Паталогоанатомическое вскрытие трупов животных (методичка). Место, обстановка и время вскрытия

• Название: Место, обстановка и время вскрытия
• Анкор: Паталогоанатомическое вскрытие трупов животных (методичка).doc
• Дата: 26.04.2017
• Размер: 0.7 Mb.
• Имя файла: Паталогоанатомическое вскрытие трупов животных (методичка).doc
• Тип: Документы; #5613
• Категория: Биология. Ветеринария. Сельское хозяйство
• страница: 2 из 10

МИКРОСКОПИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ И ПАТОГИСТОЛОГИЧЕСКАЯ ТЕХНИКА.

Микроскопическое исследование трупа — очень важный момент: оно дополняет вскрытие, а при ряде заболеваний дает возможность поставить правильный диагноз; оно совершенно необходимо при неясной картине вскрытия. Исследованию подвергают кровь, различные органы, ткани, патологические образования (например, опухоли), содержимое тех или других полостей (экссудаты, транссудаты), секреты желез, выделения из органов и пр.

Все эти материалы можно изучать в свежем состоянии и в виде фиксированных и окрашенных мазков и препаратов как в процессе самого вскрытия, так и через некоторое время. Желая гистологически исследовать какой-либо орган, из него вырезают кусочки в виде пластинок толщиной 0,5 см и фиксируют в 10% формалине (1 часть продажного формалина на 10 частей воды) или какой-либо другой фиксирующей жидкости. Кусочки принято вырезать из разных мест органа, прежде всего из тех, которые дают картину неясных изменений, а также из участков измененной и нормальной ткани. Еще лучше одновременно сохранить весь орган, а в случаях необычных, уклоняющихся от общего типа, оставлять все органы, чтобы впоследствии иметь возможность произвести дополнительные исследования и полностью восстановить действительную картину.

Изучая патологический материал в свежем состоянии, пользуются препаратами, изготовленными различными способами, а именно: мазками, расщипанными, раздавленными препаратами, висячей каплей и, наконец, срезами, полученными бритвой от руки или на замораживающем микротоме: мазки делают из органов мягкой консистенции (селезенка, лимфатические узлы, мозг, некоторые опухоли и т. д.) путем соскабливания ткани с поверхности их разреза, а также из крови трупа и различных патологических скоплений.

Раздавленные препараты применяются при исследовании мышц на трихины, саркоспоридии, пузырчатые глисты; расщипанные при желании изолировать отдельные элементы ткани, например мышечные волокна, клетки опухоли и т. д. (исследуемый объект при помощи иголок расщипывают в капле физиологического раствора на предметном стекле до едва видимых частиц).

Правила взятия материала для патологогистологического исследования

1. 
   Материал следует брать от свежих трупов не позднее 12 часов после смерти (убоя) животного, т. е. до наступления процессов аутолиза и гниения.
   
2. 
   Материал должен быть взят: от каждого органа, где обнаружены макроскопические видимые изменения, а также от главнейших внутренних органов.
   
3. 
   От каждого патологически измененного органа нужно брать несколько кусочков из различных мест поражения.
   
4. 
   В вырезанном для исследования кусочке, кроме измененного участка, должна быть нормальная ткань.
   
5. 
   Вырезанные кусочки должны представлять собой пластинки толщиной не более 0,5—1 см.
   
6. 
   Материал должен фиксироваться немедленно и непосредственно после взятия.
   
7. 
   Следует избегать размозжения кусочков ткани, для этого необходимо пользоваться острыми инструментами (бритвы, секционные ножи). Ножницами лучше пользоваться при взятии материала из тонкостенных полых органов (кишечник, желчный пузырь и др.). Кусочки кости лучше выпиливать лобзиком.
   
8. 
   Следует избегать обмывания и очистки поверхностей органов, из которых иссекается кусочек.
   
9. 
   Учет взятого материала для исследования ведут в журнале, где кратко описывают, от какого животного и органа взят материал.
   

