Черника обыкновенная - фармакогнозия. Курсовая работа. Курсовая работа черника обыкновенная химический состав, фармакологическая активность, применение в клинике и препараты
 Скачать 1.08 Mb.
|
|
3.1.2. Вторичная фармакодинамика Влияние на перекисное окисление липидов Экстракт черники Эксперименты in vitro Всеобъемлющая и обширная монография Upton et al. (2001) показала, что экстракт черники защищает микросомы печени крыс от окислительного повреждения и аполипопротеина В, вызванного ультрафиолетовым излучением. Экстракт антоцианозидного комплекса из V. myrtillus был протестирован на его способность ингибировать перекисное окисление липидов и очищать гидроксильные и супероксидные радикалы (Martín-Aragón et al., 1998; 1999). Антипероксидативное действие этого экстракта V. myrtillus оценивали методом Fe3+-ADP/NADPH в микросомах печени крыс. Супероксидные анионы были получены путем приготовления смеси гипоксантина и ксантиноксидазы. Результаты были выражены в виде процентного ингибирования снижения цитохрома С (Upton et al., 2001). Laplaud et al., (1997) протестировали in vitro водный экстракт V. myrtillus на липопротеинах низкой плотности человека. Они обнаружили, что экстракт, содержащий 74,2±4,9 мг/г общих полифенолов с долей катехина 17,3±3,3%, оказывал мощное защитное действие на частицы ЛПНП при окислении меди in vitro. Следовые количества водного экстракта V. myrtillus (от 15 до 20 мкг/мл) индуцировали статистически значимые изменения в окислительном поведении липопротеинов низкой плотности (ЛПНП). Наблюдаемые эффекты включали: 1) Продление лаг-фазы производства конъюгированного диена (р<0,01); 2) Снижение образования липопероксидов и веществ, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой, до 7 часов и особенно от 1 до 5 часов (р<0,01); 3) Ингибирование модификации чистого отрицательного заряда ЛПНП. Антиоксидантный эффект экстракта можно сравнить с соответствующим 44 действием аскорбиновой кислоты или бутилированного гидрокситолуола в защите частиц ЛПНП от окислительного стресса. Антиоксидантная активность Экстракт черники Эксперименты in vitro В исследованиях in vitro, проведенных Cluzel et al. (1969; 1970), было установлено, что антоцианы V. myrtillus влияют на активность различных ферментов сетчатки у свиней и кроликов (ингибируя активность фосфоглюкомутазы и повышая активность лактатдегидрогеназы, α гидроксибутиратдегидрогеназы, 6-фосфоглюконатдегидрогеназы и α- глицерофосфатдегидрогеназы). Однако в этих исследованиях авторы использовали сложную рецептуру, состоящую, помимо экстракта черники, из других компонентов, включая бета- каротин. Поэтому нельзя исключать значительного эффекта бетакаротина, содержащегося в препарате в больших количествах. Было установлено, что экстракт очищал супероксидный анион и ингибировал микросомальное перекисное окисление липидов во всех концентрациях (25, 50, 75 и 100 мкг/мл) (р<0,01), а при конечной концентрации 25 мкг/мл наблюдалось 50% - ное ингибирование скорости реакции. Экстракт антоцианозидного комплекса был способен ингибировать перекисное окисление липидов (IC50=50,28 мг/мл) и очищать супероксидный анион (IC50<25 мг/мл). То способность удалять гидроксильный радикал, оказываемая этим экстрактом, была обнаружена из 50 мг/мл экстракта в реакционной смеси (Martín-Aragón 1998). По данным Prior et al. (1998), сравнение антиоксидантной способности у различных видов Vaccinium показало высокую активность V. myrtillus (таблица 10). Чернику экстрагировали ацетонитрилом/уксусной кислотой для анализа ORAC, общего количества антоцианов и общего количества фенолов. В заключение следует отметить, что повышенная зрелость при сборе урожая увеличивала содержание ORAC, антоциана и общего фенола. Между 45 содержанием ORAC и антоцианином (rxy=0,77) или общим содержанием фенола (rxy=0,92) существовала линейная зависимость. Таблица 10: Антиоксидантная активность V. myrtillus L. (после Prior et al., 1998). Сорт, состояние и источник ORAC 𝑅𝑂𝑂 а мкмоль /г) Антоцианин 𝑏 (мг/100 г) Фенольные соединения с (мг/100 г) A/P 𝑑 (мг/м г) Аскорб ат (мг/100 г) Черника обыкновен ная 44.6±2. 