Паталогоанатомическое вскрытие трупов животных (методичка). Место, обстановка и время вскрытия

• Название: Место, обстановка и время вскрытия
• Анкор: Паталогоанатомическое вскрытие трупов животных (методичка).doc
• Дата: 26.04.2017
• Размер: 0.7 Mb.
• Имя файла: Паталогоанатомическое вскрытие трупов животных (методичка).doc
• Тип: Документы; #5613
• Категория: Биология. Ветеринария. Сельское хозяйство
• страница: 3 из 10

Окраска эластических волокон резорцинфуксином Вейгерта

Фиксация материала в абсолютном спирте, формалине.

Необходимые материалы

1. 
   Литиевый кармин Орта. К 100 мл насыщенного раствора углекислого лития добавляют 2,5 г. кармина, кипятят 5—10 мин; и после охлаждения фильтруют через фильтроваль­ную бумагу.
   
2. 
   1%-ный солянокислый спирт (70°).
   
3. 
   Этиловый спирт-ректификат 70°—80°.
   

4. Раствор фуксилина. В 200 мл дистиллированной воды растворяют 2 г основного фуксина и 4 г резорцина. Нагрева­ют и добавляют 25 мл оффицинального раствора полуторахлористого железа. Кипятят 5 мин, помешивая, охлаждают и фильтруют. Фильтрат выбрасывают, а фильтр с оставшимся осадком кладут в чашку, в которой кипятили смесь. Добавляют 200 мл 96° спирта и осторожно нагревают до кипения на водяной бане. Спиртовый раствор краски охлаждают и фильтруют в градуированный цилиндр, доливают 200 мл 96° спиртом и добавляют 4 мл крепкой соляной кислоты (уд. вес 1,16—1,19).

Ход окраски

1. 
   Срезы окрашивают в ядерном красителе, лучше литие­вом кармине Орта 10—15 мин.
   
2. 
   Переносят в 1%-ный солянокислый спирт (70°) на 5—15 мин.
   

1. 
   Споласкивают срезы в 70°—80° спирте.
   

3. 
   Помещают в профильтрованный раствор фуксилина на 20—30 мин.
   

2. 
   Промывают в 70°—80° спирте 1—2 мин.
   

4. 
   Дифференцируют в 1%-ном солянокислом спирте под контролем микроскопа до четкого выявления эластических волокон (1—3 мин.).
   

3. 
   Спирты, ксилол, бальзам.
   

Результаты окраски: ядра клеток красные, эластические волокна темно-синие.

Импрегнация серебром ретикулярной стромы. Способ Фута

Фиксация материала в 15—20%-ном растворе формалина. После фиксации промывание в проточной воде 24—48 часов, а затем несколько часов в дистиллированной. Срезы получают на замораживающем микротоме. Работать только с химичес­ки чистыми реактивами, посуда безукоризненно чистая, пере­носят срезы только стеклянными иголками.

Необходимые материалы

1. 
   0,25%-ный водный раствор марганцевокислого калия.
   
2. 
   5%-ный раствор щавелевой кислоты.
   
3. 
   2%-ный раствор азотнокислого серебра.
   
4. 
   Раствор аммиачного серебра: на каждые 5 мл 10%-ного раствора AgNO₃ прибавляют 4—5 капель 40%-ного водного раствора (гидрата окиси аммония) NH₄OH. Образуется осадок (темно-бурый) гидрата окиси серебра. Осадок растворяют 25%-ным нашатырным спиртом, добавляя его по каплям, хорошо взбалтывая. На 5 мл 10%-ного AgNO₃ необходимо 15—25 капель 25%-ного NH₄OH.
   
5. 
   Гидрат окиси аммония.
   
6. 
   5%-ный раствор формалина.
   
7. 
   0,5—1%-ный раствор хлорного золота.
   
8. 
   5%-ный водный раствор гипосульфита.
   
9. 
   Дистиллированная вода.
   

Ход окраски

1. 
   Замороженные срезы из дистиллированной воды переносят в 0,25%-ный водный раствор марганцевокислого калия на 5—10 мин.
   
2. 
   Споласкивают в водопроводной воде.
   
