Лабораторная диагностика холеры. МУК 4.2.2218-07 Лабораторная диагностика холеры. Методические указания мук 221807

• Название: Методические указания мук 221807
• Анкор: Лабораторная диагностика холеры
• Дата: 24.04.2022
• Размер: 2.25 Mb.
• Имя файла: МУК 4.2.2218-07 Лабораторная диагностика холеры.doc
• Тип: Методические указания; #492616
• страница: 5 из 7

6.7. Оценка антибиотикочувствительности

Для оценки антибиотикочувствительности холерного вибриона используют дис­ко-диффузионный метод и методы серийных разведений в агаре и бульоне.

Методы и критерии оценки антибиотикочувствительности холерного вибриона разработаны и стандартизованы для указанных методов и ограниченного перечня анти­биотиков: ампициллина, тетрациклина, доксициклина, ко-тримоксазола, хлорамфеникола.

Для оценки чувствительности холерного вибриона к другим антибиотикам, пре­жде всего к фторхинолонам, временно предлагается использовать методы и критерии оценки, разработанные для микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae. В пользу возможности такого допущения говорит тот факт, что методы и критерии, разработан­ные для перечисленных выше антибиотиков, полностью совпадают с таковыми для се­мейства Enterobacteriaceae.

В международной практике основной средой, используемой во всех методах оценки антибиотикочувствительности, является среда Mueller-Hinton (агар и бульон). Рассматриваемые в последующих разделах критерии величины МПК, позволяющие от­нести исследуемые микроорганизмы к одной из категорий: «чувствительные», «устой­чивые» или «промежуточные», разработаны именно для среды Mueller-Hinton.

Следует признать возможность использования для оценки антибиотикочувстви­тельности и других сред (например, АГВ) в том случае, если они удовлетворяют требо­ваниям, изложенным в разделе 6.7.3. Контроль качества питательных сред для опреде­ления антибиотикочувствительности с учётом соответствующих требований проводят в лабораториях учреждений, имеющих необходимые для этого референтные штаммы микроорганизмов. Указанные учреждения ежегодно информируют курируемые лабора­тории о возможности использования для этих целей конкретных питательных сред с указанием номера серий и даты выпуска или снабжают их готовыми партиями сред.

6.7.1. Методы серийных разведений

Постановка методов серийных разведений для оценки антибиотикочувствитель­ности включает следующие этапы:

• 
  приготовление растворов антибиотиков;
  
• 
  приготовление питательных сред с антибиотиками;
  
• 
  приготовление суспензии исследуемого микроорганизма, ее стандартизация и инокуляция;
  
• 
  инкубация;
  
• 
  учет и интерпретация результатов.
  

Общим и крайне важным этапом для всех методов серийных разведений являет­ся приготовление растворов антибиотиков.

Приготовление растворов антибиотиков

Различают основные растворы антибиотиков – пригодные для хранения и рабо­чие – используемые «ex tempore» для приготовления питательных сред.

Для приготовления основных растворов антибиотиков предпочтительно исполь­зовать субстанции препаратов с известной активностью, допускается использование готовых инъекционных лекарственных форм препаратов, оральные лекарственные формы не пригодны. Для приготовления навесок антибиотиков необходимо использо­вать аналитические весы или другие равного класса точности.

Основные растворы антибиотиков готовят в концентрации 1000,0 мкг/мл и вы­ше. Навески антибиотиков для приготовления основных растворов готовят с учетом их активности.

В связи с тем, что антибактериальные препараты существенно различаются по растворимости, в ряде случаев возникает необходимость использовать разные вещества для первичной солюбилизации препаратов (растворители) и для доведения их до задан­ной концентрации (разбавители). В тех случаях, когда растворители и разбавители яв­ляются разными веществами, для солюбилизации антибиотика необходимо использо­вать минимально возможное количество растворителя.

Отличные от воды растворители и разбавители для отдельных антибиотиков приведены в табл. 7. Основные растворы необходимо хранить при температуре не вы­ше -20°С (сроки хранения отдельных антибиотиков при этой температуре существен­но различаются). Оптимальными условиями для хранения основных растворов анти­биотиков является температура -60°С и ниже, длительность не более 6 месяцев.








С целью предотвращения конденсации влаги извлеченные из морозильника фла­коны с основными растворами антибиотиков, прежде чем открыть, необходимо выдер­жать до достижения ими комнатной температуры.

Размороженные основные растворы должны быть использованы для приготов­ления рабочих растворов, их повторное замораживание не допускается.