3 (282.3) 299.6±12.9 525.0±5.0 0.571 1.3±0.1 a - экспрессируется в виде эквивалентов микромоля Тролок на грамм свежих фруктов. Способность поглощения кислородных радикалов (ORAC ROO). Данные в скобках выражены на грамм сухого вещества. Черника была собрана 7/2/97 года. b - концентрация на основе цианидин-3-глюкозида в качестве стандарта. Концентрация на основе галловой кислоты в качестве стандарта. d - антоцианин/фенолы. Прямое влияние экстрактов плодов черники in vitro на окислительное фосфорилирование изолированных митохондрий сердца крыс было проверено Trumbeckaitè et al. (2013). Для тестирования использовали два типа экстрактов: гидроэтанольный экстракт (пчелиный) измельченного растительного материала готовили путем мацерации с 50% - ный этанол при комнатной температуре (1:10, В/В), первоначально в течение 48 часов и затем до истощения; водный экстракт (BAE) готовили методом реперколяции (1:10, В/В). Полученный гидроэтанольный экстракт фильтровали и концентрировали под вакуумом (при 50°С), а затем подвергали сублимационной сушке. Сублимированный порошок черники упаковывали в стеклянную банку и растворяли перед экспериментами. Уровни антоцианидинов, измеренные с помощью ВЭЖХ, варьировали в двух экстрактах (см. Таблицу 11) 46 Таблица 11: Антоцианидины в двух экстрактах, протестированных Trumbeckaitè et al. (2013) Количество антоцианидинов (нг/мл) в 1 мкл экстрактов плодов черники Экстра кт черник и Дельфинид ин Цианид ин Петунид ин Пеонид ин Мальвид ин Суммар но ЧВЭ 0.14±0.1 0.36±0.0 5 0.22±0.2 0.15±0.3 0.31±0.1 1.18±0.3 ЧЭЭ 0.18±0.2 0.80±0.1 0.26±0.1 0.19±0.2 0.28±0.3 1.71±0.2 ЧВЭ, черники плодов водный экстракт; ЧЭЭ, черники плодов этанольный экстракт. При измерении влияния экстракта черники на комплекс I-зависимый субстрат пируват плюс окисление малата частота дыхания митохондрий только в присутствии 5-30 мл/1,5 мл экстракта черники частота дыхания митохондрий в состоянии 3 снизилась с 33% до 61% (р<0,05). ЧЭЭ индуцировали снижение частоты дыхания в состоянии 3, также начиная с 5 мл/1,5 мл. Высокие дозы ЧЭЭ (15-30 мл/1,5 мл) вызывали снижение частоты дыхания в состоянии 3 на 35-56%, что аналогично БЭ. В результате при более высоких концентрациях ЧВЭ и ЧЭЭ индуцировали значительное расцепление окислительного фосфорилирования и снижение частоты дыхания в состоянии 3. Истинным механизмом снижения частоты дыхания состояния 3 при ВЕс может быть ингибирование дыхательной цепи митохондрий в комплексах I и II. Чистые антоцианы, основные компоненты используемых экстрактов, глюкозид мальвидин-3, мальвидин-3-галактозид и цианидин-3-галактозид, не оказывали влияния на окисление пирувата плюс малат. Статистически значимое снижение продукции Н2О2 митохондриями было обнаружено в присутствии экстрактов плодов черники. ЧВЭ в концентрациях 1,5 и 15 мкл/1,5 мл явно подавлял этот процесс и вызвал снижение образования H2O2 на 46% и 62% соответственно по сравнению с таковым в отсутствие ЧВЭ. Аналогичные эффекты (снижение на 50%) были получены ЧЭЭ (15 мл/1,5 мл), в то время как меньшее количество ЧЭЭ (1,5 мл/1,5 мл) подавляло образование 47 H2O2 на 16%, то есть меньше, чем ЧВЭ. Результаты показали, что влияние ЧВЭ и ЧЭЭ на функцию митохондрий является двухвалентным: более низкие концентрации (они соответствуют 6-9 мг/л общих антоцианов) не оказывали влияния на митохондрии, тогда как при высоких концентрациях (они соответствуют 18-52 мг/л общих антоцианов) экстракты вызывали явное снижение состояния дыхания, но активность радикальной очистки оставалась повышенной. Влияние ЧВЭ и ЧЭЭ на митохондрии зависело от дозы (Trumbeckaitèet al., 2013). A BE(экстракт черники) из сухих плодов, содержащих антоцианы (25,0%, w/w) (более подробная информация отсутствует), снижает вызванный UVA окислительный стресс в кератиноцитах (Svobodová