Саидов М.С. и соавт. Практикум по мед. микробиологии и вирусолог. Исследование при стафилококковых инфекциях(по Борисову Л. Б., 2001)
 Скачать 1.14 Mb.
|
|
ТЕМА: МЕТОДЫ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ. Цель: изучить методы микробиологической диагностики вирусных инфекций, методы культивирования вирусов, индикации и идентификации в курином эмбрионе и культуре клеток. Основоположником вирусологии является русский ученый Л.И.Ивановский, который в 1892 году открыл вирус мозаичной болезни табака. Для вирусов характерны две формы существования: внеклеточная и внутриклеточная. Внеклеточный вирус имеет специфическую корпускулярную форму и называется вирион.  Рис. №2. Схема строения вириона Структура вириона. Вирионы состоят из нуклеиновой кислоты (ДНК или РНК), окруженной белковой оболочкой - капсидом. Простые вирионы представляют собой нуклеокапсид, а по химическому составу- нуклеопротеид. Капсид вирионов состоит из определенного числа белковых молекул - капсомеров. По характеру расположения капсомеров вирусы делят на три группы: с кубическим, спиральным и смешанным типом симметрии. Большинство патогенных для человека вирусов имеет кубический тип симметрии. Спиральный тип симметрии характерен для орто - и парамиксовирусов и некоторых арбовирусов. Смешанный тип симметрии отмечается у поксвирусов и бактериофагов. Некоторые вирусы имеют дополнительную внешнюю оболочку, которая называется суперкапсидом. В состав суперкапсида могут входить глико - липопротеиды, ферменты. Такие вирусы относятся к сложным вирусам. Основные особенности вирусов, отличающие их от остальных живых организмов Вирионы содержат нуклеиновую кислоту только одного типа- ДНК или РНК. Все другие живые организмы содержат два типа нуклеиновых кислот (ДНК и РНК). У вирионов отсутствуют собственные белоксинтезирующие и энергообразующие системы. У них нет рибосом. Они используют рибосомы клеток хозяина. Абсолютный паразитизм. Вирионы не способны к росту и бинарному делению. Вирусы размножаются особым способом, который отличается от способов размножения всех других организмов. Их способ размножения называется дисъюнктивная (т.е. разобщения) репродукция. Таким образом, термин «вирус» означает внеклеточную своеобразную форму жизни, обладающую собственным геномом и способную к воспроизведению лишь в клетках более высокоорганизованных существ. Классификация вирусов В основу современной классификации положены следующие основные критерии. Нуклеиновая кислота: тип (РНК или ДНК), число нитей, процентное содержание, молекулярный вес, содержание гуанина и цитозина. Морфология: тип симметрии, число капсомеров для вирусов с кубической симметрией, наличие внешних липопротеидных оболочек (суперкапсид), форма, размеры вирионов. По способу репродукции, т.е. по стратегии вирусного генома различают: а) РНК +- вирусы, б) РНК - - вирусы, в) РНК- содержащие ретровирусы, г) ДНК- содержащие вирусы Биофизические свойства: константа седиментации, плавучая плотность. Круг восприимчивых хозяев. Патогенность, в том числе патологические изменения в клетках и образование внутриклеточных включений. Географическое распространение. Способ передачи. Антигенные свойства. На основании перечисленных признаков вирусы делятся на семейства, подсемейства, роды, виды. Таблица №30 Классификация ДНК-содержащих вирусов  Таблица№31 Классификация РНК-содержащих вирусов  Методы микробиологической диагностики вирусных инфекций Микроскопический метод. а) обнаружение в исследуемом материале с помощью специальных методов окраски внутриклеточных телец - включений. Например, при бешенстве (тельца Бабеша - Негри), герпетической инфекции, при ветряной оспе др., б) обнаружение возбудителя в пораженной ткани с помощью флюоресцирующих антител (РИФ), в) обнаружение возбудителя с помощью электронной микроскопии. Этот метод требует достаточно высокой концентрации возбудителя в пораженной ткани. Поэтому отрицательные результаты не являются диагностически значимыми. Вирусологический метод. Для выделения чистой культуры вируса используют следующие методы: а) заражение куриных эмбрионов, б) заражение культур клеток Биологический метод. Заражение чувствительных к данному вирусу лабораторных животных исследуемым материалом с целью воспроизведения заболевания или последующего выделения вируса. Серологический метод. Обнаружение противовирусных