Курс лекций по общей микробиологии основам вирусологии двух частях
 Скачать 4.07 Mb.
|
|
Питательные среды. Для выращивания микроорганизмов (напри-мер бактерий) в условиях лаборатории или производства используют жид-кие, плотные и полужидкие питательные среды, которые должны обяза-тельно отвечать трем основным требованиям: содержать в достаточном количестве все необходимые питатель-ные вещества (источники энергии, углерода, азота), соли и ростовые фак-торы; 80 иметь оптимальное значение рН для роста данного вида бактерий; иметь достаточную влажность (при их усыхании повышается концентрация питательных веществ, особенно солей, тормозящих рост бактерий). Среды для определения культуральных свойств бактерий должны быть по возможности прозрачными, стерильными, не содержать посторон-ней микрофлоры. По своему назначению их подразделяют на следующие основные категории. Универсальные - среды,на которых хорошо растут многие видыбактерий (МПБ, МП А). Дифференциально-диагностические -позволяющие отличать однивиды бактерий от других по их ферментативной активности или культу-ральным проявлениям (среды Эндо, Плоскирева, Гисса). Дифференциально-селективные -сочетающие в себе свойствадифференциальных и селективных сред. Используются для ускорения об-наружения и идентификации бактерий. Специальные -специально приготовленные для получения тех бак-терий, которые растут очень плохо или не растут на универсальных средах (кровяной агар, среда Левенштейна - Иенсена). Синтетические -строго определѐнного химического состава. Полусинтетические -синтетические,к которым добавляют про- дукт природного происхождения (сыворотку, кровь). Способы культивирования микроорганизмов Стационарный способ. При культивировании этим способом пита-тельные среды сохраняются постоянными, никаких манипуляций с ними не производят. Преобладают анаэробные энергетические процессы. Выход биомассы незначителен. Для получения большего выхода биомассы или биологически активных соединений разработаны новые методы. Глубинный способ с аэрацией. Глубинное культивирование прово-дят в реакторах - в герметичных котлах с жидкой питательной средой, оборудованных автоматическими приспособлениями для контроля рН, О2, температуры, поступления стерильного воздуха и т.д. (цв. вклейка, рис. VII). В аэробных условиях достигается максимальное использование энергии и максимальный выход биомассы. Выход биомассы E.coli при культивировании в стационарных условиях через 18 - 20 ч - 1 млрд, а при глубинном способе через 12 - 14 ч - 50 - 60 млрд. 81 Проточный способ культивирования позволяет клеткам длитель-ное время находиться в определенной фазе роста (экспоненциальной) при постоянной концентрации питательных веществ и в одних и тех же услови-ях, обеспечивающих непрерывный рост культуры. Метод основан на том, что в культивируемую суспензию непрерывно добавляют свежую питатель-ную среду и одновременно удаляют соответствующее количество бактерий. Различают два типа аппаратов: хемостаты и турбидостаты. Хемостат - аппарат, в который постоянно добавляется свежая питательная среда. В турбидостате поддерживается постоянная плотность (мутность) бактери-альной популяции. зависимости от способа культивирования различают периодиче-ские (стационарные и при глубинном культивировании) и непрерывные (при проточном) культуры бактерий. При определенных условиях получа-ют синхронные культуры, то есть культуры, в которых все клетки одно-временно (синхронно) делятся. КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ РОСТА Для количественной характеристики ростовых процессов в микроб-ной популяции пользуются двумя показателями: абсолютная (валовая) скорость и относительная (удельная) скорость роста. Среднюю валовую скорость роста (vср) за отрезок времени (t1 -t0) можно определить по абсо-лютному приросту биомассы по формуле: где m 0 и mt - величины биомассы в начале и конце исследуемого отрезка времени. Под удельной скоростью роста понимают часовой прирост, пересчи-танный на единицу растущей массы: (х = d(lnm) / dt. Скорость размножения бактерий (число удвоений за единицу време-ни) описывают уравнением v = n / ( t 1 - t0), где n — число поколений. Продолжительность жизни одного поколения (время генерации) в среднем составляет g=(fi-fo )/n = l/v. 82 результате логарифмирования приведенных формул и их сопос-тавления установлена связь удельной скорости роста с продолжительно-стью времени генерации и скоростью размножения клеток: g = 0,693/ц; v= 1,44ц; \i = 0,693 / g. То есть между временем генерации и удельной скоростью роста су-ществует обратно пропорциональная зависимость. Скорость роста не явля-ется величиной неизменной. СТАДИИ РОСТА ПЕРИОДИЧЕСКОЙ КУЛЬТУРЫ БАКТЕРИЙ развитии микробной популяции различают следующие последова-тельные стадии: лаг-фаза; фаза логарифмического роста; стационарная фа-за; фаза гибели. Они отражают сложные процессы адаптации бактерий, привнесенных из одной среды обитания в другую, как правило, оптималь-ную для их размножения. Эти фазы можно изобразить графически в виде отрезков кривой размножения бактерий, отражающей зависимость лога-рифма числа живых клеток от времени культивирования (рис. 11). 
