Черника обыкновенная - фармакогнозия. Курсовая работа. Курсовая работа черника обыкновенная химический состав, фармакологическая активность, применение в клинике и препараты
 Скачать 1.08 Mb.
|
|
Антимикробная активность Давно известно, что некоторые фенольные вещества, такие как флавоноиды, фенольные кислоты, дубильные вещества и лигнаны, обладают 54 антимикробной активностью (Heinonen 2007). Считается, что именно флавоноидный антоциановый компонент V. myrtillus оказывает такое действие. Механизм антимикробной активности может включать антиадгезионную активность, разрушение цитоплазматического фосфолипидного бислоя клеточная стенка у микробов, повреждение наружной мембраны с дезинтеграцией слоя липосахаридов (ЛПС) фенолами, комплексообразование дубильных веществ ионами металлов и ингибирование бактериями свертывания плазмы. Другим механизмом является ингибирование антибактериальной множественной лекарственной устойчивости (МЛУ) и нарушение активности насоса оттока у бактерий (Puupponen-Pimiä et al., 2005a, 2005b, 2005c). Экстракт черники Эксперименты in vitro Rauha et al. (2000) оценили антимикробную активность ряда растений, включая чернику. В исследованиях in vitro для определения диаметра зон ингибирования в агаровых культурах бактерий использовали водный раствор сухого экстракта, приготовленного из сухого растительного материала (ацетон/метанол 70% В/В–без дополнительной информации). Для образцов BE (500 мкг) был обнаружен явный антимикробный эффект в отношении Micrococcus luteus (зона ингибирования (i.z.) образца=3-4 мм>i.z. метанола и незначительной антимикробной активностью в отношении Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis, Escherichia coli и Candida albicans (i. z. образца=1- 3 мм)>i.z. метанола. Антимикробная активность многих растений, включая экстракт V. myrtillus (ацетон-вода 70:30 В/В; элюирование MeOH), приготовленный из свежих замороженных ягод, была проверена на наличие патогенных штаммов микроорганизмов человека на агаровых пластинах для оценки их роста и прилипания бактериальных клеток к ягодному материалу. BE (1 мг/мл) выявил гибель культуры Helicobacter pylori, очень сильное ингибирование роста 55 Bacillus cereus и сильное ингибирование роста Clostridium perfringens и золотистого стафилококка (Nohynek et al., 2006). Связывание Neisseria meningitidis pili с ягодами черники обыкновеннойи полифенольными фракциями сока, содержащими антоцианы, проантоцианидины и флавонолы, было идентифицировано Toivanen et al. (2009; 2011). Предотвращение адгезии патогенных бактерий к поверхности клеток-хозяев может представлять собой защиту от активности бактерий, которые используют адгезины для колонизации клеток-хозяев. Активность черники в отношении грамположительных и грамотрицательных кишечных патогенов изучали в культурах сальмонелл, стафилококков, листерий и лактобактерий in vitro (Puupponen-Pimiä et al., 2005a; 2005b). Были протестированы БЭС (вода/этилацетат/метанол), полученные из свежих замороженных ягод, содержащих фенольные кислоты и фракции, элюированные метанолом (эллагитанины и антоцианы). BE (2 мг/мл) ингибировал рост золотистого стафилококка в течение 12 и 24 часов (5х101 - 5х102) и Salmonella enterica Typhimurium (10-5х101). Фракции BE (10 мг/мл) проявляли более сильное ингибирование против золотистого стафилококка (>5x104) в течение 12 и 24 часов по сравнению с контролем. Более сильное ингибирование роста наблюдалось также в отношении Salmonella enterica Typhimurium (5x102-5x103) по сравнению с контролем. Влияние различных препаратов, приготовленных из свежих ягод, на жизнеспособность трофозоитов лямблий двенадцатиперстной кишки и спонтанное выделение ооцист Cryptosporidium parvum было изучено в экспериментах in vitro Anthony et al., (2007, 2011). Водорастворимые экстракты черники, содержащие полифенолы (167 мкг/мл эквивалентов галловой кислоты), убили 90,4+2,8% трофозоитов Giardia duodenalis. Увеличение спонтанной экскистации ооцист Cryptosporidium parvum наблюдается после введения BE (эквивалентно 213 мкг/мл галловой кислоты). Поскольку антоцианы составляют более 70% полифенолов, был сделан вывод, что они могут быть ответственны за антипротозойную активность черники. 