антител в сыворотке больного или реконволесцента. При серологической диагностике вирусных инфекций широко используют следующие реакции: РСК- реакция связывания комплемента, РТГА- реакция торможения гемагглютинации, РИФ- реакция иммунофлюоресценции, РБН- реакция биологической нейтрализации вируса, РИА- радиоиммунный анализ, ИФА- иммуноферментный анализ. РИА и ИФА отличаются наибольшей чувствительностью по сравнению с другими серологическими реакциями. Серологические методы просты и позволяют исследовать большое количество проб за короткий промежуток времени. Этими методами выявляют нарастание антител в парных сыворотках переболевших с помощью набора вирусных диагностикумов (антгенов). У больного сыворотку берут в начале заболевания и затем через 2-4 недели. Поэтому называются эти сыворотки парные, т.е. две (пара) сыворотки. Парные сыворотки исследуют совместно, начиная с разведений 1:10. Показателем свежеперенесенной инфекции является не менее чем четырехератное нарастание титра антител во второй сыворотке. Молекулярно- генетический. а) ДНК- зонд диагностика, б) ПЦР - диагностика. Самостоятельная работа: Зарисовать в тетради модель строения вириона, обозначить на рисунке НК, капсид, капсомеры, нуклеокапсид, суперкапсид. Зарисовать в тетрадь схему строения куриного эмбриона. Изучить способы заражения куриных эмбрионов, индикации вирусов в курином эмбрионе (реакция гемагглютнации) и идентификации (реакция торможения гемагглютинации - РТГА). Пользуясь учебной таблицей, изобразите в виде схемы типы тканевых культур. Изучить внутриклеточные включения (демострационный препарат и таблица). Зарисовать в тетради. Зарисовать в тетради таблицу «Методы обнаружения вирусов в культуре ткани». Посмотреть под микроскопом демонстрационный препарат культуры клеток. Указания к самостоятельной работе Культивирование вирусов в курином эмбрионе: существует несколько методов заражения куриных эмбрионов: на хорионаллантоисную оболочку, в аллантоисную полость, амниотическую полость, в желточный мешок. Для заражения используют эмбрионы 5- 11 дневного возраста. Перед заражением эмбрионы просматривают в темной комнате при помощи овоскопа для проверки их жизнеспособности, определения воздушной камеры и места расположения эмбриона.  Для заражения куриного эмбриона, например, в аллантоисную полость исследуемым вирусосодержащим материалом яйцо устанавливают в штативе в вертикальном положении тупым концом вверх. Скорлупу, над воздушной камерой обрабатывают спиртом, йодом, повторно спиртом и прокалывают над воздушной камерой и через небольшое отверстие вводят иглой шприца на глубину 1-1,5 см материал в объеме 0,1-0,2 мл. Отверстие заливают парафином. Зараженное яйцо ставят в термостат при 37° С на 48 часов. Через несколько дней (2-3 дня) производят вскрытие куриных эмбрионов. Работу проводят в стерильных условиях. Яйцо ставят воздушным мешком кверху, место вскрытия смазывают спиртом, йодом, еще раз спиртом, обжигают и ножницами удаляют прилегающую к отверстию часть скорлупы. Пинцетом снимают подскорлуповую оболочку, прокалывают пастеровской пипеткой хорионаллантоисную оболочку и из полости отсасывают аллантоисную жидкость, содержащую вирус. Жидкость помещают в пробирку. Для обнаружения вируса в исследуемом материале (в нашем опыте- аллантоисная жидкость) ставится РГА. Вирус адсорбируется на куриных эритроцитах и вызывают агглютинацию этих эритроцитов. Для постановки реакции к капле вирус-содержащего материала добавляют одну каплю 5%- ной взвеси эритроцитов. Реакция происходит в течение 5 мин. Обнаружение типа вируса в аллантоисной жидкости проводится с помощью реакции торможения гемагглютинации (РТГА) (демонстрация). Схема РТГА. Эта реакция может быть использована для определения типа вируса, а также для определения типа и титра антител в сыворотке. Для определения типа вируса на предметное стекло наносят по 1 капле материала, содержащего вирус. Затем в каждую каплю вносят по одной капле типовых сывороток. Контролем служит физиологический раствор и нормальная (неиммунная) сыворотка. Затем в каждую каплю вносят по 1 капле 5% взвеси эритроцитов. Результат регистрируют через 5 минут. Если вирус соответствует специфической сыворотке, то он нейтрализуется антителами этой сыворотки, и агглютинация эритроцитов не наступает, т.е. происходит торможение реакции агглютинации. 2.