3. 
   Выдерживают в 5%-ном растворе щавелевой кислоты 15—30 мин (до побеления срезов).
   
4. 
   Тщательно промывают (20—30 мин) в большом количестве дистиллированной воды.
   
5. 
   Выдерживают в темноте 48 часов в 2%-ном растворе азотнокислого серебра (AgNO₃).
   
6. 
   Быстро (3—5 сек) споласкивают в дистиллированной воде.
   
7. 
   Выдерживают 15—20 мин в свежеприготовленном и профильтрованном растворе аммиачного серебра.
   
8. 
   Споласкивают в дистиллированной воде (5—15 сек, вре­мя выбирают эмпирическим путем).
   
9. 
   Помещают в 5%-ный раствор формалина на 15—30 мин
   

10. 
    Тщательно промывают в водопроводной воде.
    
11. 
    Перекладывают в 0,5— 1%-ный раствор хлорного золо­та (АиС1₃) на 5—10 мин.
    
12. 
    Промывают в водопроводной воде (10—15 мин).
    

13.Обрабатывают в 5%-ном водном растворе гипосульфита 1—3 мин. Контролируют под микроскопом, споласкивая в воде.

14. Тщательно промывают в водопроводной воде — от нескольких часов до суток.

15. 
    Ядра клеток докрашивают квасцовым кармином или гематоксилином.
    

Проводят через спирт, карбол-ксилол и заключают в бальзам. Результаты окраски: ретикулярные волокна черные, коллагеновые волокна фиолетовые, коричневые или серовато-черные.
Окраска замороженных срезов для выявления жира Суданом III

Необходимые материалы

1. Судан III

Рецепт: спирта 70°— 100 см³

Судана III — 0,3 г.

Кипятят несколько минут на водяной бане, охлаждают, филь­труют.

2. 
   Гематоксилин Майера или Вейгерта.
   
3. 
   1%-ный раствор соляной кислоты.
   

2. 
   50%-ный раствор глицерина для заключения срезов под покровное стекло.
   

окраски

Срезы заключают в глицерин под покровное стекло

Результаты окраски: жир оранжево-красного цвета; ядра синие, лиловые; протоплазма бесцветная.

Очень хорошие результаты для выявления жира получают при окраске щелочным Суданом по Герксгеймеру:спирт абсолютный (или 96°) —70 мл.

10%-ный раствор едкого натра — 20 мл,

дистиллированная вода — 10 мл.

судан III или IV — 0,25—1,6 г.

Кипятят в течение нескольких минут на водяной бане. Окрас­ка 3—5 мин.
Окраска на слизь муцикармином Мейера

Способ фиксации и приготовления срезов не имеет значе­ния.

Необходимые материалы

1. 
   Квасцовый гематоксилин (с. 23).
   
2. 
   1%-ный солянокислый спирт.
   
3. 
   Раствор муцикармина.
   

Приготовление муцикармина: готовую краску разводят 50%-ным спиртом из расчета 1,5 г сухого красителя на 100 мл спирта.

Ход окраски

1. 
   Окрашивают срезы квасцовым гематоксилином.
   
2. 
   Промывают в воде.
   
3. 
   Дифференцируют в 1%-ном солянокислом спирте.
   

1. 
   Подсинивают в слабощелочной воде и снова хорошо
   промывают в водопроводной воде в течение 5 мин.
   
2. 
   Выдерживают в растворе муцикармина, разведенном в
   5 раз водой, 10—15 мин (в неразведенном 5—10 мин.).
   

4. 
   Промывают срезы в воде.
   
5. 
   Проводят через спирты, ксилол и заключают в бальзам. Результаты окраски: слизь окрашивается в красный цвет, ядра клеток — в синий.
   

Реакция Шифф — йодная кислота (ШИК — реакция)

С помощью этой реакции можно выявить гликоген, мукопротеиды, гликопротеиды, гликолипиды. Фиксация — форма­лин, спирт, жидкость Карнуа. Срезы парафиновые и заморо­женные.

Необходимые материалы

1. 
   Йодная кислота или перйодат натрия или калия.
   
2. 
   Реактив Шиффа.
   

