бизнес план. Аяулым тема. Изучение молекулярных предикторов сосудистого риска опосредованного эндотелиальной дисфункцией у людей с сахарным диабетом 2 типа

• Название: Изучение молекулярных предикторов сосудистого риска опосредованного эндотелиальной дисфункцией у людей с сахарным диабетом 2 типа
• Анкор: бизнес план
• Дата: 09.05.2023
• Размер: 1.19 Mb.
• Имя файла: Аяулым тема.docx
• Тип: Документы; #1117749
• страница: 6 из 9

ШАПЕРОНЫ И МАЛЫЕ БЕЛКИ ТЕПЛОВОГО ШОКА

Гипергликемия сопровождается развитием карбонильного стресса и накоплением различных конечных продуктов гликирования белков. Все это приводит к нарушению протеостаза, нормального функционирования ферментов и формированию агрегатов денатурированных белков. Для предотвращения этих неблагоприятных процессов происходит активация сложной системы шаперонов, препятствующих агрегации денатурированных белков и их частичной или полной ренатурации. Малые белки теплового шока (small heat shock proteins, sHsp) являются одним из компонентов системы шаперонов, и нарушение их работы может являться одним из факторов патогенеза СД2.

Мы исследовали влияние карбонильных соединений на структуру и свойства sHsp, а также факторы, влияющие на шапероноподобную активность этих белков. Известно, что при СД синтез ряда sHsp увеличивается в некоторых отделах мозга, сетчатке, сердце и клетках почек [38]. Повышение уровня sHsp защищает клетку от окислительного стресса, способствует эффективной передаче сигнала от инсулинового рецептора внутрь клетки и ингибирует процессы апоптоза. По этой причине различные способы повышения внутриклеточной концентрации малых белков теплового шока могут оказаться перспективными при лечении СД.

Связанные с СД2 нарушения метаболизма углеводов и жиров сопровождаются накоплением высокореакционных карбонильных соединений, в частности, метилглиоксаля. Существует много сведений о модификации малых белков теплового шока метилглиоксалем [39]. Эти данные в основном касаются двух малых белков теплового шока, а именно HspB1 и HspB5 (αВ-кристаллина). Эти белки эффективно модифицируются метилглиоксалем, и эта модификация может приводить к изменению олигомерной структуры, способности взаимодействовать с белками-партнерами, изменению антиапоптотической и шаперонной активности sHsp [39]. Следует отметить, что опубликованные данные достаточно противоречивы и касаются только двух из десяти экспрессируемых в тканях человека sHsp. Поэтому мы подробно исследовали модификацию малого белка теплового шока HspB6 метилглиоксалем и выяснили, что эта модификация влияет на стабильность HspB6, его способность взаимодействовать с белком-партнером HspB1, а также на способность HspB6 фосфорилироваться под действием сАМР-зависимой протеинкиназы [40].

В условиях избыточной пищевой нагрузки, карбонильного стресса и нарушенного протеостаза при СД2 особое значение имеет шапероноподобная активность sHsp, т.е. их способность предотвращать агрегацию частично денатурированных белков. Механизм шапероноподобной активности и ее зависимость от структуры sHsp и различных условий остаются малопонятными. Поэтому мы исследовали влияние различных условий и точечных мутаций на структуру и шапероноподобную активность HspB1 и HspB6. Установлено, что в условиях, моделирующих условия пищевой нагрузки внутри клетки (высокие концентрации белка, так называемый краудинг эффект), происходит изменение олигомерного состояния HspB6 [41] и HspB1 [42]. Существенные изменения в олигомерной структуре HspB1 происходят при точечных мутациях в N-концевом [43] и α-кристаллиновом доменах [42]. Эти изменения в олигомерной структуре HspB1 сопровождаются, как правило, уменьшением шапероноподобной активности sHsp. Эти данные указывают на возможный механизм шапероноподобной активности sHsp, играющих важную защитную роль при патологических процессах, происходящих при СД2.

ИНСУЛИНОВАЯ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ, КАРБОНИЛЬНЫЙ СТРЕСС И ДИСФУНКЦИЯ ЭНДОТЕЛИЯ

Эндотелий сосудов является первой мишенью инсулина в организме, секретируемого в кровоток β-клетками поджелудочной железы. Аналогично эндотелий является первой мишенью активных форм кислорода и карбонильных аддуктов метаболизма глюкозы и жирных кислот, образующихся в результате окислительного и карбонильного стресса при пищевой перегрузке, ожирении и СД2. Вместе с тем на данный момент не вполне понятно, какие изменения происходят в эндотелии в стрессовых условиях, провоцируют ли они развитие и/или поддерживают состояние сахарного диабета.

Воздействие карбонильного стресса ожидается и на ранних, и на поздних этапах патогенеза СД2. Малоновый диальдегид (МДА) характерен для ранних стадий, являясь продуктом перекисного окисления жирных кислот, избыточных при ожирении. Напротив, накопление карбонильных продуктов распада глюкозы, таких как глиоксаль (ГО) и метилглиоксаль (МГО), происходит на поздних этапах развития СД2 в условиях устойчивой гипергликемии и ведет к гликированию белков плазмы и клеток крови, в частности гемоглобина.