Культивирование вирусов в культуре ткани Характеристика культур тканей. Культуры тканей (или культуры клеток)- это клетки тканей, выращенные вне организма на специальной питательной среде. Клетки ткани в искусственных условиях сохраняют присущий им обмен веществ и восприимчивость к определенным вирусам. Для культивирования вирусов особенно пригодны клетки с быстрым ростом. По этой причине широко применяют эмбриональные ткани (фибробласты куриных эмбрионов, клетки амниона человека и др., а также культуры клеток злокачественных опухолей). Для выращивания культур клеток наибольшее распространение получили синтетические и полусинтетические среды, которые содержат все необходимые вещества (соли, витамины, аминокислоты и т.д.).Например, среда 199, среда Игла, раствор альбумина бычьей плазмы, солевой раствор Хенкса с сывороткой. Однослойные первичные культуры тканей - это взвесь клеток, полученная путем обработки тканей протеолитическими ферментами (трипсин, папаин и др.). Трипсинизацией достигается разделение клеток за счет переваривания межклеточного вещества. Такие клетки, помещенные в питательную среду, растут в виде монослоя и дают однослойную культуру ткани. Перевиваемые клетки - это культура клеток, сохраняющая способность к размножению вне организма неопределенно длительное время. В лабораториях мира имеется много перевиваемых культур, полученных из нормальных тканей человека и животных: 1) штамм клеток Hela- клетки карциномы шейки матки человека; 2) штамм клеток Нер -2- клетки злокачественной опухоли гортани человека; 3) штаммы клеток Детройт 6- клетки, выделенные из костного мозга человека больного раком легких; 4) штаммы клеток А-О и А-I- клетки амниона человека; 5) штаммы клеток СОЦ- клетки сердца обезьяны и др. Техника заражения культур клеток состоит в следующем. Берут пробирку с заранее выращенной монослойной культурой клеток. Вирус (например, вирус вакцины) разводят средой 199 в отношении 1:3 и обрабатывают антибиотиками. Из пробирки с культурой клеток стерильной пастеровской пипеткой отсасывают питательную среду. В пробирку вносят 1 мл разведенного средой вируса вакцины, плотно закрывают помещают в термостат в горизонтальном положении. 3.Обнаружение вирусов в культуре клеток а) Изучение внутриклеточных включений. Универсальным методом окраски внутриклеточных включений является окраска по Манну. Внутриклеточные включения при бешенстве (тельца Негри) обнаруживается в нервных клетках аммонова рога и в клетках Пуркинье мозжечка. При окраске по Манну- тельца Негри красного цвета на голубом фоне цитоплазмы. б) Цитопатический эффект (или цитопатическое действие)- это дегенерация клеток, возникающая под воздействием вируса размножающегося в культуре ткани. Микроскопически цитопатическое действие выражается в различных изменениях морфологии клеток. в) Гемадсорбция – адсорбция эритроцитов на поверхности поврежденных вирусом клеток. г) Метод бляшек предложен Дюльбеком для получения изолированных колоний вируса. Метод заключается в следующем. В специальном флаконе выращивают на стенке монослой клеток, затем удаляют питательную среду. Клетки заражают вирусом и заливают агаром, содержащим индикатор- нейтральный красный. Там, где происходит рост клеток, среда изменится в кислую сторону и индикатор окрасится в розовый цвет. На тех участках, где клетки погибли под действием вируса, рН среды и, следовательно, цвет индикатора не изменяется. Такие островки неокрашенной среды имеют вид беловатых бляшек. д) Метод флюоресцирующих антител. Основан на появлении специфического свечения в местах локализации вируса при обработке зараженной ткани флюоресцирующими антителами. Заражаемую культуру ткани выращивают на стеклянных пластинках. Препараты промывают физ.раствором, подсушивают и фиксируют ацетоном. Затем обрабатывают специфической сывороткой. Просмотр препарата производят с помощью люминисцентного микроскопа. В местах локализации вируса появляется специфическое свечение под воздействием флюоресцирующих антител. е) Обнаружение вируса в культуре ткани методом «цветной пробы». В основу «цветной реакции» положено то обстоятельство, что в процессе размножения и роста клеток в питательной среде накапливаются кислые продукты обмена веществ, сдвигающие рН среды в кислую сторону. В ткани, зараженной вирусом, наступает дегенерация клеток, метаболизм их подавляется и не происходит изменения рН среды. Для выявления этих изменений в питательную среду добавляют индикатор феноловый. При рН выше 7 цвет индикатора красный, при рН 7- оранжевый, рН ниже 7- желтый. Если клетки не заражены вирусом (или он нейтрализован специфической сывороткой) рН питательной среды сдвигается в кислую сторону, и она становится желтой. Если вирус размножается, то клетки дегенерируют и среда сохраняет исходный красный цвет. Вопросы для самоконтроля: 1. Кем и когда были открыты вирусы? 