Фиксация материала

Первым и обязательным условием в патологогистологической технике является предупреждение и задержка развития посмертных изменений (аутолиза и гниения) в тканях и органах. Таким образом, фиксация — это закрепление тканевых структур в том виде, в каком они были в момент взятия патологического материала. Взятые кусочки фиксируют путем обработки их в фиксирующих жидкостях.

Сущность фиксации окончательно не выяснена. Известно лишь, что при этом происходит коллоидная реакция превращения тканевых белков из золя в гель, т. е. коагуляция (свертывание) их без грубых нарушений структуры клеток.

Фиксирующие жидкости по-разному оказывают влияние на различные нормальные и патологические компоненты ткани и органов. Поэтому в каждом конкретном случае выбирают фиксаторы в зависимости от целей и задач исследования. Профиксированный материал можно сохранять длительное время. Недостатком метода фиксации является некоторое искажение структуры органа (уплотнение, сморщивание и др.). Искажение истинной структуры органа называется артефактом, который корректируется наблюдением свежих объектов, использованием различных фиксаторов.

Фиксирующие жидкости разделяют на простые и сложные. Простые фиксирующие жидкости состоят из одного химического вещества (формалин, спирт, ацетон). В состав сложных фиксирующих жидкостей входит несколько веществ, и называется она по имени автора, например, жидкость Мюллера, Орта, Карнуа и др.

Общие правила фиксации материала

1. 
   Материал фиксируется непосредственно и немедленно после взятия.
   
2. 
   Для фиксации материала следует употреблять стеклянную, керамическую или полиэтиленовую посуду (избегать металлическую).
   
3. 
   Объем фиксирующей жидкости должен в 5—10 раз превышать объем фиксируемого материала.
   
4. 
   Для лучшего и равномерного проникновения фиксатора по всей толще кусочка его погружают в сосуд с фиксирующей жидкостью, на дно которого необходимо положить вату.
   
5. 
   Фиксирующая жидкость меняется каждые сутки до тех пор, пока не станет прозрачной.
   
6. 
   Материал снабжается этикеткой из плотной бумаги (фотобумага, ватман). Краткие сведения о патологическом материале на этикетке пишут графитным карандашом или тушью (рис. 2).
   
7. 
   Фиксирование производится без доступа света.
   
8. 
   Повышенная температура ускоряет фиксацию. Оптимальная температура фиксации +37°С. Для некоторых фиксаторов необходима более низкая температура (до 0°С).
   

Самым распространенным, доступным и эффективным фиксатором является формалин, который представляет собой 40%-ный водный раствор газа формальдегида (альдегид муравьиной кислоты, НСНО)

Правила фиксации материала в формалине

1. 
   Формалин хранится в темном помещении или в темной посуде при температуре не ниже +9°С.
   
2. 
   Продажный формалин нейтрализуют прибавлением сухого мела или углекислой магнезии до 1/10—1/20 его объема.
   

3. Рабочей фиксирующей жидкостью является 10—20%-ный водный раствор формалина: нейтрального формалина — 10—20 см³, воды водопроводной — 90—80 см³. Разводить формалин дистиллированной водой не рекомендуют, т. к. она имеет слабокислую реакцию, вследствие чего вызывает набухание тканей.

4. 
   Показателем окончания фиксиции в формалине является исчезновение кровавой окраски в глубоких частях фиксируемого объекта (приблизительно 24—48 час).
   
5. 
   Иногда применяют метод экстренной фиксации:
   

• 
  кусочек материала толщиной менее 0,5 см помещается в пробирку с 20%-ным водным раствором формалина;
  
• 
  нагревается на пламени газовой горелки или спиртовки в течение 3—5 минут до появления пузырьков (не кипятить).
  

Достоинства фиксации материала в формалине

1. 
   Простота метода.
   
2. 
   Достигается хорошая сохранность гистроструктур, а также возможность сохранения объектов довольно долгое время.
   

Недостатки метода

1. 
   Невозможность выявления веществ, растворимых в воде (гликоген, мочевая кислота и др.)
   