Для того чтобы понять, с какими этапами патогенеза СД2 может быть связана дисфункция эндотелия, мы экспериментально смоделировали условия дислипидемии, гиперинсулинемии и гипергликемии в линейных клетках EA.hy926 гибридного эндотелия сосудов человека. Для создания карбонильного стресса клетки обрабатывали несколько часов МДА, ГО или МГО; при этом МДА моделировал карбонильный стресс при дислипидемии, а ГО и МГО – при гипергликемии.

Низкомолекулярная проницаемость эндотелиального монослоя EA.hy926 повышалась только в условиях дислипидемии, но не гиперинсулинемии или гипергликемии. Это нарушение проявлялось как снижение электрического сопротивления (импеданса) монослоя как в стационарных условиях, так и при воздействии тромбина – классического индуктора проницаемости. Эти данные свидетельствуют о том, что дисфункция эндотелия может происходить при дислипидемии на ранних этапах патогенеза СД2.

Чтобы выяснить влияние карбонильного стресса, был проведен сравнительный анализ эффектов МДА, ГО и МГО на проницаемость монослоя эндотелия EA.hy926 [44]. Только МДА концентрационно-зависимо и необратимо повышал проницаемость эндотелиального монослоя в течение 4–6 ч после добавления к клеткам, тогда как ГО или МГО на эндотелиальный барьер не влияли. Аналогичное повреждающее действие оказывал неприродный глицеральдегид (ГА). Таким образом, вероятно, что только бифункциональные альдегиды с длиной углеродной цепи 3 и более влияют на проницаемость эндотелия in vitro за счет своей «сшивающей» активности, однако детальный механизм их действия требует уточнения. Избирательный эффект МДА на эндотелиальный барьер подтверждается экспериментами с FITC-меченным декстраном, которые отражают суммарную проницаемость для низко- и высокомолекулярных соединений.

Прижизненный видеоанализ клеток EA.hy926, обработанных карбонилами, показал, что только МДА угнетает их ламеллоподиальную активность. Поскольку эта активность отвечает за формирование межклеточных контактов и барьерную функцию, ее нарушение может являться клеточным механизмом действия МДА. Для того чтобы прояснить молекулярный механизм действия МДА, был проведен анализ структуры актинового и тубулинового цитоскелетов. Актин формировал нормальную сеть тонких филаментов, а тубулиновые микротрубочки – классические радиальные структуры по всей цитоплазме контрольных, а также обработанных ГО или МГО клеток. Все эти клетки формировали плотные контакты друг с другом. Напротив, в обработанных МДА клетках актиновый цитоскелет был менее выражен и деформирован. Микротрубочки распределялись хаотично, без радиальной полярности и локализовались преимущественно в центре клеток. Зоны межклеточных контактов были неоднородны и редуцированы. Эта картина хорошо согласуется с повышенной проницаемостью клеточного монослоя после обработки МДА, но не другими карбонилами.

Для того чтобы определить внутриклеточные мишени МДА и МГО, были использованы вестерн-блоттинг и специальные антитела, реагирующие со связанными с белками радикалами МДА или МГО. В клетках EA.hy926 были обнаружены три основных и несколько минорных белков, модифицируемых МДА и МГО [44]. Они соответствовали мажорным белкам в клеточных экстрактах, но отличались между собой. Если МДА в основном модифицировал белки с массами около 50, 200 и >250 кДа, то МГО – белки с массами около 50, 65 и 150 кДа. Таким образом, профили МДА- и МГО-меченных белков по большей части различны и могут отражать модификацию разных клеточных белков.

Пилотный анализ активности инсулинового каскада в клетках EA.hy926 не выявил существенных изменений в степени фосфорилирования мишеней инсулинового каскада (белки IRS, Akt и eNOS) ни в условиях дислипидемии, ни в условиях карбонильного стресса, связанного с гипергликемией и вызванного ГО или МГО. Вместе с тем, в отличие от ГО и МГО, МДА явно оказывал стрессовое воздействие, которое отражалось на активации стрессзависимых р38 МАР-киназ. Эти данные означают, что внутриклеточный механизм действия МДА скорее всего связан с прямым воздействием на белки цитоскелета, а не с нарушением работы сигнальных каскадов.

В совокупности представленные результаты свидетельствуют о большой вероятности нарушения барьерной функции эндотелия уже на ранних этапах патогенеза СД2 за счет карбонильного стресса, который опосредован МДА при дислипидемии и ожирении. Молекулярный механизм действия МДА связан, по-видимому, с ковалентной модификацией белков, в том числе цитоскелета, а не с нарушением активности сигнальных каскадов клетки. Клеточный механизм действия МДА связан с изменением структуры цитоскелета, что ведет к нарушению краевой активности цитоплазмы, дестабилизации межклеточных контактов и усилению проницаемости эндотелиального монослоя.