et al., 2008). В первом эксперименте кератиноциты, выращенные в культуральной среде, предварительно обрабатывали BE (5-100 мг/л) в свободной от сыворотки среде при 37 °C в течение 1 часа, облучали и инкубировали в свободной от сыворотки среде при 37 °C в течение еще 4 часов. Во втором эксперименте кератиноциты облучали, и после воздействия UVA к клеткам добавляли BE (5- 100 мг/л) в среде без сыворотки в течение 4 часов. Влияние экстракта в диапазоне концентраций 1-250 мг/л, различных доз UVA (10-40 Дж/см2) или комбинаций экстракта и UVA на жизнеспособность клеток кератиноцитов оценивали через 4/24 часа. Предварительная обработка (1 час) или последующая обработка (4 часа) кератиноцитов с помощью BE привела к ослаблению повреждения, вызванного UVA. Жизнеспособность клеток определяли фотометрически. BE в исследуемых концентрациях (1-250 мг/л) не влиял на включение водорастворимых красителей в лизосомы, но снижал активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в образцах среды, содержащих 100 и 250 мг/л экстракта, через 24 часа. Последнее открытие оценивало активность цитозольного фермента, который отражает целостность клеточной мембраны. Кроме того, применение экстракта значительно снижало образование АФК (активных форм кислорода), стимулированных UVA, в кератиноцитах: максимальное снижение генерации АФК наблюдалось при концентрациях 50 48 и 100 мг/л экстракта. Введение BE также предотвращало/уменьшало вызванное UVA перекисное окисление мембранных липидов: максимальная защита наблюдалась при предварительной обработке в концентрации 50 мг/л (более 90%), последующая обработка экстрактом также заметно ингибировала повреждение мембранных липидов с максимумом в концентрациях 25 и 50 мг/л (75-80%). Экстракт также вызывал истощение внутриклеточного GSH: предварительная обработка экстрактом, значительно защищенным от UVA, вызывала истощение GSH, особенно в концентрациях 25 и 50 мг/л (55%). Постобработка была наиболее эффективной в диапазоне концентраций 50-100 мг/л (50%). В других экспериментах той же группы кератиноциты HaCaT использовались для оценки влияния предварительной и последующей обработки фенольными фракциями BE (5-50 мг/л) на повреждение кератиноцитов, вызванное ультрафиолетовым излучением солнечного симулятора (295-315 нм) (Svobodová et al., 2009). Для оценки УФ - (фото) защитной активности фенольных фракций использовали нетоксичные концентрации (5, 10, 25 и 50 мг/л) BE. Эффективно снижать степень разрушения ДНК (особенно при концентрациях 25 и 10 мг/л) вместе с активностью каспазы-3 и -9. Влияние последующей обработки на активность каспазы-3 было одинаковым для всех исследованных концентраций. Предварительная обработка кератиноцитов BE также снижает активность каспазы 9. Эффект BE зависел от концентрации (максимальная защита 87%). BE был наиболее мощным при концентрации 5-10 мг/л (около 80%), которая немного снижалась при более высоких концентрациях. Применение экстракта перед воздействием УФ-излучения значительно предотвратило фрагментацию ДНК. Эффективность BE достигала кульминации при концентрации 10 мг/л (70%), а при более высоких концентрациях защита снижалась до 50% и 40% при концентрации 25 мг/л. Фенольная фракция ягод черники обыкновенной значительно снижала выработку активных форм кислорода и азота (АФКА), окисляющих липидов, белков и ДНК. Применение BE (4 часа) к необлученным 49 HaCaT несколько снизило генерацию РОНОВ по сравнению с необработанными необлученными клетками. Эффективность экстракта показала 40% - ную защиту при самой высокой концентрации. Высшая элиминация АФКА была обнаружена в клетках после обработки. При концентрациях 25 и 50 мг/л количество фенольных фракций снижается до контрольного уровня. Экстракт снижал выработку IL-6 в облученных клетках, когда его применяли до воздействия УФ-излучения. Эффект BE зависел от концентрации с максимальной защитой 35%. Максимальная эффективность была обнаружена при самой высокой