2. 
   Не удается четко обнаружить тонкие цитологические структуры.
   

Для выявления веществ, растворимых в воде, применяют безводные фиксаторы (спирт, ацетон). Этиловый спирт употребляют как абсолютный, так и 96° этиловый спирт. Время фиксации продолжается от 2 до 24 час, в зависимости от толщины исследуемого объекта. При этом удается сохранить такие вещества, как муцины, гликоген, мочевую кислоту, железо, кальций. Вместе с тем спирт вызывает некоторое сморщивание клеток в результате быстрого отнятия воды, растворяет жиры и гемоглобин. Метиловый спирт (метанол) применяют для цитологических исследований в качестве фиксатора мазков крови и отпечатков с органов и тканей. Метанол — сильный яд, хранится по правилам ядовитых веществ группы А. Ацетон применяется при необходимости быстрого фиксирования ткани. Толщина фиксируемых объектов 3—4 мм, время фиксации 2—3 часа.

Для выявления тонких цитологических структур употребляются сложные фиксирующие жидкости.

1. Жидкость Мюллера

Рецепт: Двухромовокислого калия — 2,5; Сернокислого натра — 1,0; Дистиллированной воды — 100,0. Продолжительность фиксации 1—6 недель (при t=37°, 1—2 недели — с ежедневной сменой жидкости).

2. Жидкость Орта

Рецепт: Жидкости Мюллера — 90,0; Формалина продажного— 10,0. Продолжительность фиксации 1—2 суток.

3. Жидкость Ценкера

Рецепт: Жидкость Мюллера— 100,0; Сулемы — 5,0; Уксусной кислоты — 5,0

(добавляется перед употреблением). Продолжительность фиксации 6—12 часов.

Примечания.

1. 
   После окончания фиксации промывка в воде 24 часа.
   
2. 
   Освобождение от сулемы в 70° спирте.
   
3. 
   Хранится фиксированный материал в 70° спирте.
   

4. Жидкость Карнуа

Рецепт: Спирта абсолютного — 60,0; Хлороформа — 30,0; Уксусной ледяной кислоты— 1G,O (extempore). Продолжительность фиксации 2—4 часа, после чего кусочки переносят в чистый спирт (96° или абсолютный).

5. Жидкость Буэна

Рецепт: Насыщенного водного раствора пикриновой кислоты — 75,0; Формалина (неразведенного) — 25,0; Ледяной уксусной кислоты — 5,0. Жидкость готовится перед употреблением. Продолжительность фиксации от 1 до 24 часов в зависимости от толщины объекта.

Правила пересылки патологического материала

В случаях возникновения необходимости подтверждения причины гибели животного необходимо соответствующий патологический материал направить в диагностическую ветеринарную лабораторию для исследования.

В лабораторию посылается заранее профилированный материал (реже консервированный). При пересылке материала необходимо предусмотреть, чтобы материал был помещен в посуду с притертой пробкой (герметическая укупорка). Пробка должна быть закреплена проволочкой или бечевкой и залита менделеевской замазкой, сургучом, смолой, парафином или воском. Посуду обкладывают ватой, паклей, стружками и вкладывают в ящик. Кости обвертывают целлофаном, полиэтиленовой пленкой или смоченными в дезрастворе марлей или полотном и также упаковывают в ящик. В холодное время года для пересылки используют 30—50%-иый раствор глицерина, приготовленный на 10%-ном формалине, 70%-ный спирт или насыщенный раствор поваренной соли. Трупы мелких животных, части трупов крупных животных и отдельные органы в свежем (не фиксированном) виде посылают в диагностическую ветеринарную лабораторию только с нарочным. Пересылаемый материал от животных, подозрительныхпо заболеванию инфекционной болезнью, должен быть тщательно упакован в плотный деревянный или металлический ящик. Перед упаковкой материал необходимо завернуть в холст или мешковину, смоченную дизинфицирующим раствором (креолина, лизола, известкового молока), и уложить в ящик со стружками, мякиной или опилками.

