧ-2 выделяют, в основном, в Западной Африке. Впервые ВИЧ-инфекция в своей финальной стадии описана в 1981 году в Калифорнии (США). Возбудитель был обнаружен французскими учеными под руководством Л. Монтанье в 1983 году, а затем независимо от него американскими исследователями под руководством Р. Галлов 1984 году. ВИЧ представляет собой сложный вирус сферической формы 100-120 нм в диаметре. Характерной особенностью вируса является наличие фермента обратной транскриптазы. В наружной двухслойной липидной оболочке имеются гликопротеиновые шипы, каждый из которых состоит из двух субъединиц – gp 41 и gp 120. Из них gp 120 находится на поверхности суперкапсида, а gp 41 погружен в оболочку. Под суперкапсидом находится сердцевина вируса, которая имеет форму усеченного конуса, в состав которого входят белки р 24 и р25. Промежуток между суперкапсидом и сердцевиной вируса заполнен матриксным белком, состоящим из р 17 и р18. Геном вируса - это две однонитчатые молекулы РНК со знаком +. Кроме генома в сердцевине находятся ферменты - обратная транскриптаза (ревертаза), интеграза и протеазы. Геном вируса имеет 9 генов, из которых 3 кодируют синтез белков вирусных частиц, а 6- являются регуляторными генами, обеспечивающими осуществление процессов репродукции и участие вируса в инфекционном процессе. Антигенными свойствами обладают белки сердцевины и оболочечные гликопротеины. Они характеризуются высокой изменчивостью, что объясняется высокой скоростью замен нуклеотидов. ВИЧ характеризуется невысокой устойчивостью к действию физических и химических факторов. Температура выше 56 С быстро и полностью инактивирует вирус. При комнатной температуре в жидкой и сухой среде сохраняется до недели. ВИЧ устойчив к высушиванию, в высохшей крови сохраняется до 7 суток. Мало чувствителен к действию УФ излучения. Вирус погибает быстро (в течение нескольких секунд) под действием 70% спирта, О,5% раствора формальдегида, 3% раствора перекиси водорода, О,5% раствора лизола, О, 2 % раствора гипохлорита натрия. Источником инфекции является инфицированный человек. Факторами передачи являются кровь, сперма, влагалищные и цервикальные выделения, грудное молоко. Слюна, моча, слезная жидкость также содержат ВИЧ, однако, количество вирусов недостаточно для заражения. Пути заражения: половой, парентеральный (через нестерильные инструменты, шприцы, при переливании инфицированной крови, кровезаменителей) и вертикальный - от зараженной матери к плоду. В мире 85-90 % случаев заболевания возникает при половых контактах, причем в 70% при гетеросексуальных контактах. Передача вируса от зараженной матери трансплацентарно, во время родов, при кормлении грудью происходит в 25-30 % случаев. Вирус иммунодефицита не проникает через неповрежденные кожные покровы. Нет опасности заразиться, купаясь в бане или бассейне. Заражение не происходит бытовым путем, вирус не передается при рукопожатии, соприкосновениях, при кашле, чихании, через продукты питания. Нет риска заразиться при пользовании общей посудой, ванной, общественным туалетом. Не доказана возможность передачи вируса через комаров. К вирусу иммунодефицита человека восприимчивы как женщины, так и мужчины независимо от возраста. Наиболее высокие показатели зараженности приходятся на возрастную группу от 20 до 39 лет. Вирус обладает иммунотропностью. Взаимодействие вируса с клеткой организма начинается со связывания gp 120 ВИЧ с рецептором CD4. ВИЧ избирательно поражает клетки, имеющие рецептор CD4 – Т хелперы, моноциты, макрофаги, клетки микроглии, т.е. иммунокомпетентные клетки. После проникновения вируса внутрь клетки и депротеинизации на +РНК вируса с помощью фермента обратной траскриптазы достраивается комплементарная нить ДНК. Затем под действием другого фермента рибонуклеазы у этой гибридной молекулы происходит расщепление исходной РНК. На оставшейся нити ДНК обратная транскриптаза синтезирует вторую цепь ДНК, используя первую как матрицу. Генетическая информация вируса уже в форме двухцепочечной ДНК проникает в клеточное ядро и с помощью фермента интегразы происходит « встраивание» (интеграция) геном а вируса в геном клетки. Эта вирусная ДНК, интегрированная в геном клетки называется «провирус». В таком состоянии вирус сохраняется годами в клетке, передаваясь при делении клетки их следующим поколениям. При этом у зараженных пациентов на протяжении 10-15 лет могут отсутствовать симптомы заболевания. Это интегративная, перманентная форма инфекции. В случае продуктивной инфекции в клетках под влиянием ферментов происходит синтез вирусных частиц и белковой оболочки, затем их сборка. При активной репродукции ВИЧ происходят множественные повреждения мембраны и клетка-хозяин погибает. ВИЧ-инфекция протекает в несколько стадий. Инкубационный период, составляющий от одной недели до трех месяцев, в среднем 2-4 недели. Стадия первичных проявлений - клинически эта стадия напоминает любую острую инфекцию. Длится эта стадия 2- недели и завершается бессимптомной инфекцией. Латентный период связан с тем, что вирус замедляет свою репликацию и переходит в состояние персистенции. Эта стадия может длиться 5-10 лет и более. Стадия вторичных заболеваний протекает с поражением дыхательной, нервной системы, желудочно-кишечного тракта. Терминальная стадия характеризуется кахексией, упорной диареей, адинамией, анемией, деменцией, снижением всех иммунных показателей с летальным исходом. Микробиологическая диагностика: Вирусологический метод применяется редко т.