р ю 2 ■е- I .   Фаза отмирания ■ Время Рис. 11. Последовательные стадии роста периодической культуры бактерий Природа лаг-фазы во многом связана с тем, что в этот период про-исходит активный синтез всех компонентов белоксинтезирующей системы прежде всего такого количества рибосом, которое позволило бы обеспе-чить максимальную активность всех биосинтетических процессов. 83 Лаг-фаза (от англ. lag - запаздывание) - период между посевом бак-терий и началом размножения. Продолжительность лаг-фазы в среднем 4 - 5 ч. Бактерии при этом увеличиваются в размерах и готовятся к делению; нарастает количество нуклеиновых кислот, белка и других компонентов. Последующие стадии развития периодических культур отражают высокую скорость размножения бактерий. Фаза логарифмического (экспоненциального) роста является пе-риодом интенсивного деления бактерий. Продолжительность ее около 5 - 6 ч. При оптимальных условиях роста бактерии могут делиться каждые 20 - 40 мин. Во время этой фазы бактерии наиболее ранимы, что объясняется высокой чувствительностью компонентов метаболизма интенсивно расту щей клетки к ингибиторам синтеза белка, нуклеиновых кислот и др. Затем, в силу постепенного истощения источника энергии и других жизненно важных метаболитов, скорость размножения бактерий уменьша-ется, наступает фаза стационарного роста, при которой количество жиз-неспособных клеток остается без изменений, составляя максимальный уровень (М-концентрация). Ее продолжительность выражается в часах и колеблется в зависимости от вида бактерий, их особенностей и культиви-рования. В стационарной фазе наступает период некоторого равновесия - количество вновь образующихся клеток становится сопоставимым с чис-лом погибающих клеток. Вслед за этим наступает стадия, характеризующаяся постепенным уменьшением количества жизнеспособных бактерий. Это является следст-вием ряда причин: истощения источников энергии и других жизненно важных метаболитов, невозможности эффективно регулировать рН среды др., накопления продуктов метаболизма, тормозящих рост, и, возможно, каких-то других факторов. Завершает процесс роста бактерий фаза отмирания, характеризую-щаяся отмиранием бактерий в условиях истощения источников питатель-ной среды и накопления в ней продуктов метаболизма бактерий. Продол-жительность ее колеблется от 10 ч до нескольких недель. Очевидно, что популяция бактерий - это тоже саморегулирующаяся система, сильно зависимая от среды, истощение которой оказывает на нее отрицательное действие. Жизнеспособные клетки, перенесенные из такой среды в новую питательную среду, вновь повторяют полностью весь цикл развития популяции. Интенсивность роста и размножения бактерий зави-сит от многих факторов, в том числе от оптимального состава питательной 84 среды, окислительно-восстановительного потенциала, рН, температуры и др. В промышленных условиях при получении биомассы микроорганизмов целью приготовления антибиотиков, вакцин, диагностических препара-тов, эубиотиков культивирование бактерий и грибов осуществляют в фер-ментерах при строгом соблюдении оптимальных параметров для роста и размножения культур. НЕКОТОРЫЕ КУЛЬТУРАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА БАКТЕРИЙ При росте на жидкой питательной среде бактерии чаще всего вызы-вают ее равномерное помутнение (диффузный рост), иногда выпадение осадка (придонный рост) крошковатого (стрептококки), хлопьевидного (стрептобациллы), при этом бульон остается прозрачным. Некоторые бак-терии образуют пленку на поверхности жидкой среды (поверхностный рост): сухую чешуйчато-бородавчатую (туберкулезная палочка), тонкую нежную (холерный вибрион), рыхлую с отходящими вниз отростками «сталактитами» (возбудитель чумы). Еще более разнообразен рост на плотных питательных средах. Раз-мер, форма, консистенция, прозрачность, цвет и другие особенности коло-ний на плотной питательной среде учитываются при идентификации бак-терий, а также отборе колоний для получения чистых культур. Колонии бывают очень мелкими (0,1 - 0,5 мм), мелкими (0,5 - 3,0 мм), средними (3 5 мм) и крупными - более 5 мм в диаметре. Они могут быть круглыми (дисковидными), плоскими, иметь форму, напоминающую львиную гриву (голову медузы), ризоидными и т.