На каждый отправленный в лабораторию материал заполняют сопроводительный документ. Это письмо посылают одновременно с материалом, почтой или нарочным. При необходимости к письму прилагают дополнительные сведения, в частности, какая помощь оказана животному, какие лекарственные средства применялись, с какого времени скармливался корм животным и т. д. Обязательно указывают эпизоотологические данные.

Следует исключать случаи посылки идентичного материала в разные лаборатории для исследования. Так как морфологические изменения при болезни могут находиться только в одной части объекта, а в другой они отсутствуют, отсюда и результаты исследований будут разными.

Подготовка патологического материала к микротомированию

1. 
   Удаления извести (декальцинации) в исследуемом кусочке. Известь препятствует изготовлению срезов и поэтому должна быть удалена. Кости и обызвествленные ткани фиксируют по общим правилам. Все методы декальцинации основаны на растворении извести в слабых растворах кислот. Кислота в свою очередь нейтрализуется слабыми щелочными растворами.
   
2. 
   Уплотнения кусочков органов и тканей при помощи плотных прозрачных сред (целлоидина, парафина, желатина и др.). Заливка материала в плотные среды необходима: для гомогенизации (однородности) обрабатываемого материала; для скрепления («цементирования») тканевых элементов материала. Традиционными способами уплотнения материала являются лед, целлоидин, парафин и желатина.
   

Получения срезов на микротомах

Срезы могут быть изготовлены толщиной 1—2 мкм. Наиболее употребительными являются срезы толщиной 6— 12 мкм.

Аппараты, на которых изготовляются срезы, называются микротомами.

Наиболее употребительными микротомами являются:

1. 
   Замораживающие микротомы: а) циллиндрический,системы «Сарториус»; б) микротом ТОС-1 с термоэлектрическим охлаждающим столиком.
   
2. 
   Санный (салазочный) микротом.
   
3. 
   Микротом Майнота (Minot) для изготовления серийных срезов с парафиновых блоков.
   
4. 
   Ультрамикротомы различных марок.
   

Основных частей у каждого микротома пять: 1) станина, 2) держатель ножа, 3) предметный столик, 4) микрометрическая установка, 5) микротомный нож.

Заключение окрашенных срезов под покровное стекло

Целью окраски срезов является оптическая дифференцировка структурных элементов клеток и тканей.

Употребляемые в гистологической технике краски делятся на 4 группы:

1. Кислые (фоновые, протоплазматические) краски, например, эозин, фуксин кислый, пикриновая кислота, отсюда и термин оксифилия — любящий кислоту, т. к. некоторые тка­невые элементы воспринимают или окрашиваются только кислотными красителями.

2. Основные (ядерные), например, гематоксилин.

3. Нейтральные, например, метиленблау, нейтраль-рот (нейтрофилия).

4. Специальные, например, судан III и др.

Процесс окраски заключается в обработке среза в красящих растворах, контрастных по цвету и различных по химическому характеру.

Эозин (кислая краска красного цвета) реагирует со щелочной протоплазмой (оксифилия).

Гематоксилин (краска с щелочной реакцией лилового цвета) реагирует с кислым ядром (базофилия).

Метахромазия — такое явление, когда краска окрашивает ткань в другой цвет, нежели она сама. Например, тионин, муцикармин и др. являются красками синего цвета, а слизь окрашивают в красный цвет.

Способы окраски

Гематоксилин-эозин — обязательная ориентировочная окраска.

Дополнительные методы окраски, например, на соединительную ткань, жир, гемосидерин, эластику и т. д.

Следует помнить, что на качество окраски влияют способ фиксации, а также предварительная и последующая обработка препарата. Красящие растворы должны быть чистыми, для чего любой краситель необходимо перед употреблением отфильтровывать, а водный раствор готовить только на дистиллированной воде. Окрашивать лучше красками низкой концентрации в течение длительного времени. Лучше срезы перекрашивать, а затем доводить до требуемой окраски путем отмывания в соответствующей жидкости, что позволяет более отчетливо видеть определенные элементы тканей. Окраска должна вестись под контролем микроскопа в течение длительного времени. Лучше срезы перекрашивать, а затем доводить до требуемой окраски путем отмывания в соответствующей жидкости, что позволяет более отчетливо видеть определенные элементы тканей. Окраска должна вес­тись под контролем микроскопа.