к. вирус размножается только в культуре Т-лимфоцитов на сложных средах с добавлением иммуномодулятора – интерлейкина-2. В практическом здравоохранении чаще применяются серологические методы. ИФА – основной скрининговый метод, который позволяет выявить вирусные антигены и антитела. ВИЧ антитела появляются через 2-4 недели, у некоторых и позже. Как подтверждающий диагноз тест используют иммуноблоттинг. Для диагностики ВИЧ инфекции применяют и ПЦР, способную выявлять вирусный генный материал в инкубационном и раннем клиническом периоде, однако ее чувствительность ниже, чем ИФА. Самостоятельная работа Схематически изобразить классификацию энтеральных и парентеральных гепатитов. Зарисовать в тетради схему вириона гепатита В. Разобрать структуру и химический состав ВИЧ. Зарисовать в тетрадь. Изучить схему микробиологичекой диагностики ВИЧ- инфекции. Разобрать методы постановки ИФА, и иммуноблоттинга.  Рис. 8. Схема строения вириона ВИЧ Указания к самостоятельной работе Для определения ВИЧ антител разработано множество тест-систем, которые позволяют выявить до 99,9% всех положительных проб. Поставить диагноз на основании только одного ИФА нельзя т.к. хотя и тест специфичный и высокочувствительный, но возможны как ложноположительные так и ложноотрицательные результаты. В зависимости от используемых тест-систем средняя частота ложноотрицательных результатов 1:1000, а ложноположительных – 1:10000. Для подтверждения диагноза необходимо использовать иммуноблот (Вестернблот), который заключается в разделении белков ВИЧ с помощью иммуноэлектрофореза с последующим определением антител к белкам gp 41, gp 120, p 24. ИФА иммуноферментный метод, выявление антигенов с помощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом-меткой (пероксидазой или щелочной фосфатазой). После соединения антигена с меченной ферментом иммунной сыворотко в смесь добавляют субстрат/ хромоген. Субстрат расщепляется ферментом, и изменяется цвет прдукта реакция- интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител. Твердофазный ИФА – наиболее распространенный вариант иммунологического теста, когда один из компонентов иммунной реакции (антиген или антиела) сорбирован на твердом носителе, например в лунках планшеток из полистерола. При определении антител в лунки планшеток с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, меченную ферментом, и субстратом, и субстрат (хромоген) для фермента. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем тщательного промывания. При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена. Твердофазный носитель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителами. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят искомый антиген, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченную ферментом, а затем субстрата для фермента. Метод иммуноблоттинга (ИБ)- высокочувствительный метод, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Антиген выделяют с помощью электрофореза с полиакриламидном геле, затем переносят его (блоттинг - от англ. blot. пятно) из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоска с «блотами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем после инкубации отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченую ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс антиген+ антитело больного+ антитело против Ig человека выявляют довалением субстрата хромогена, изменяющего окраску под действием фермента. ИБ используют как дагностический метод при ВИЧ – инфекции и др. Таблица №35 Препараты для специфической профилактики гепатитов
Вопросы для самоконтроля. Дайте характеристику вируса гепатита A. Методы микробилогической диагностики вирусных гепатитов A и E. Дайте характеристику вирусов гепатита B,C и D. Методы микробилогической диагностики вирусных гепатитов B и C. К какому семейству и подсемейству относится ВИЧ? Какие клетки организма являются «мишенью» для ВИЧ? Что такое иммунорегуляторный индекс (ИРИ) и чему он равняется у больных ВИЧ-инфекцией? Механизм действия фермента обратной траскриптазы или ревертазы. В каких случаях употребляют термины ВИЧ, СПИД? Основные пути передачи ВИЧ. Контингенты риска при ВИЧ - инфекции. Перечислить первичный комплекс симптомов, позволяющих заподозрить заболевание. Почему до сих пор не решен вопрос изготовления вакцины при ВИЧ-инфекции? Разработана ли специфическая прфилактика ВИЧ- инфекции? Занятие 23 | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||