Саидов М.С. и соавт. Практикум по мед. микробиологии и вирусолог. Исследование при стафилококковых инфекциях(по Борисову Л. Б., 2001)
 Скачать 1.14 Mb.
|
|
ТЕМА: МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА БРУЦЕЛЛЕЗА И СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ. Цель: 1. Изучить методы микробиологической диагностики бруцеллеза и сибирской язвы. 2. Изучить препараты для диагностики, специфической профилактики и терапии бруцеллеза и сибирской язвы. Бруцеллез – острое или хроническое зоонозное инфекционное заболевание, характеризующееся интоксикацией, преимущественным поражением опорно-двигательного аппарата, нервной, сердечно-сосудистой, мочеполовой систем и других органов, аллергизацией организма, затяжным течением, приводящим как правило к инвалидизации. Возбудители бруцеллеза относятся к роду Brucella, который включает в себя основные патогенные для человека следующие виды: B.abortus – возбудитель крупного рогатого скота; B.melitensis – мелкого рогатого скота, B.suis – свиней. Бруцеллы – мелкие, грамотрицательные, неподвижные коккобактерии, они не образуют спор. По типу дыхания аэробы. Высокотребовательны к питательным средам. Элективными питательными средами являются печеночный агар, печеночный бульон. На плотных средах дают рост колоний разной величины, бесцветные с перламутровым оттенком. В жидких средах отмечается помутнение. Факторы патогенности: эндотоксин, ферменты агрессии и защиты (гиалуронидаза, фактор подавляющий фагоцитоз и пр.). Источником инфекции являются больные животные. Люди, больные бруцеллезом, как источник инфекции опасности не представляют. Основные пути заражения: алиментарный, контактно-бытовой. Бруцеллы проникают в организм через неповрежденные кожные покровы и слизистые, откуда попадают в регионарные лимфоузлы. Бруцеллы легко преодолевают лимфатический барьер и попадают в кровь и разносятся в костный мозг, печень, почки и др. органы. Микробы и продукты их жизнедеятельности вызывают сенсибилизацию, что приводит к развитию инфекционной аллергии. Развитие инфекционной аллергии имеет ведущее значение в патогенезе бруцеллеза. Клиника бруцеллеза характеризуется развитием волнообразной лихорадки, поражением опорно-двигательного аппарата, внутренних органов, ЦНС. В течение болезни формируется нестерильный инфекционный иммунитет. Материалы для исследования – кровь, пунктат красного костного мозга, моча, испражнения, молоко и молочные продукты, кусочки органов. Для диагностики бруцеллеза используют все методы микробиологической диагностики. Сибирская язва (anthra, злокачественный карбункул) – острая зоонозная инфекционная болезнь, вызываемая Вacillus anthracis, которая характеризуется тяжелой интоксикацией поражением кожи, лимфатических узлов и других органов, высокой летальностью. Возбудитель сибирской язвы – Bacilla anthracis, относится к семейству Bacillaceae, роду Bacillus. Bacilla anthracis – грамположительные крупные палочки, с обрубленными концами, в мазках часто располагаются цепочками (стрептобациллы). Образует споры, располагающиеся центрально. В организме человека и животных образует капсулу. Факультативные анаэробы. Не требовательны к питательным средам. На МПА образуют R-формы колоний, напоминающие «львиную гриву» или «голову медузы». На МПБ через 18-24 часа рост в виде «комочка ваты». Факторы патогенности: капсула, экзо-эндотоксины. Источником инфекции являются домашние животные: крупный и мелкий рогатый скот, лошади, свиньи. Заражение происходит при уходе за животными, разделке туш; употреблении в пищу мяса зараженных животных, выделке шкур. Заражение происходит через кожу, слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта или дыхательные пути. Различают кожную, кишечную и легочную формы сибирской язвы. Наиболее тяжело с высокой летальностью протекают две последние формы заболевания. После перенесенного заболевания остается достаточно стойкий иммунитет, который носит антибактериальный и антитоксический характер. Для обнаружения материала используют микроскопию мазков из патологического материала, методы иммуноиндикации – прямой РИФ, реакцию кольцепреципитации – реакцию Асколи; бактериологическое исследование проводится в строго-режимных лабораториях. Специфическая терапия и профилактика. Для лечения кроме антибиотиков используют противосибиреязвенную сыворотку или специфический иммуноглобулин. Специфическая профилактика проводится живой сибиреязвенной вакциной СТИ. Самостоятельная работа 1. Разобрать схему микробиологической диагностики бруцеллеза. 