56 Сок черники Эксперименты in vitro Аналогичные эксперименты были проведены Huttunen et al. (2011), которые в ходе исследований in vitro обнаружили, что фракция молекулярного размера 10-100 кДа (9 мг/г) черничного сока ингибирует связывание Streptococcus pneumoniae с клетками бронхов человека (Calu-3) в модели адгезии. Ингибирование адгезии соком черники, состоящим в основном из небольших количеств фенольных соединений с низкой молекулярной массой, составило 52%. Исследуемые фракции были лишены растворителей и растворимы в воде. Напротив, соковые фракции черники обыкновенной с более высокой молекулярной массой с преобладанием антоцианов, проантоцианидинов и флавонолгликозидов оказывали антиагрегационное действие на бактерий, распространенных при патологии зубного налета в полости рта: Streptococcus mutans с Fusobacterium nucleatum или Actinomyces naeslundi (Riihinen et al., 2011). Противоопухолевая активность Экстракт черники Эксперименты in vitro Экстракты плодов черники проверяли на противоопухолевую активность с помощью тестов in vitro, чтобы определить способность индуцировать детоксикацию II фазы хинонредуктазы и ингибирование индукции орнитиндекарбоксилазы. Неочищенные экстракты, содержащие антоциановую и проантоцианидиновую фракции, показали незначительную активность (Bomser et al., 1996). Esselen et al., (2011) исследовали влияние BE на активность топоизомераз в бесклеточной системе и в клетках рака толстой кишки человека HT29. Топоизомеразы I и II являются мишенями клинически используемых противоопухолевых препаратов. Использовали BE, содержащий 36% w/w антоциана. Основные концентрации антоцианов были установлены методом масс-спектрометрического анализа ВЭЖХ. Около 1,2 57 миллиона клеток HT29 были разложены в чашки Петри (две чашки Петри для одной концентрации) и позволяли расти в течение 48 часов. Белок топоизомеразы определяли с помощью кроличьих поликлональных антител, специфичных либо к топоизомеразе I, топоизомеразе II а, либо к топоизомеразе II в. Влияние BE на рост клеточной линии HT29 определяли с помощью анализа сульфородамина В. Инкубация клеток HT29 с экстрактом до 500 мкг/мл в течение 72 часов приводила к ингибированию роста клеток, но не достигала значения IC50. Однако экстракт мощно ингибировал каталитическую активность топоизомеразы I в концентрации 25 мкг/мл. Активность топоизомеразы I была полностью подавлена экстрактом в концентрациях ≈ 50 мг/мл.Было обнаружено, что BE ингибирует каталитическую активность топоизомеразы II в концентрациях, превышающих 1 мкг/мл. Каталитическая активность топоизомеразы IIa была полностью заблокирована при 5 мкг/мл. Аналогичные эффекты были получены с рекомбинантной топоизомеразой IIb. Предварительная и совместная инкубация клеток HT29 с BE (1 г/мл) значительно подавлял (р<0,001) разрушающие нити эффекты камптотецина. Было обнаружено, что экстракт значительно уменьшает разрывы нитей ДНК, опосредованные доксорубицином, в концентрациях ≈ 1 мкг/мл (р<0,001). Авторы пришли к выводу, что антоцианы отдают предпочтение ингибированию топоизомеразы II (Esselen et al., 2011). Изолированные соединения Эксперименты in vitro Lamy et al., (2007) изучали активность антоцианидинов (агликонов антоцианов) в предотвращении миграции клеток глиобластомы. Поскольку полная резекция злокачественных