Из основных растворов антибиотиков готовят рабочие двукратные концентра­ции. За основу берется конечная концентрация антибиотика в питательной среде, рав­ная 1,0 мкг/мл (более высокие - 2, 4, 8 и т. д.; более низкие - 0,5; 0,25; 0,125 и т. д.). Ре­альные концентрации рабочих растворов должны учитывать фактор разбавления рас­твора антибиотика в питательной среде (обычно 1 : 10 в плотной среде и 1 : 2 в жид­кой). Для приготовления рабочих растворов используется дистиллированная вода (ме­тод серийных разведений в агаре) или жидкая питательная среда (метод серийных раз­ведений в бульоне).

Примерный диапазон концентраций антибиотиков, используемых при оценке чувствительности к отдельным препаратам, приведен в табл. 8. В зависимости от целей исследования возможно использовать и иные диапазоны концентраций.

6.7.1.1. Методы серийных разведений в агаре

Приготовление питательных сред с антибиотиками

Сухая агаризованная питательная среда растворяется и автоклавируется в соот­ветствии с инструкцией изготовителя. После автоклавирования колбы с питательной средой помещаются на водяную баню при 48-50°С, где выдерживаются до достиже­ния указанной температуры, после чего в них асептически вносят рабочие растворы ан­тибиотиков (1 часть рабочего раствора антибиотика на 9 частей расплавленного агара). Затем среду тщательно перемешивают и разливают по чашкам Петри, толщина слоя питательной среды должна быть 3-4 мм.

Чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Приготовленные указанным образом чашки Петри предпочтительнее использовать немедленно. Допус­кается хранение в запаянных полиэтиленовых пакетах при 4-8°С в течение 5 суток. При этом необходимо иметь в виду, что некоторые беталактамные антибиотики, осо­бенно при низких концентрациях, не выдерживают даже указанный срок хранения.

Параллельно с чашками Петри, содержащими растворы антибиотиков, для кон­троля роста готовят чашки Петри без антибиотиков.

Приготовление суспензии исследуемого микроорганизма, ее стандартиза­ция и инокуляция. Инкубация

Для приготовления суспензии используют 3-4-часовую бульонную или суточ­ную агаровую культуру холерного вибриона.

Для получения бульонной культуры отбирают одну или несколько четко изоли­рованных колоний, легким прикосновением петли к центру колонии переносят незна­чительное количество материала в пробирку с 4,0-5,0 мл жидкой неселективной сре­ды, например МПБ. Инкубируют при 37°С. Приблизительно через 3-4 ч инкубации мутность бульонной культуры соответствует 1-2 × 10 м.к./мл.

Для получения суточных агаровых культур можно использовать только четко изолированные колонии, выросшие на неселективных питательных средах. Взвесь ага­ровых культур в концентрации 10⁹ м.к./мл готовят на стерильном изотоническом рас­творе или бульонной среде по ОСО ГИСК им. Л.А. Тарасевича – ОСО-42-25-59-86П.

Конечная посевная доза на поверхности питательной среды должна составлять 10⁴ м.к. Поскольку коммерческие инокуляторы, штампы-репликаторы или стандартная бактериологическая петля диаметром 3,0 мм переносят 1-2 мкл жидкости, концентра­ция вибрионов в суспензии для инокуляции должна быть 10⁷ м.к./мл.

Для получения суспензии требуемой концентрации (10⁷ м.к./мл) бульонную культуру следует развести в 10 раз, а взвесь агаровой – в 100 раз. Суспензию необхо­димо инокулировать на поверхность агара в течение 15 мин после приготовления, при этом образуется пятно диаметром 5-8 мм.

После инокуляции чашки оставляют при комнатной температуре для подсыха­ния, далее переворачивают и инкубируют при 37°С в течение 16-20 ч.

Для контроля качества приготовления суспензий периодически рекомендуется проводить подсчет реальных колониеобразующих единиц путем высева на плотную питательную среду.

Важнейшим требованием контроля качества постановки метода является высев использованной для инокуляции суспензии на плотную неселективную среду для кон­троля чистоты культуры.

Результат оценки антибиотикочувствительности имеет смысл учитывать только при подтверждении чистоты культуры.

Учет результатов проводят, поместив чашку на темную, не отражающую по­верхность. За МПК принимают концентрацию, вызвавшую полную ингибицию види­мого роста. Для дифференцировки нежного роста от налета, оставшегося после инокулята, в ряде случаев целесообразно использовать увеличение. Появление единственной колонии на чашке с концентрацией на 1 разведение выше, чем явная МПК, можно не учитывать.