Приготовление реактива Шиффа. 1 г основного фуксина растворяют в 200 мл кипящей дистиллированной воды и, пери­одически встряхивая сосуд с раствором, продолжают кипя­чение в течение 5 минут. Затем, охладив до 50°, раствор фи­льтруют, добавляют 20 мл 1 н раствора НС1 и охлаждают до 25°, после чего добавляют 1 г метабисульфита натрия (Na₂S₂O₅) или калия (K2S2O5) и оставляют в темноте. Через 18—24 часа добавляют 2 г активированного угля, фильтруют. Готовый реактив светло-желтого цвета.

3. 
   Сернистая вода. К 200 мл дистиллированной воды прибавляют 10 мл 10%-ного раствора биосульфита натрия и 10 мл нормального раствора соляной кислоты.
   
4. 
   Дистиллированная вода.
   

Ход окраски

1. 
   Срезы из воды погружают в раствор йодной кислоты на 5—10 мин или перйодата натрия или калия на 20—30 мин.
   
2. 
   Тщательно промыть в двух—трех порциях дистиллиро­ванной воды (по 3—5 мин), чтобы удалить остаток йодной кислоты.
   
3. 
   Помещают в реактив Шиффа на 10—20 мин.
   
4. 
   Обрабатывают в трех порциях свежеприготовленной сернистой воды (1—2 мин.).
   
5. 
   Промывают в водопроводной воде в течение 10 мин, ополаскивают в дистиллированной.
   
6. 
   Обезводить, просветлить и заключить в бальзам (перед заключением возможно проводить докраску срезов гематок­силином).
   

Результаты окраски: полисахариды пурпурно- или лилово-красного цвета, нейтральные мукополисахариды пурпурно-красные, гликоген более темный.
Выявление гликогена кармином по методу Беста

Фиксация материала в жидкостях Буэна, Карнуа, спир­те. Заливка материала в целлоидин.

Необходимые материалы

1. 
   Квасцовый гематоксилин.
   
2. 
   1%-ный солянокислый спирт.
   
3. 
   Раствор кармина.
   

Приготовление раствора. Основной раствор: в 60 мл дис­тиллированной воды растворить 2 г кармина, 1 г углекислого калия и 5 г углекислого хлористого калия. Кипятить в тече­ние 5 мин, охладить, фильтровать. Добавить 20 мл 28%-ного раствора аммиака. Хранить при температуре 0—4°С.

Раствор для окрашивания: 8 мл основного раствора, 15,5 мл аммиака (уд. вес 0,880) и 24 мл метанола.

4. 
   Раствор Беста: к 8 мл абсолютного спирта добавить 4 мл метанола и 10 мл дистиллированной воды.
   

Дистиллированная вода. Ход окраски

1. 
   Окрашивают в квасцовом гематоксилине до 5 мин.
   
2. 
   Ополаскивают в воде, отдифференцировывают окраску ядер в 1%-ном подкисленном спирте.
   
3. 
   Ополаскивают в дистиллированной воде.
   
4. 
   Помещают в карминовый раствор для окрашивания на 15—30 мин.
   
5. 
   Дифференцируют в растворе Беста от нескольких секунд до нескольких минут.
   
6. 
   Промывают в 80° спирте.
   
7. 
   Обезводить, просветлить и заключить в бальзам.
   

Результаты окраски: ядра темно-синие, гликоген ярко-красный.

Примечание: кроме метода Беста для выявления гликогена, а также гликогена в соединении с углеводами существуют методы по Шабодашу, Мак-Манусу и ряд других.
Реакция Фельгена для выявления дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК)

Фиксация кусочков из тканей и органов в 10%-ном нейт­ральном формалине или в смеси Карнуа. Заключение кусоч­ков в парафин.

Необходимые материалы

1. 
   Соляная кислота.
   
2. 
   Раствор Шиффа (приготовление см. с. 29).
   

1. 
   Раствор бисульфита. К 5 мл 10%-ного раствора К2С2О5 добавить 5 мл 1 н соляной кислоты и долить воды до 100 мл.
   

3. 
   Дистиллированная вода.
   

Ход окраски

1. 
   Срезы быстро сполоснуть в холодной 1 н НС1 (соляная кислота).
   