концентрации примерно 33%. Антиоксидантную активность черники обыкновенной (Vaccinium myrtillus L.) и голубики высокорослой (Vaccinium corymbosum L.) исследовали на клеточном уровне в различных клеточных линиях: рак толстой кишки человека (Caco-2), гепатокарцинома человека (HepG2), эндотелий человека (EA.hy926) и гладкая мышца сосудов крыс (A7r5). Сырой метанольный экстракт черники был дополнительно очищен с целью получения антоциановой фракции: [(сырой BE: фенольные кислоты, проантоцианидины, флаванолы, флавонолы) →(очищенный BE: антоциановая фракция)]. Антоцианы обладали внутриклеточной антиоксидантной активностью при применении в очень низких концентрациях (<1 мкг/л; диапазон нм) (таблица 12). Дельфинидин и цианидиновые гликозиды были преобладающими антоцианами в ВЕ, в то время как мальвидиновые гликозиды преобладали в экстракте черники (Bornsek et al., 2012). Таблица 12: Половинные максимальные эффективные концентрации (EC 50) экстрактов в 4 клеточных линиях (afterBornsek et al., 2012) Параметр Линия клетки Неочищенный экстракт голубики высокорослой Неочищенный экстракт черники обыкновенной Очищенный экстракт черники обыкновенной Caco-2 0.78±0.15а 0.29±0.02b 0.53±0.04ab HepG2 0.88±0.10a 0.59±0.05b 0.63±0.03ab Ea.hy926 0.17±0.02a 0.22±0.02a 0.59±0.06b A7r5 5.99±0.81a 0.36±0.02b 1.38±0.10b 50 Данные были выражены в виде среднего±SEM, количество независимых измерений составило n=6. Статистический анализ проводился с использованием oneway ANOVA с пост-тестом Бонферрони. Статистически значимые различия (р<0,05) отмечены буквами (а,в,с) в той же строке. Эффективные концентрации, достижимые после перорального введения (Mazza et al., 2002; Felgines et al., 2008), находятся в диапазоне концентраций антоцианов в плазме крови в представленных экспериментах, демонстрируя клеточную антиоксидантную активность при очень низких концентрациях в различных клеточных линиях человека. Такие значения в диапазон 1 нм достигается после употребления обычных порций ягод (McGhie и Walton2007). Цитопротекторное действие BE из свежих плодов против окислительного повреждения в первичных культурах ратепатоцитов было изучено Valentová et al., (2007). Анализ с помощью ВЭЖХ содержал 25% от общего количества антоцианы. Исследована активность BE в отношении окислительного повреждения клеток, индуцированного трет- бутилгидропероксидом и бутиловым спиртом, в первичных культурах гепатоцитов крыс. Монослои гепатоцитов инкубировали с тестируемым экстрактом в течение 4, 24 и 48 часов, и жизнеспособность клеток оценивали с помощью тест МТТ. В испытанных концентрациях (100 и 500 мкг/мл) не было зарегистрировано значительной токсичности. Экстракт продемонстрировал значительную дозозависимую защитную активность против окислительного повреждения в первичных культурах ратепатоцитов, индуцированного трет-бутилгидропероксидом и аллиловым спиртом. Максимальная цитопротекция (58,16%) была отмечена в культуре, предварительно инкубированной с 500 мкг/мл экстракта (табл. 13). Таблица 13: Защитное действие экстракта черники на индуцированное трет бутилгидропероксидом повреждение первичных культур ратепатоцитов (afterValentová et al., 2007) 51 Неочищенные tBH tBH + BE 500 μг/мл MTT (A540 нм ) 1.13±0.01 0.22±0.01a 0.71±0.04b LDH (мккатал/л) 7.74±0.25 29.8±1.6a 18.7±1.8b TBARS (мкмоль/л) 1.29±0.07 4.87±0.15a 2.94±0.4b После 30 минут предварительной инкубации с BE монослои клеток обрабатывали трет-бутилгидропероксидом (tBH, 0,5 ммоль/л) в течение 1,5 часов. Результаты выражены в виде среднего значения±SD, n=9. a p<0,01 по сравнению с необработанными клетками. b p<0,01 по сравнению с обработанными tBH клетками. Антирадикальную активность оценивали спектрофотометрически, как и способность исследуемых веществ восстанавливать 1,1-дифенил-2- пикрилгидразильный (ДППГ) радикал. Экстракт проявил продувочную активность; 50% - ное ингибирование было достигнуто при 3,99±0,14 мкг/мл (IC50). В тех же экспериментальных условиях IC50 