п.; края колонии могут быть гладкими, зазубренными, фестончатыми, изрезанными. Поверхность колонии бывает гладкая или шероховатая, влажная или сухая, ровная или складчатая, пло-ская или выпуклая, а ее консистенция - плотная, рыхлая, слизистая. Коло-нии могут быть прозрачными, полупрозрачными, непрозрачными и разли-чаться по другим признакам, например, у некоторых бактерий центр тем-ный, а периферическая зона полупрозрачная. Культуры некоторых видов бактерий обладают характерным запа-хом, который связан с разложением органических веществ, сопровождаю-щимся образованием скатола, индола, сероводорода, меркаптана, масляной кислоты, аммиака и др. Продукты жизнедеятельности некоторых бактерий обладают приятным ароматом, который связан с образованием различных эфиров: уксусноэтилового, уксусноамилового или диацетила. В природе существуют фосфоресцирующие бактерии, культуры которых светятся в темноте зеленовато-голубоватым или желтоватым светом. Они встречают- 85 ся, главным образом, в морской и речной воде. Фосфоресценция (люми-несценция) продолжается иногда несколько часов и даже суток. Она пред-ставляет собой особую форму освобождения энергии возбужденных элек-тронов. Такие бактерии нередко обнаруживаются на мясе, чешуе рыб и других объектах. К светящимся (фотобактериям) относятся аэробные бак-терии (вибрионы, палочки, кокки). Многим видам микроорганизмов присуща способность образовывать пигменты. Цианобактерии, некоторые виды архей, а также серные и пур-пурные бактерии имеют пигменты типа хлорофилла или бактериородопси-на, с помощью которых они улавливают энергию солнца. Различные виды других бактерий образуют пигменты желтого, оранжевого, красного, сине-го или черного цвета. Окраска может быть связана как с пигментацией са-мих клеток, так и с выделением окрашенных веществ в питательную среду. Интенсивность образования пигментов зависит от состава питательной среды и условий культивирования микроорганизмов. Если пигмент не рас-творим в воде, но растворим в органических растворителях, окрашивается только культуральный налет. Так, колонии «чудесной палочки» Serratia marcescens имеют кроваво-красный пигмент,растворимый в спирте.Пиг-менты, растворимые в воде, диффундируют в питательную среду и окра-шивают ее, например, синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa) ок-рашивает среду в сине-зеленый цвет. И наконец, существуют пигменты, не растворимые ни в воде, ни в органических соединениях. Наиболее распро-странены среди микроорганизмов такие пигменты, как каротины, ксанто-филлы и меланины. Меланины являются нерастворимыми пигментами черного, коричневого или красного цвета, синтезирующимися из феноль-ных соединений. Химическая природа пигментов разнообразна: каротиноиды отно-сятся к ненасыщенным углеводородам, антоцианы и меланины - к арома-тическим соединениям и т.п. Биологическая роль этих пигментов заключа-ется, во-первых, в том, что они защищают бактерии от губительного дей-ствия солнечных лучей, поэтому в воздухе так много пигментных бакте-рий; во-вторых, пигменты участвуют в обмене веществ этих бактерий. Ме-ланины наряду с каталазой, супероксиддисмутазой и пероксидазами за-щищают микроорганизмы от воздействия токсичных перекисных радика-лов кислорода. Многие пигменты обладают антимикробным, антибиоти-коподобным действием. 