2. 
   Поместить срезы в 1 н НС1 при 60° (на водяной бане) на оптимальный срок гидролиза (3—10 мин.).
   
3. 
   Быстро сполоснуть в 1 н НС1 и затем в дистиллирован­ной воде.
   
4. 
   Перенести срезы в раствор Шиффа или фуксин-сернис­тую кислоту (в закрытом сосуде) на 1—2 часа.
   
5. 
   Осушить и сполоснуть срезы в трех порциях свежепри­готовленного раствора бисульфита.
   
6. 
   Сполоснуть в проточной воде (5—10 мин.).
   
7. 
   Обезводить в спирте в течение 5—10 мин.
   

8. 
   Просветлить в двух порциях ксилола по 3 мин. в каждой.
   
9. 
   Заключить в бальзам.
   

Результаты окраски: ДНК окрашивается в различные от­тенки красновато-пурпурного цвета.

Метод Браше с применением метилового зеленого-пиронина и рибонуклеазы для выявления рибонуклеиновой кислоты (РНК)

Фиксация кусочков в 10%-ном нейтральном формалине или в смеси Гелли, Карнуа (4—16 часов). Заключение кусоч­ков в парафин.

Необходимые материалы

1. Раствор метилового зеленого-пиронина. Приготовить растворы А и В, смешать их перед употреблением в соотно­шении 1:1.

Раствор А: 17,5 мл 5%-ного водного раствора пиронина G, 10 мл 2%-ного водного раствора метилового зеленого, промы­того в хлороформе, и 250 мл дистиллированной воды.

Раствор В: М/5 ацетатный буфер с рН 4,8. Смесь раство­ров хранится не более недели.

2. 
   Ацетон.
   
3. 
   1%-ный раствор рибонуклеазы.
   

Ход окраски

1. 
   Окрасить срез раствором метилового зеленого — пиро­нина в течение 10 мин—24 часа.
   
2. 
   Быстро сполоснуть срезы в дистиллированной воде.
   
3. 
   Высушить досуха фильтровальной бумагой.
   
4. 
   Быстро обезводить в абсолютном ацетоне (10—15 сек).
   
5. 
   Быстро сполоснуть в смеси равных объемов ацетона и ксилола (10—15 сек).
   
6. 
   Быстро сполоснуть в 10%-ном растворе ацетона и кси­лола.
   
7. 
   Просветлить в двух порциях (1—2 мин) чистого ксило­ла по 10 мин в каждой.
   
8. 
   Заключить в канадский бальзам, но лучше в дистриндибутилфталатксилол.
   

Контрольные срезы: для проверки метода неокрашенные срезы, предварительно фиксированные смесью Гелли или Кар­нуа, обрабатывают 1%-ным раствором рибонуклеазы при тем­пературе 60°—65°С (термостат) в течение 90 мин.

Результат окраски: РНК окрашивается в розово-красный цвет, а ядра в сиреневый
Метод Гросс-Бильшовского-Лаврентьева (для выявления периферических нервов и нервных окончаний)

Фиксация материала в 10%-ном нейтральном формалине, лучше в смеси АФА. Срезы готовят методом замораживания .30—50 мкм.

Необходимые материалы

1. 
   Жидкость АФА: неразведенный формалин, спирт 96° и 1%-ный раствор мышьяковистой кислоты. Составные части берут порог
   

1. 
   Раствор азотнокислого серебра.
   

Приготовление раствора азотнокислого серебра: к любому количеству 20%-иого азотнокислого серебра добавляют по j-ный нашатырный спирт до тех пор, пока образу­ющийся хоричнево-бурып осадок при сильном взбалтывании и дальнейшем прибавлении нашатырного спирта не раство­ряется.

3. 
   Раствор хлористого золотя.
   
4. 
   5%-пый раствор гипосульфита. ■
   

Ход окраски

после промывки срезов в дистиллированной воде (1— 2 мин) срезы помещают в 20%-ный раствор азотнокислого се­ребра на 1—30 мин. (время устанавливают опытным путем).

2. Переносят (минуя воду) в 20%-ный- формалин (4—5 см3 раствора) до отхождения мути.