синтетического аналога витамина Е, тролокса, составлял 2,15±0,06 мкг/мл (8,57±0,25 мкмоль/л). Оценка антиокислительной активности BE также была исследована в системе генерации супероксида ксантина/XOD. BE очищал супероксидный радикал, и его активность была эквивалентна 108±7,2 ед. СОД на мг экстракта. В той же системе тролок обладал активностью, эквивалентной 16,4±0,19 ед. СОД/мг (Valentová et al., 2007). Ogawa et al., (2011) изучили активность перекисного окисления липидов и очистки от свободных радикалов BE (содержащего более 25% антоцианозидов–дальнейшие подробности отсутствуют) в гомогенатах ткани желудка мышей. BE в диапазоне концентраций, зависящем от концентрации, значительно индуцировало снижение активности уровней перекиси липидов и выявило сильную продувочную активность в отношении супероксидных и гидроксильных радикалов (табл.14; табл. 15). 52 Таблица 14: Активность поглощения супероксидных анион-радикалов экстрактом черники и его основными антоцианидинами (дельфинидин, цианидин и мальвидин) (afterOgawa et al., 2011) Соединение IC 50 мкг/мл мкМ Черники экстракт 1.2 (1.0-1.5) Дельфинидин 1.2 (0.9-1.6) 3.5 (2.5-4.7) Цианидин 31.8 (21.8-50.9) 98.4 (67.5-157.8) Мальвидин 1.0 (0.7-1.4) 2.8 (2.0-3.8) Тролокс 130.8 (113.4-154.0) 522.4 (453.1-615.1) Таблица 15: Активность поглощения гидроксильных радикалов экстракта черники и его основных антоцианидинов (дельфинидин, цианидин и мальвидин) (afterOgawa et al., 2011) Соединение IC 50 мкг/мл мкМ Черники экстракт 116 (80-192) Дельфинидин 237 (203-305) 0.7 (0.6-0.9) Цианидин >323 >1.0 Мальвидин >367 >1.0 Тролокс 325 (275-400) 1.3 (1.1-1.6) IC 50 , 50% ингибирующая концентрация. В скобках указаны 95% - ные доверительные пределы. Изолированные соединения Различные фенольные соединения ягод, включая V. myrtillus, и их антиоксидантная активность были исследованы Kähkönen et al., (2001). Были изучены методы экстракции ягод и яблок для создания фенольных экстрактов с высокой антиоксидантной активностью. Оценку антиоксидантной активности проводили путем аутоокисления метиллинолеата (40°C, в темноте). Метод экстракции заметно повлиял как на фенольный состав, так и на антиоксидантную активность (таблица 16). Однако из наблюдения 53 полученных результатов следует, что эффекты не могут быть четко связаны с содержанием фенола в отдельных подгруппах. Таблица 16: Антоциан, флавонол, гидроксикоричная кислота (ГКК), гидроксибензойная кислота (ГБК), эллагитаннин, флаванол и процианидин, а также общее содержание фенолов (данные, выраженные в мг на 100 г веса) и антиоксидантная активность (данные, выраженные в процентах ингибирования) экстрактов черники, полученных с использованием различных методов экстракции) (afterKähkönen et al., (2001). Методы экстракции Антоцианин b Флавонол c ГКК d КБК e Элагитаннин f Флавванол g Метанол, 60% 2023±6a 62±4a 203±4ab 3.1±0.2a ND 13±1a Ацетон, 70% 2387±30b 54±2a 228±10a 3.9±0.1a ND 7.1±0.2b H2O 944±30c 18±1b 133±4c 1.0±0.0b ND 8.0±0.1b Рефлюкс 721±20d 30±1b 168±1bc 5.8±0.1c ND 10±1c Гексан 6.0±0.4e ND 0.2±0.0d ND ND ND Значения в одном столбце для каждой ягоды, имеющей одну и ту же букву, достоверно не различаются при р<0,05. Нет, не анализируется. Концентрация b на основе цианидин-3-глюкозида в качестве стандарта. Концентрация на основе рутина в стандартной комплектации. концентрация d, основанная на хлорогеновой кислоте в качестве стандарта. Эконцентрация на основе галловой кислоты в качестве стандарта. Концентрация на основе эллаговой кислоты в стандартной комплектации. gConcentration на основе as (+)-катехина в стандартной комплектации. Концентрация на основе галловой кислоты в качестве стандарта. i Ингибирование образования гидропероксида метиллинолеата после 72 часов инкубации при концентрации 500 ppm сухого сырого экстракта. j Ингибирование образования гидропероксида метиллинолеата после 72 часов инкубации в концентрации 500 ppm сухого экстракта после удаления сахара с помощью SPE. |