86 3.5. Размножение вирусов и методы их культивирования ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВИРУСА С КЛЕТКОЙ Известны три типа взаимодействия вируса с клеткой: продуктивный тип, завершающийся образованием вирусного по томства; абортивный тип, не завершающийся образованием новых вирус ных частиц, поскольку инфекционный процесс прерывается на одном из этапов; интегративный тип, или вирогения, характеризующийся встраи ванием вирусной ДНК в хромосому клетки-хозяина. Продуктивный тип взаимодействия (репродукция вирусов). Ре- продукция вирусов (от англ. reproduce - воспроизводить) осуществляется в несколько стадий, последовательно сменяющих друг друга: - адсорбция вируса на клетке; - проникновение вируса в клетку; - «раздевание» вируса; биосинтез вирусных компонентов в клетке; - формирование вирусов; - выход вирусов из клетки. Адсорбция. Взаимодействие вируса с клеткой начинается с процессаадсорбции, то есть прикрепления вирусов к поверхности клетки. Это высо-коспецифический процесс. Вирус адсорбируется на определенных участ-ках клеточной мембраны - так называемых рецепторах. Клеточные рецеп-торы могут иметь разную химическую природу, представляя собой белки, углеводные компоненты белков и липидов, липиды. Количество специфи-ческих рецепторов на поверхности одной клетки колеблется от 104 до 105 . Следовательно, на клетке могут адсорбироваться десятки и даже сотни ви-русных частиц. Поверхностные структуры вируса, «узнающие» специфи-ческие клеточные рецепторы и взаимодействующие с ними, называются прикрепительными белками. Обычно эту функцию выполняет один из по-верхностных белков капсида или суперкапсида. Соответствие (комплемен-тарность) клеточных рецепторов вирусным прикрепительным белкам име-ет значение для возникновения инфекционного процесса в клетке. Способ-ность вирусов избирательно поражать определенные клетки органов и тка-ней организма называют тропизмом вирусов (от греч. tropos - направление). 87 Проникновение вируса в клетку. Существует два способа проник-новения вирусов животных в клетку: виропексис и слияние вирусной обо-лочки с клеточной мембраной. При виропексисе после адсорбции вирусов происходят инвагинация (впячивание) участка клеточной мембраны и об-разование внутриклеточной вакуоли, которая содержит вирусную частицу. Вакуоль с вирусом может транспортироваться в любом направлении в раз-ные участки цитоплазмы или ядро клетки. Процесс слияния осуществляет-ся одним из поверхностных вирусных белков капсидной или суперкапсид-ной оболочки. По-видимому, оба механизма проникновения вируса в клет-ку не исключают, а дополняют друг друга. «Раздевание» вируса. Процесс«раздевания»заключается в удалениизащитных вирусных оболочек и освобождении внутреннего компонента вируса, способного вызвать инфекционный процесс. «Раздевание» вирусов происходит постепенно, в несколько этапов, в определенных участках ци-топлазмы или ядра клетки, для чего клетка использует набор специальных ферментов. В случае проникновения вируса путем слияния вирусной обо-лочки с клеточной мембраной процесс проникновения вируса в клетку со-четается с первым этапом его «раздевания». Конечными продуктами «раз-девания» являются нуклеокапсид или нуклеиновая кислота вируса. Биосинтез компонентов вируса в клетке. Проникшая в клетку ви-русная нуклеиновая кислота несет генетическую информацию, которая ус-пешно конкурирует с генетической информацией клетки. Она дезоргани-зует работу клеточных систем, подавляет собственный метаболизм клетки заставляет ее синтезировать новые вирусные белки и нуклеиновые ки-слоты, идущие на построение вирусного потомства. Реализация генетической информации вируса осуществляется в со-ответствии с хорошо известными из биологии