2. Чем отличаются вирусы от всех живых организмов? 3. Что такое вирион? Что такое капсид, нуклеокапсид, суперкапсид? 4. Какие признаки вирусов положены в основу современной классификации вирусов? 5. Почему вирусы являются облигатными паразитами? 6. Перечислите основные методы диагностики вирусных заболеваний. 7. Какие методы используются для культивирования вирусов? 8. Что такое культура тканей(или культура клеток)? Какие вы знаете типы тканевых культур? 9. Какие питательные среды используются для выращивания культур клеток? 10. Какие существуют методы заражения куриного эмбриона? Какого возраста эмбрионы используются для заражения? 11. Как обнаруживают наличие вируса в курином эмбрионе? Как ставится реакция торможения гемагглютинации (РТГА)? Для чего она используется? 12. Как обнаруживают наличие вируса в культуре ткани? 13. Что такое ЦПД вируса? 14. Что собой представляет метод «бляшек»? 15. Какие вы знаете внутриклеточные включения? Какими методами их окрашивают? Занятие 20 ТЕМА: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ОСТРЫХ РЕПИРАТОРНЫХ ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ. ГРИПП. Цель: иметь представление о возбудителях ОРВИ. Изучить биологические особенности вируса гриппа и методы лабораторной диагностики. ОРВИ включают большое количество вирусных болезней с поражением различных отделов дыхательных путей и аэрозольным механизмом передачи. Возбудителями ОРВИ могут быть более 200 различных вирусов. Возбудители ОРВИ: Вирусы гриппа (Orthomyxoviridae). Вирусы гриппа A, B и С. Парамиксовирусы (Paramyxoviridae) - в это семейство входят различные представители, в том числе вирусы парагриппа человека (ВПГЧ) 1,2,3,4-го типов, паротита, респираторно-синцитиальный вирус (RS-вирус), вирус кори (род Morbilivirus). Респираторные коронавирусы (Coronaviridae). Пикорнавирусы (Picornoviridae). Из этого семейства собственно возбудителями ОРВИ являются риновирусы (род Rhinovirus,более 100 серовариантов), а также некоторые сероварианты вирусов ECHO и Коксаки (род Enterovirus). Респираторные реовирусы (Reoviridae). Респираторные аденовирусы (Adenoviridae). Все перечисленные семейства относятся к РНК-содержащим вирусам, за исключением аденовирусов, геном которых представлен двунитевой ДНК. Вирус гриппа относится к семейству ортомиксовирусов. Вирион имеет фрагментированную одноцепочечную РНК, которая состоит из 8 фрагментов, что обусловливает большую изменчивость вируса. Форма вириона чаще сферическая, капсид построен из простых белков, покрыт суперкапсидной оболочкой (см. схему строения вируса гриппа). На поверхности суперкапсидной оболочки имеются гликопротеины, представленные гемагглютинином и нейраминидазой. Гемагглютинин распознает мукопептидные рецепторы чувствительных клеток и способствуют адсорбции вируса на клетке. Нейраминидаза обеспечивает проникновение вируса в клетку, расщепляя сиаловые кислоты, входящие в состав мембран клетки. Вирус гриппа имеет внутренние антигены, на основании которых вирусы гриппа подразделяются на типы А, В и С, а также поверхностные антигены, представленные гемагглютинином (Н) и нейраминидазой (N). Эти поверхностные антигены более вариабельны. У вируса гриппа А различают 15 вариантов гемагглютинина и 10 вариантов нейраминидазы. Вирус гриппа А, поражающий человека имеет гемагглютинины Н1, Н2 , Н3 и нейраминидазу N1, N2.. В зависимости от их сочетания выделяют три варианта вируса гриппа H1N1,H2N2,H3N2 . Источником инфекции для человека является больной человек. Путь заражения - воздушно-капельный. Возможен также контактный путь за счет попадания возбудителя инфекции в носоглотку через грязные руки, а также предметы бывшие в контакте с больным человеком - носовые платки, маски, инструменты и т.