3. 
   Переносят в опалесцирующий раствор аммиачного серебра (к нему добавляют еще 25%-ного нашатырного спирта 1 —15 капель) в часовых стеклах. Процесс импрегнации наб­людают в микроскоп.
   
4. 
   Срезы переносят в разведенный нашатырный спирт (1 часть 25%-ного нашатырного спирта и 2 части дистилли­рованной воды) на 10—15 мни.
   
5. 
   Тщательно промывают в нескольких порциях дистилли­рованной воды в течение нескольких часов.
   
6. 
   Переносят в слабый раствор хлорного золота (можно пользоваться золотохлористоводо родной кислотой) на 1/2—1
   

7. Помещают срезы в 5%-пый раствор гипосульфита на 5 — 10 мин

8. 
   Тщательно промывают в дистиллированной воде (нес­колько часов).
   
9. 
   Подкрашивают, по желанию, любыми красителями.
   

10. Обезвоживают, просветляют и заключают в бальзам.

Результаты окраски: элементы нервной системы выявляются в виде черных образований на общем светло-коричневом фоне.

Методы выявления калия, кальция, железа, меди

Выявление калия (методом Макаллума). Из свежей тка­ни готовят срезы на замораживающем микротоме и поме­щают еще замороженные срезы в реактив, составленный сле­дующим образом: к 20 г азотнокислого кобальта добавить 35 г азотнокислого натрия, долить 10 см³ ледяной уксусной кислоты и 65 см³ дистиллированной воды. Через несколько часов фильтруют и доливают водой до 100 см³. Время окрас­ки 0,5—1—2 часа, затем реактив отсасывают и несколько раз промывают срез очень холодной водой.

Срезы расправляют на предметном стекле и заключают в каплю глицерина — сернистого аммония (50 см³ 50%-ного глицерина+ 50 см³ сернистого аммония).

Результаты окраски: зерна калия черные.

Выявления кальция (методом Косса).

Фиксация материа­ла в 96° спирте, срезы замороженные или парафинированные. Помещают срезы на 0,5—1 час в 3%-ный раствор азотнокис­лого серебра, промывают в дистиллированной воде. Обраба­тывают 1—2 мин в 50% -ном растворе гипосульфита натрия, хорошо промывают в дистиллированной воде (3 раза сме­нить), ядра можно докрасить квасцовым кармином пли саф­ранином.

Результаты окраски: кальций, вначале желтый, переходит в черный цвет.

Существует более чувствительный метод Кретена с галло­вой кислотой и формалином (см. спец. руководство).

Выявление железа (метод с турнбулевой синью)

Фиксация материала в 10%-ном формалине, фиксаторе Буэна. Срезы замороженные или парафиновые. Срезы после дистиллированной воды поместить в насыщенный раствор сер­нистого аммония на 1—24 часа (светло-желтый цвет раство­ра), тщательно промыть дистиллированной водой, перенести на 10—20 мин в свежеприготовленную смесь равных частей 20%-ного раствора красной кровяной соли (Кз[Ре(СЫ₆)]) и 1%-ной соляной кислоты, промыть в дистиллированной во­де, докрасить ядра кармином или сафранином. Бальзам.

Результаты окраски: соли железа окрашиваются в синий цвет.

Выявление гемосидерина

Окрашивают срезы гематоксилин-эозином. При этой окраске гемосидерин имеет вид аморфных глыбок ржавого или бурого цвета. Следует также подчеркнуть, что при обыч­ной окраске срезов гемосидерин имеет сходство с меланином, липофусцином и формалиновым пигментом. Окраска срезов по Перлсу дает возможность отдифференцировать гемосидерин от других сходных пигментов.

Гистохимическая реакция гемосидерина в тканях по Перлсу

Необходимые материалы

1. Смесь Перлса: i %-ный раствор: желтой кровяной соли (железисто-синеро­дистого калия) — 2 г, воды дистиллированной — 100,0 см³. 2%-ный раствор: соляной кислоты— 1 см³, воды дистиллированной— 100 см³. Оба раствора смешивают в пропорции 1:1,5 перед упот­реблением.

2. Кармин Гренахера: кармина — 1,0,
квасцов калийных — 5,0,

воды дистиллированной — 100 см³.

Кипятят 20 мин., после охлаждения фильтруют.