При росте нескольких колоний или образовании «прозоны» исследование необ­ходимо повторить, обратив особое внимание на чистоту культуры. В ряде случаев це­лесообразно получить субкультуру из единичных колоний, выросших на чашках с кон­центрацией антибиотика выше, чем явная МПК, и провести ее идентификацию.

Интерпретацию результатов проводят с учётом данных, приведенных в табл. 9, с отнесением штаммов к «чувствительным», «устойчивым» или «промежуточным».

6.7.1.2. Метод серийных разведений в бульоне

Наиболее распространен следующий способ постановки метода серийных разве­дений в бульоне.

Жидкая питательная среда, прошедшая предварительный контроль качества, го­товится в соответствии с инструкцией изготовителя.

Рабочие растворы антибиотиков готовят в асептических условиях по схеме, ана­логичной для метода серийных разведений в агаре, но в жидкой питательной среде и в концентрациях, вдвое превышающих заданные, затем разливают по 1,0 мл в пробирки.

Суспензию исследуемого микроорганизма готовят из бульонной или взвеси ага­ровой культуры путем разведения в жидкой питательной среде до концентрации 10⁶ м.к./мл и вносят по 1,0 мл в пробирки с растворами антибиотиков. Таким образом, конечная концентрация микроорганизмов в инкубационной среде будет равна 5 × 10⁵ м.к./мл.

Посевы инкубируют при 37°С в течение 16-20 ч.

Учет результатов проводят визуально или спектрофотометрически. За МПК принимают минимальную концентрацию, обеспечивающую полное подавление види­мого роста.

При постановке метода необходимо предусмотреть следующие контроли:

• 
  чистоту суспензии микроорганизма, использованной для инокуляции, путем высева на неселективные среды;
  
• 
  рост культуры в среде без антибиотика.
  

Качество постановки метода контролируется периодически с использованием референтных штаммов.

6.7.2. Диско-диффузионный метод

Постановка диско-диффузионного метода включает следующие этапы:

• 
  приготовление питательных сред;
  
• 
  приготовление суспензии микроорганизма и инокуляция;
  
• 
  наложение дисков и инкубация;
  
• 
  учет и интерпретация результатов.
  

Для получения достоверных результатов при постановке диско-диффузионного метода необходимо жестко соблюдать правила хранения и использования коммерче­ских дисков, в противном случае содержание в них антибиотиков может упасть ниже допустимого уровня (прежде всего в результате увлажнения) еще до истечения срока годности. Диски должны храниться при температуре 4-8°С, плотно укупоренными, для дополнительной гарантии защиты от увлажнения во флаконах коммерческих дисков содержится силикагель. Флаконы с дисками следует извлекать из холодильника за 1 ч до начала работы и выдерживать закрытыми при комнатной температуре, что обес­печит выравнивание температуры дисков и окружающей среды и, соответственно, пре­дотвратит образование конденсата влаги после открывания флаконов.

Приготовление чашек с питательной средой

К качеству питательных сред для постановки диско-диффузионного метода вы­двигаются те же требования, что и к плотным питательным средам для постановки ме­тода серийных разведений в агаре, соответственно используются и те же методы кон­троля качества.

Плотную питательную среду готовят в соответствии с инструкцией изготовите­ля. Перед заполнением расплавленной средой чашки Петри устанавливают на строго горизонтальную поверхность (выверенную по уровню, без впадин и выпуклостей). Глубина агарового слоя в чашке должна быть 4,0 мм, что достигается внесением 25-30 мл расплавленного агара в чашку диаметром 100 мм. Размер и форма зоны ингиби-ции роста зависят от глубины и равномерности агарового слоя.

После заполнения чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. Свежеприготовленные чашки перед инокуляцией культуры необходимо подсушить при 37°С в течение 10-20 мин с приоткрытой крышкой.

Чашки с агаром можно хранить в запаянных полиэтиленовых пакетах при 4-8°С в течение 7-10 суток. Перед использованием их также необходимо подсушить в тече­ние 10-20 мин при 37°С с приоткрытой крышкой.

Перед инокуляцией необходимо проконтролировать отсутствие конденсата жид­кости на внутренней поверхности крышек.