2. Поставить реакцию Хеддльсона. Дать заключение. 3. Поставить реакцию Райта. Учет готовых результатов. Дать заключение. 4. Ознакомить студентов с профилактическими и лечебными препаратами, применяемыми при бруцеллезе. 5. Изучить схему микробиологической диагностики сибирской язвы. 6. Поставить реакцию Асколи с готовым фильтратом из шерсти (преципитиногеном) и преципитирующей сывороткой. Дать заключение. 7. Изучить препараты, применяемые для специфической профилактики и лечения сибирской язвы. Указания к самостоятельной работе Микробиологическая диагностика бруцеллеза Бактериологический метод Бактериологическое исследование с целью выделения чистой культуры проводят в специальных лабораториях с соблюдением правил техники безопасности. Посев крови для выделения гемокультуры проводят в первые дни болезни при наличии лихорадки. При этом 10 мл стерильно взятой из вены крови засевают в 2 флакона со 100-200 мл жидкой питательной среды (сахарного, печеночного или асцитического бульона). В одном из флаконов создают повышенную концентрацию СО2-10% (помещают в эксикатор со свечой для стимуляции роста B.aborus. Учитывая медленный рост бруцелл, посевы выдерживают в термостате до 1 мес. Бруцеллы на бульоне дают общее помутнение с последующим образованием слизистого осадка на дне, на агаре – гладкие, круглые мутноватые колонии. Биологический метод Для биопробы используют белых мышей и морских свинок. Животных заражают кровью внутрибрюшинно; осадком мочи и молока – подкожно. Через 20-30 дней у зараженного животного берут кровь и ставят с ней реакцию агглютинацию. Затем животных забивают, вскрывают и делают посевы крови из сердца, внутренних органов и лимфатических узлов. Выделенные чистые культуры бруцелл дифференцируют по способности роста в отсутствие повышенной концентрации углекислого газа, выделению сероводорода, чувствительности к бруцеллезному фагу и бактериостатическому действию анилиновых красителей (фуксина и тионина). Серологический метод Реакция агглютинации Райта. Реакция агглютинации – один из основных диагностических методов при бруцеллезе. Она обладает высокой специфичностью, появляется с первых дней болезни и остается положительной долгое время после заболеваний. Для реакции Райта берут 2-3 мл крови шприцем из вены или пастеровской пипеткой из пальца. Из крови получают сыворотку, первое разведение которой готовят путем смешивания 0,1 мл сыворотки с 2,4 мл физ.раствора. Затем сыворотку в разведениях 1:25, 1:50, 1:100, 1:200, 1:400 разливают по 0.5 мл в пробирки, куда затем добавляют по 0.5 мл антигена. Таким образом, степень разведения удваивается и реакция идет в разведениях 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800. В качестве антигена употребляют готовый диагностикум (взвесь убитой культуры бруцелл), который перед употреблением разводят таким образом, чтобы в 1 мл содержалось 2 млрд бруцелл. Реакция агглютинации ставится с двумя контролями: 1) испытуемая сыворотка в разведении 1:25 в физ.растворе для исключения спонтанного образования хлопьев в сыворотке (кс); 2) антиген + физиологический раствор для исключения спонтанной агглютинации антигена (ка). Пробирки ставят в термостат при t 370 на 20-24 часа, после чего учитывают результаты. Таблица 20 Схема постановки реакции Райта
Реакция Хеддльсона На стеклянную пластинку наносят сыворотку больного в количестве 0,08 – 0,04 – 0,02 – 0,01 – 0,02 мл и добавляют в нее 0,03 мл антигена, а в последнюю порцию сыворотки – 0,03 мл физ.раствора (контроль сыворотки); 0,03 мл антигена + 0,03 мл физ.раствора, (контроль антигена после чего капли смешивают и нагревают над пламенем в течение 2 минут, после чего при положительном результате быстро наступает агглютинация. Результат считается положительным при наличии агглютинации во всех четырех дозах сывороток. Таблица 21 Схема постановки реакции Хеддльсона