д. Природным резервуаром вируса гриппа А являются птицы, реже животные. Вирус гриппа В встречается только у людей, С - у людей, а также у свиней, возможно у собак. Вирусы адсорбируются на эпителиальных клетках дыхательных путей и с помощью нейраминидазы проникают в клетку, где происходит размножение. Из-за повреждения мембраны эпителиальных клеток на поверхности слизистой дыхательных путей образуются эрозии. Через эрозированную поверхность вирусы пападают в кровь (вирусемия) и разносятся по всему организму. Продукты распада клеток и некоторые вирусные белки оказывают токсическое действие на органы и системы организма. Инкубационный период короткий от нескольких часов до 7 суток, в среднем 1-2 суток. Для гриппа характерно острое начало, высокая температура, общая интоксикация, характеризующаяся недомоганием, головными болями, болями в глазных яблоках, мышцах.  Рис. 4. Этиологическая структура ОРВИ Микробиологическая диагностика Материалом для исследования служат смыв из носоглотки, кровь. Методы исследования: - вирусологический - из исследуемого материала вирус выделяют при заражении куриного эмбриона и культур тканей с последующей индикацией и идентификацией в РГА, РТГА или РСК; - иммуноиндикация - обнаружение антигена вируса в носоглоточных, бронхиальных смывах с помощью РТГА, ИФА или РИФ, которые применяются для экспресс-диагностики гриппа; - серологический - определяют антитела в сыворотке крови больных начиная со второй недели, используют - РТГА, РСК, ИФА с парными сыворотками. С помощью ИФА определяют и титр секреторных Ig А в носоглоточных смывах. Самостоятельная работа студентов. Изучить и зарисовать схему микробиологической диагностики ОРВИ. Зарисовать и поставить РГА для индикации вируса. Изучить схему постановки РТГА для идентификации выделенного вируса. Учесть результаты, дать заключение. Указания к самостоятельной работе Схема микробиологической диагностики ОРВИ (таблица). Т  ехника постановки РГА (реакции гемагглютинации). 1-опыт 2-контроль Рис. 5. Реакция гемагглютинации Реакцию гемагглютинации ставят на стекле (по типу ориентировочной реакции агглютинации), в пластмассовых планшетках с лунками или в пробирках. При положительной реакции в опытной капле происходит склеивание эритроцитов. В контроле склеивание эритроцитов на происходит. К капле аллантоисной жидкости, содержащей вирус гриппа, прибавляют каплю 5%-ной взвеси куриных эритроцитов. В контроле вместо аллантоисной жидкости используют физиологический раствор. 3.Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) РТГА может быть использована для определения типа вируса и титра антител (см. рис 6). Для определения типа вируса на предметное стекло наносят по одной капле вирусосодержащего материала – аллантоисной жидкости (количество капель должно соответствовать количеству сывороток). В приготовленные капли последовательно вносят по одной капле типовых сывороток – А, А1, А2, В, С. Контролем служит физиологический раствор и нормальная сыворотка. Затем в каждую каплю вносят по одной капле 5% - ной взвеси эритроцитов. Результат регистрируют через 5 минут. При соответствии вируса типу сыворотки антитела связывают гемагглютинин вируса, и гемагглютинация не наступает (РТГА положительная).  Рис.6.Схема РТГА для определения типа вируса гриппа Эта реакция может быть поставлена и в пробирках с целью титрования вируса или антител. Таблица№32 Препараты для специфической профилактики гриппа
Примечание: курсивом выделены более используемые препараты Вопросы для самоконтроля: 1. Дайте характеристику ортомиксовирусов и парамиксовирусов Какие возбудители вирусных инфекций относятся к этим двум семействам? 2. Опишите антигенную структуру вируса гриппа. Назовите типы вируса гриппа и его антигены? 3. Перечислите методы лабораторной диагностики гриппа. 4. Специфическая профилактика гриппа. 5. Назовите препараты, применяемые для лечения гиппа. 6.Дайте характеристику респираторно-синтициального вируса(RS). 7. Лабораторная диагностика эпидемического паротита. 8. Методы лабораторной диагностики кори. 9. Аденовирусы, общая характеристика. 10. Методы лабораторной диагностики аденовирусных инфекций. 11. Как обнаружить вирус гриппа, и как его идентифицировать в курином эмбрионе? 12. Почему происходит реакция агглютинации эритроцитов в присутствии вируса гриппа? Каков механизм этой реакции? Иммунные ли это реакции? 13. Механизм реакции торможения (нейтрализации) гемагглютинации? Для чего она используется? Занятие 21 |