процессами транскрипции (от лат. transcriptio - переписывание, то есть синтез информационных РНК- иРНК, комплементарных матричным ДНК или РНК), трансляции (от лат. translatio - передача, то есть синтез белков на рибосомах клетки с участием иРНК) и репликации (от лат. replicatio - повторение, то есть син-тез молекул нуклеиновой кислоты, гомологичных геному). Поскольку ге-нетический аппарат вирусов достаточно разнообразен, то передача наслед-ственной информации в отношении синтеза иРНК различна. Основные схемы реализации вирусной генетической информации могут быть пред-ставлены следующим образом: для ДНК-содержащих вирусов: ДНК вируса -» иРНК -» белок вируса; 88 для РНК-содержащих минус-нитевых вирусов: РНК вируса —> иРНК —» белок вируса; для РНК-содержащих плюс-нитевых вирусов: РНК вируса —> бе лок вируса; для РНК-содержащих ретровирусов: РНК вируса —> комплемен тарная ДНК —» иРНК —» белок вируса. Для синтеза иРНК одни вирусы используют клеточные ферменты, другие - собственный набор ферментов (полимераз). Вирусная нуклеино-вая кислота кодирует синтез двух классов белков: неструктурных белков-ферментов, которые обслуживают процесс репродукции вирусов на разных его этапах, и структурных белков, которые войдут в состав вирусных час-тиц потомства. Синтез компонентов вируса (белков и нуклеиновых кислот) разобщен во времени и пространстве, то есть протекает в разных структу-рах ядра и цитоплазмы клетки. Вот почему этот уникальный способ раз-множения вирусов называется дисъюнктивным (от лат. disjunctus - разобщенный). Формирование (сборка) вирусов. Синтезированные вирусные нук-леиновые кислоты и белки обладают способностью специфически «узна-вать» друг друга и при достаточной их концентрации самопроизвольно со-единяются в результате гидрофобных, солевых и водородных связей. Су-ществуют следующие общие принципы сборки вирусов, имеющих разную структуру: формирование вирусов является многоступенчатым процессом с образованием промежуточных форм; сборка просто устроенных вирусов заключается во взаимодейст вии молекул вирусных нуклеиновых кислот с капсидными белками и обра зовании нуклеокапсидов (например, вирусы полиомиелита). У сложно уст роенных вирусов сначала формируются нуклеокапсиды, с которыми взаи модействуют белки суперкапсидных оболочек (например, вирусы гриппа); формирование вирусов происходит не во внутриклеточной жидко сти, а на ядерных или цитоплазматических мембранах клетки; сложно организованные вирусы в процессе формирования вклю чают в свой состав компоненты клетки-хозяина (липиды, углеводы). Выход вирусов из клетки. Различают два основных типа выхода ви-русного потомства из клетки. Первый тип - взрывной - характеризуется одновременным выходом большого количества вирусов. При этом клетка быстро погибает. Такой способ выхода характерен для вирусов, не имею- 89 щих суперкапсидной оболочки. Второй тип - почкование. Он присущ ви-русам, имеющим суперкапсидную оболочку. На заключительном этапе сборки нуклеокапсиды сложно устроенных вирусов фиксируются на кле-точной плазматической мембране, модифицированной вирусными белка-ми, и постепенно выпячивают ее. В результате выпячивания образуется «почка», содержащая нуклеокапсид. Затем «почка» отделяется от клетки. Таким образом, внешняя оболочка этих вирусов формируется в процессе их выхода из клетки. При таком механизме клетка может продолжительное время продуцировать вирус, сохраняя в той или иной мере свои основные функции. Время, необходимое для осуществления полного цикла репродукции вирусов, варьирует от 5 - 6 ч (вирусы гриппа, натуральной оспы и др.) до нескольких суток (вирусы кори, аденовирусы и др.). Образовавшиеся ви-русы способны инициировать новые клетки и проходить в них указанный выше цикл репродукции. |