глиобластом невозможна из-за их диффузной структуры, разработка новых проектов по терапии и профилактике рака очень важна. Было обнаружено, что агликоны антоцианов: цианидин, дельфинидин и петунидин действуют как мощные ингибиторы миграции 58 клеток глиомы (U-87). Наиболее мощным был обнаружен дельфинидин 3- оглюкозид (5, 10, 20 мкм (р<0,05, р<0,01) и 50 мкм (р<0,001)), с достоверными различиями по сравнению только с контролем. Поскольку антоцианы пересекают гематоэнцефалический барьер и переходят в ЦНС в диапазоне концентраций 192,2±57,5 нг/г после введения однократной дозы (Passamonti et al., 2003), было отмечено, что хронический прием может значительно ингибировать миграцию клеток глиобластомы и может повлиять на результаты лечения рака (Lamy et al., 2007). Противоязвенная активность Экстракт черники Эксперименты in vivo Противоязвенная активность BE (соответствующая 25% антоцианидинов) была протестирована in vivo на крысах линии Вистар в экспериментальных моделях язв, вызванных пилорической лигатурой, язв, вызванных использованием резерпина, фенилбутазона, язв, вызванных ограничением и местным нанесением уксусной кислоты на слизистую оболочку желудка (Cristoni and Magistretti 1987). Результаты экспериментов сравнивали с контрольными группами и группами крыс, получавших карбеноксолон и циметидин. Результаты проведенных экспериментов анализировались с помощью U-критерия Манна-Уитни или t-критерия Даннетта (Таблица 19; Таблица 20; Таблица 21; Таблица 22; Таблица 23). Таблица 19: Активность экстракта V. myrtillus в модели язвы пилорической лигатуры у крыс (afterCristoni and Magistretti 1987) Вещество Доза мг/к г Количеств о животных Средний индекс изъязвлени я в среднем ±S.E. % ингибирован ия Число не изъязвленн ых желудков Контроль - 10 49.00±15.3 5 - 0 Экстракт черники 10 12 40.50±11.4 9 -17 1 59 Контроль - 11 35.36±9.10 - 2 Экстракт черники 25 13 18.85±4.77 -47 0 50 13 16.54±3.71 -53 1 Контроль - 13 47.46±10.3 7 - 1 Экстракт черники 100 13 12.46±3.89 (**) -74 3 Контроль - 14 44.50±6.83 - 1 Карбеноксол он 50 12 28.16±7.02 (*) -37 0 100 12 28.08±5.93 (*) -37 0 Контроль - 14 43.78±6.99 - 1 Циметидин 50 13 30.15±7.17 -31 2 100 16 31.43±7.14 -28 1 Вещества вводили за 50, 30, 25, 6 часов до и сразу после пилорической лигатуры (*) р<0,05; (**) р<0,01; U-тест Манна-Уитни. Таблица 20: Активность экстракта черники обыкновенной в модели резерпиновой язвы у крыс (afterCristoni and Magistretti 1987) Вещество Доз а мг/к г Количест во животных Средний индекс изъязвления в среднем ±S.E. % ингибирован ия Число не изъязвленн ых желудков Контроль - 18 19.56±2.31 - 0 Экстракт черники 25 17 10.52±1.41(* *) -46 0 50 16 6.31±1.35 (**) -68 0 100 14 3.71±0.92 (**) -81 2 Контроль - 12 21.25±4.72 - 0 Карбеноксол он 25 13 8.88±2.27 (**) -58 0 50 12 6.16±0.99 (**) -71 0 100 12 1.42±0.97 (**) -93 0 Контроль - 17 20.28±3.39 - 2 Циметидин 100 14 24.3±6.78 +20 0 60 Вещества вводили один раз в день в течение 8 дней; (**) р<0,01 (U-тест Манна-Уитни). Таблица 21: Активность экстракта черники обыкновенной в модели язвы фенилбутазона у крыс (Cristoni and Magistretti 1987) Вещество Доза мг/кг Количество животных Средний индекс изъязвления в среднем ±S.E. % ингибирования Контроль - 20 0.42±0.07 - 33 3.39±0.26 - Экстракт черники 50 19 2.55±0.16 -25 100 17 1.88±0.20 (*) -45 200 20 1.27±0.23 (**) -63 Контроль фенилбутазона - 35 3.08±0.28 - Карбеноксолон 50 25 2.25±0.31 -27 100 10 1.49±0.41 (*) -52 200 10 1.31±0.24 (**) -57 Контроль фенилбутазона - 10 2.14±0.39 - Циметидин 20 10 1.62±0.37 -24 40 10 1.09±0.34 (*) -49 80 10 0.62±0.20 (*) -71 Вещества вводили два раза в день в течение 4 дней (*) р<0,05; (**) р<0,01; U-тест Манна-Уитни. Таблица 22: Активность экстракта черники обыкновенной в модели язвенной болезни у крыс (Cristoni and Magistretti 1987) Вещество Доза мг/кг Количество животных Средний индекс изъязвления в среднем ±S.E. 0 1 3 6 Контроль - 8 3.75±0.97 4.37±0.65 3.50±0.53 3.25±0.45 Экстракт черники 25 8 3.87±0.83 3.75±0.56 3.62±0.50 2.00±0.38 (*) 50 8 4.00±0.65 2.87±0.40 2.12±0.55 1.25±0.45 61 (**) 100 8 3.75±0.83 1.75±0.80 (**) 1.12±0.40(**) 0.25±0.25 (**) Контроль - 8 3.87±0.47 4.0±0.27 5.37±0.56 4.25±0.25 Карбеноксолон 50 3.87±0.47 3.50±0.60 4.12±0.55(*) 3.37±0.18(*) Вещества давали один раз в день. (*) р<0,05; (**) р<0,01; U-критерий Манна-Уитни. Таблица 23: Активность экстракта V. myrtillus в модели язвы уксусной кислоты у крыс (Cristoni and Magistretti 1987) Вещество Доза мг/кг Площадь язв в мм2 (Среднее значение±S. E.) Число животных 6 Число животных 12 Контроль - 15 52.35±2.25 20 13.12±0.99 Экстракт черники 50 15 44.19±1.64 (**)(-16) 19 9.67±0.86(- 26) 100 15 39.27±2.08 (**)(-25) 20 7.62±0.63 (**)(-42) Контроль - 16 60.86±1.95 15 11.32±0.64 Карбеноксолон 50 17 54.52±1.56 (*)(-10) 15 8.40±0.80 (**)(-26) Контроль - 12 55.02±2.56 12 11.52±2.15 Карбеноксолон 100 10 35.60±1.93 (**)(-35) 12 5.34±0.78 (*)(-33) Контроль - 12 50.97±2.11 12 14.32±1.66 Циметидин 100 12 37.83±2.88 (**)(-26) 11 9.58±1.53 (*)(-33) Сократительная способность гладких мышц Экстракт черники Эксперименты in vivo Влияние BE (соответствующего 25% антоцианидинов на мышцы желудка крыс) на стимуляцию постганглионарных волокон было изучено in vitro Bettini et al. (1986). Экстракт в концентрации 1-4 мкг/мл усиливал сократительную способность мышц желудка крыс препаратами, стимулированными внутримышечно. Эффект усиливался добавлением аскорбиновой кислоты (500 мкг/мл). Ганглиозная блокада с использованием гексаметония (20 мкг/мл) частично снижала стимулирующий ответ (таблица 62 24). Авторы пришли к выводу, что BE усиливает высвобождение АХ на уровне постганглионарных нервных окончаний. Таблица 24: Среднее процентное увеличение ответа препарата на трансмуральную стимуляцию (после Bettini et al., 1986) А В Экстракт черники(4 мкг/мл) 1407 782.25 Аскорбиновая кислота (500 мкг/мл) 455 201.5 Экстракт черники(4 мкг/мл) + Аскорбиновая кислота (500 мкг/мл) 20015 1003.5 А) в стандартном растворе Кребса; Б) с гексаметонием (20 мкг/мл); обратите внимание, что процентное увеличение больше в отсутствие гексаметония. 3.1.3. Фармакология безопасности Агрегация тромбоцитов Влияние BE (содержащего 36% антоцианозидов) на агрегацию тромбоцитов у человека было изучено первоначально Bottecchia et al., (1987), позже Pulliero et al., (1989) и Morazzoni and Magistretti (1990) на кроликах и крысах. Экстракт черники В предварительных исследованиях in vitro Bottecchia et al. (1987) показали 50% - ное ингибирование ретракции сгустка в концентрации 75 мкг/мл BE. Кроме того, агрегация тромбоцитов, индуцированная АДФ, коллагеном и арахидоновой кислотой, ингибировалась в зависимости от концентрации (50, 100 и 150 мкг/мл). Исследователи полагали, что BE стимулирует высвобождение простациклина (PGI2), который оказывает эффект увеличения концентрации внутриклеточного цАМФ или снижения уровня тромбоксана А2 в тромбоцитах. В экспериментах, проведенных Мораццони и Магистретти (1990) на кроликах и крысах in vitro и in vivo, была проверена не только активность 63 БЭМ, но и три основных антоцианозида, присутствующих в экстракте. БЫТЬ, так как дипиридамол и аспирин ингибировали агрегацию тромбоцитов (таблица 25). Как цианидин 3-Оглюкозид, так и дельфинидин 3-О-глюкозид и мальвидин 3-О-глюкозид, добавленные в плазму кролика, ингибировали агрегацию тромбоцитов, индуцированную АДФ, коллагеном и арахидонатом натрия (таблица 26). Таблица 25: Ингибирование агрегации тромбоцитов кроликов с помощью БЭМ, дипиридамола и аспирина (после Morazzoni and Magistretti 