Аллергический метод применяют для выявления ГЗТ к бруцеллам, наблюдающейся у больных бруцеллезом, инфицированных бруцеллами лиц и привитых живой бруцеллезной вакциной. Ее ставят с 15-20 дня болезни. Аллергическая реакция бывает положительной в течение многих лет после перенесенного заболевания и у привитых. Внутрикожная аллергическая проба Бюрне (методика постановки). В среднюю часть сгибательной поверхности предплечья вводят строго внутрикожно 0,1 мл бруцеллина (прозрачный фильтрат из 3-4 недельных бульонных культур бруцелл трех типов). Реакция считается положительной, если через сутки на месте введения антигена появятся краснота и болезненный отек размером 4×6 см и выше. Микробиологическая диагностика сибирской язвы Материалом для исследования служат: содержимое карбункула и пузырьков, мокрота, испражнения, кровь, моча, секционный материал (кусочки органов). По эпид.показаниям исследуют различные объекты внешней среды, а также шерсть и щетину животных. Все образцы помещают в герметичные сосуды и транспортируют закупоренными в опломбированных боксах или деревянных ящиках в лаборатории особо опасных инфекций. Микробиологическую диагностику проводят с соблюдением правил техники безопасности как при особо опасных инфекциях. Бактериоскопический метод Первоначально из материала готовят мазки, окрашивают их по Граму и для обнаружения капсул и спор (по Ожешко). Наличие в мазках крупных грамположительных стрептобацилл, окруженных капсулой дает возможность поставить предварительный диагноз. Бактериологический метод Для выделения чистой культуры исследуемый материал заливают на МПА и МПБ. На жидких средах дают придонный рост в виде комочка ваты, не вызывая помутнения среды; на плотных средах образует крупные с неровными краями, шероховатые матовые колонии (R-форма). Под лупой колонии напоминают «гриву льва». Биологический метод В биопробе патологический материал или испытуемую культуру вводят подкожно: морским свинкам в паховой области, мышам в корень хвоста. Обычно мыши погибают через 1-2 суток, морские свинки – через 2-4 суток. У павших животных исследуют печень, селезенку, лимфатические узлы, почки, кровь из полостей сердца, места введения исследуемого материала. О наличии возбудителя сибирской язвы свидетельствует типичная патолого-анатомическая картина у подопытных животных, в мазках – отпечатках из органов и крови – наличие грамположительных капсулированных палочек. Серологический метод диагностики Серодиагностика проводится в тех случаях, когда не удается обнаружить возбудителя в материале. Для определения антител в сыворотке крови больного используют реакцию латексной агглютинации или РПГА с протективным сибиреязвенным антигеном. Сибиреязвенные антигены определяют в РИФ, ИФА, РСК, РНГА, РП в геле или реакции термопреципитации по Асколи. Реакция Асколи имеет большое значение, т.к. позволяет обнаружить возбудителя при отрицательных результатах бактериологического исследования. При массовом загрязнении посторонними микробами материалов (кожа, шерсть, особенно загнившие органы трупа) исследование производят при помощи реакции термопреципитации по Асколи. Для этого измельченный материал подвергают кипячению в физиологическом растворе в течение нескольких минут, затем фильтруют через бумажный фильтр. В полученной прозрачной жидкости содержится антиген сибиреязвенной палочки. С этим антигеном ставят реакцию преципитации со специфической сывороткой. Реакция ставится в 2-х преципитационных пробирках. В преципитационную опытную пробирку наливают 0.5 мл преципитирующей сибиреязвенной сыворотки и на нее с помощью пастеровской пипетки наслаивают полученный фильтрат (антиген). При наличии антигена в исследуемом фильтрате на границе двух жидкостей образуется кольцо преципитации. В контрольной пробирке вместо преципитирующей сыворотки используется нормальная сыворотка. Таблица 22 Лечебные, профилактические и диагностические препараты при бруцеллезе и сибирской язве
Вопросы для самоконтроля Назовите возбудителей бруцеллеза. Укажите основные морфологические и культуральные свойства бруцелл. Назовите источники и пути заражения бруцеллезом. Перечислите методы лабораторной диагностики бруцеллеза. Назовите препараты для специфической профилактики и терапии бруцеллеза. Дайте морфологическую характеристику возбудителя сибирской язвы. Перечислите методы лабораторной диагностики сибирской язвы. Какая реакция применяется для обнаружения сибиреязвенного антигены? Назовите основные методы специфической профилактики и терапии сибирской язвы. Занятие 15 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||