Окраска срезов гематоксилин—зозииом

Необходимые материалы

1. 
   Гематоксилин. Эту краску получают из коры кампеше­вого дерева, красящим веществом является продукт его окис­ления — гематеин (С₁₆Н₁₂О₆).
   
2. 
   Существует много рецептов окисления гематоксилина: например, квасцовый гематоксилин (гемалаун) Майера, же­лезный гематоксилин Вейгерта, гематоксилин Эрлиха и т. д.Гемалаун Майера: гематоксилина — 1,0, квасцов калийных — 50,0, йодноватокислого калия — 0,2, воды дистиллированной —1000,0. Гематоксилин Вейгерта: 1 %-ный раствор гематоксилина в спирте. Полуторахлористого железа — 4 см³,
   

соляной кислоты — 1 см³, воды дистиллированной — 95 см³.

Оба раствора приготовляют отдельно, смешивают перед употреблением в равных объемах.

Примечания.

1.50%-ный раствор водного хлорного железа FeCl₃-6H₂O— желто-бурая масса.

2. 
   Соляная кислота — 1 %-ный водный или спиртовый раствор.
   
3. 
   Эозин (анилиновая краска) —0,1 — 1 %-ный водный или спиртовый раствор.
   

Результаты окраски: 1) ядра лиловые, синие, 2) цитоплазма клеток — различные тона красного цвета.
Окраска по Маллори

Окраска по Маллори один из оригинальных способов ок­раски коллагеповых волокон. Фиксация в жидкостях Ценкера, Гелли.

Необходимые материалы

1. 
   Литиевый кармин.
   
2. 
   1 %-ный солянокислый спирт (70°).
   
3. 
   0,1 %-ный водный раствор кислого фуксина.
   
4. 
   1 %-ный водный раствор фосфорно-молибденовой кислоты.
   
5. 
   Водорастворимый раствор анилинового синего.
   
6. 
   Оранж G.
   
7. 
   Кристаллическая щавелевая кислота.
   
8. 
   Дистиллированная вода.
   

Ход окраски

1. 
   Срезы помещают в профильтрованный литиевый кармин на б—10 мин и более и, не споласкивая в воде, переносят в 1 %-ный солянокислый спирт (70°) на 3—5—10 мин.
   
2. 
   Промывают в дистиллированной воде (3—5 мин).
   
3. 
   Окрашивают в 0,1%-ном водном растворе кислого фуксина 2—3 мин.
   
4. 
   Быстро споласкивают в воде.
   
5. 
   Переносят (для протравливания) в 1 %-ный водный
   раствор фосфорно-молибденовой кислоты на 2—5 мин.
   
6. 
   Быстро споласкивают в воде.
   
7. 
   Окрашивают в свежефильтрованном красящем раство­ре следующего состава:
   

Анилиновый синий (водорастворимый препарат —0,5 г.

Оранж —2,0

Щавелевая кислота (кристаллическая) — 2,0

Дистиллированная вода— 100,0 мл.

Смесь нагревают до кипения, охлаждают и фильтруют.

Продолжительность окраски 1—2 мин.

8. 
   Промывают в воде 1/2—1 мин.
   
9. 
   Дифференцируют в 96° спирте в течение нескольких минут (3—5), контролируя под микроскопом, пока отчетливо выступят волокнистые структуры.
   

10. . Проводят через абсолютный спирт, просветляют в кси­лоле и заключают в бальзам.

Результаты окраски: коллагеновые волокна темно-синие, ядра, эритроциты и эластические волокна красные; амилоид, гиалин и слизь — синие, мышечная ткань оранжевая, невроглия и ганглиозные клетки красновато-фиолетовые.