1990) Агрегирующий агент Значения IC50* (мг/мл PRP или GFP**) Экстракт черники Дипиридамол Аспирин ADP 0.36(0.89-0.14) 0.36(0.64-0.20) IC50 недоступна (активна только 2-я фаза) Коллаген 0.32(0.42-0.24) 0.22(0.31-0.16) 0.04(0.05-0.02) Арахидонат 0.60(0.84-0.43) 0.50(0.77-0.32) 0.01(0.01-0.009) Арахидонат (GFP) 0.81(1.14-0.58) - - PRP (богатая тромбоцитами плазма) * Значения IC50 определяли после 3-минутной инкубации тестируемого соединения (30 сек для дипиридамола) с PRP или GFP при 370C. Каждое значение IC50 и его конфиденциальные пределы (в скобках) были рассчитаны на основе четырех-одиннадцати экспериментов, проведенных с четырьмя-шестью концентрациями ингибитора. **Отфильтрованные в геле тромбоциты (GFP) получали с использованием альбуминового буфера Тирода в соответствии с Tangen et al., 1971. Табл. 26: Ингибирование агрегации тромбоцитов кролика цианидом 3- О-глюкозоидом, мальвидином 3-О-глюкозидом и дельфинидином 3-О- глюкозидом (после Мораццони и Магистретти, 1990). Агрегирую щий агент Значения IC50 * (мг/мл PRP) Экстра кт черник и Восстановлен ный экстракт** Цианиди н3- Мальвиди н3- Оглюкози Дельфиниди н3-Оглюко 64 Оглюкоз ид ADP 0.39 (0.70- 0.22) 0.43 (0.62-0.29) 0.36 (0.45-0.28) 0.36 (0.89- 0.14) 0.51 (0.60-0.44) Коллаген 0.26 (0.53- 0.13) 0.64 (1.10-0.38) 0.57 (0.73-0.45) 0.32 (0.42- 0.24) 0.87 (1.01-0.74) Арахидонат 0.42 (0.82- 0.22) 0.68 (0.97-0.47) 0.55 (0.72-0.42) 0.60 (0.84- 0.43) 0.73 (0.89-0.59) PRP (богатая тромбоцитами плазма) *Значения IC50 определяли после 3-минутной инкубации тестируемого соединения с PRP при 37oC Каждое значение IC50 и его конфиденциальные пределы (в скобках были рассчитаны по четырем-одиннадцати экспериментам, выполненным с четырьмя-шестью концентрациями ингибитора. **Восстановленный экстракт: смесь, содержащая 38% цианидина 3-О-глюкозида, мальвидина 3-О-глюкозида и дельфинидина 3 - О-глюкозида в том же соотношении, что и в экстракте черники обыкновенной. BEM значительно и дозозависимо (5-400 мг/кг) индуцировал у крыс in vivo удлинение времени кровотечения. Эффект не зависел от влияния на систему свертывания крови. Действительно, значения гематокрита (44,9±0,3; Контроль 44,7±0,4), Цефотеста (18,6±0,7; Контроль 19,4±0,9) и Нормотеста (26,7±1,2; контроль 25,8±1,1) были нормальными через 2 часа после однократного приема внутрь экстракта (400 мг/кг) (таблица 27). Таблица 27: Временной ход влияния однократных пероральных доз БЭМ (100 мг/кг) на время кровотечения у крыс (после Мораццони и Магистретти, 1990) Время кровотечения (сек) (среднее±С. Е.) 10 животных/группа До После 2 ч До После 4 ч До После 8 ч До После 24 ч До Контроль 96±6 102± 6 96±7 93±7 93±7 90±6 93±7 96±9 96±7 Экстракт черники 100 мг/кг 96±7 174± 6** 99±8 159± 11* 93±7 150± 7** 96±6 144± 7** 102±6 65 Аспирин Дипиридамол 50- 25 мг/кг 105±7 177± 8** 102±7 174± 9* 90±6 171± 10** 87±7 114± 7* 105±8 *р≤0,05; **р≤0,01 с тестом для парных данных. Эксперимент проводился на группах по 10 крыс каждый раз. Аналогичное тиклопидину изменение адгезивности тромбоцитов было обнаружено у самцов мышей после однократного перорального введения BEM в дозе 400 мг/кг за 2 часа до теста. В группе лечения было обнаружено выраженное снижение количества адгезивных тромбоцитов по сравнению с контрольными значениями (табл. 28) Таблица 28: Влияние однократной пероральной дозы ВЕМ и тиклопидина гидрохлорида на адгезивность тромбоцитов самцов мышей (после Мораццони и Магистретти, 1990). Доза мг/кг Количество животных Адгезивные тромбоциты (%) В среднем±S. E. % Изменения адгезии тромбоцитов Контроль - 105 47.06±1.39 - Экстракт черники 400 20 25.30±2.66** -46 Тиклопидина гидрохлорид 100 72 26.82±1.82** -43 BEM и тиклопидина гидрохлорид вводили перорально за 2 часа до теста (**р≤0,01 при t-тесте Даннетта) |