Приготовление суспензии и инокуляция

Для приготовления инокулята используют 18-20-часовую агаровую или 3-4-часовую бульонную культуру холерного вибриона. Суспензию или бульонную культу­ру доводят до концентрации 10⁹ м.к./мл по отраслевому стандартному образцу ГИСК им. Л.А. Тарасевича – ОСО-42-25-59-86П и разводят в 10 раз изотоническим раство­ром хлорида натрия до конечной концентрации 10⁸ м.к./мл.

Приготовленный таким образом инокулят наносят в количестве 1-2 мл на по­верхность питательной среды, равномерно распределяют по поверхности покачиванием и удаляют избыток жидкости пипеткой. Приоткрытые чашки подсушивают при ком­натной температуре в течение 10-15 мин.

Наложение дисков и инкубация

Не позднее, чем через 15 мин после инокуляции, на поверхность питательной среды наносят диски с антибиотиками.

Диски наносят с помощью автоматического диспенсора или стерильным пинце­том. Расстояние от диска до края чашки и между дисками должно быть 15-20 мм. Та­ким образом, на одну чашку диаметром 100 мм следует помещать не более 6 дисков. Диски должны равномерно контактировать с поверхностью агара, для чего их следует аккуратно прижать пинцетом.

Непосредственно после наложения дисков чашки помещают в термостат кверху дном и инкубируют 14-18 ч при 37°С. Увеличение интервала между нанесением дис­ков на поверхность среды и началом инкубации, а соответственно и пролиферации микроорганизма, приводит к «преддиффузии» антибиотика и увеличению диаметра зо­ны ингибиции роста.

Учет и интерпретация результатов

После окончания инкубации чашки помещают кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет настольной лампы падал на них под углом в 45° (учет в отраженном свете). Диаметр зон задержки роста с учетом диаметра самого диска изме­ряют с точностью до 1 мм, при этом предпочтительнее пользоваться штангенциркулем или кронциркулем. При измерении зон задержки роста следует ориентироваться на полную ингибицию видимого роста. Не следует обращать внимания на очень мелкие колонии, выявляемые в пределах зоны задержки роста только при особых условиях ос­вещения или увеличении, и на едва заметный налет у края зоны. Крупные колонии, вы­являемые в пределах четкой зоны ингибиции роста, свидетельствуют о наличии посто­ронней микрофлоры или о гетерорезистентности популяции, в этом случае необходима повторная идентификация и повторение исследования на антибиотикочувствительность.

При оценке чувствительности к сульфаниламидам и их комбинации с тримето-примом границу зоны ингибиции роста следует учитывать на уровне ингибиции роста на 80%. Это связано с тем, что под действием этих препаратов перед полной ингибицией роста возможно завершение 1-2-х циклов пролиферации микроорганизма.

Интерпретация результатов производится по табл. 9.

6.7.3. Контроль качества питательных сред для определения антибиотикочувствительности

Качество питательной среды является одним из критических параметров для корректной оценки антибиотикочувствительности. Важнейшими показателями качест­ва питательной среды являются концентрации двухвалентных катионов Са²⁺ и Mg²⁺, влияющих на активность аминогликозидных антибиотиков и тетрациклинов, а также тимина и тимидина, являющихся антагонистами сульфаниламидных препаратов и три-метоприма.

Перед использованием в экспериментах по оценке антибиотикорезистентности каждая новая партия среды (Mueller-Hinton или какой-либо другой) должна пройти контроль качества в соответствии с описанным ниже методом.

A. Определение рН среды

Определение рН среды проводят после автоклавирования и охлаждения до ком­натной температуры 25°С, приемлемый диапазон 7,2-7,4. При величине рН среды, выходящей за указанные пределы, возможны существенные изменения в величине МПК.

Б. Контроль катионного состава

Для получения воспроизводимых результатов оценки антибиотикорезистентно­сти питательная среда должна содержать Са²⁺ 20-25 мг/л и Mg²⁺ 10,0-12,5 мг/л.

Наиболее доступным интегральным методом оценки качества сред (как жидких, так и агаризованных) является сопоставление экспериментально полученной величины МПК референтных штаммов микроорганизмов с этим показателем, приведенным в их паспортной характеристике.

Наиболее подходящим штаммом для оценки качества жидких и плотных пита­тельных сред, предназначенных для изучения антибиотикорезистентности, является штамм Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Среду следует считать удовлетворитель­ной по качеству, если величина МПК гентамицина находится в пределах 0,5-2,0 мкг/мл. Выбор гентамицина для контроля качества связан с тем, что аминогликозидные антибиотики наиболее чувствительны к колебаниям концентрации двухвалент­ных катионов.