Лабораторная диагностика холеры. МУК 4.2.2218-07 Лабораторная диагностика холеры. Методические указания мук 221807

• Название: Методические указания мук 221807
• Анкор: Лабораторная диагностика холеры
• Дата: 24.04.2022
• Размер: 2.25 Mb.
• Имя файла: МУК 4.2.2218-07 Лабораторная диагностика холеры.doc
• Тип: Методические указания; #492616
• страница: 3 из 7

5.3. Идентификация культур холерных вибрионов

Культуры, выделенные на различных этапах, идентифицируют с целью опреде­ления их принадлежности к виду Vibrio cholerae соответствующей серогруппы (01, 0139 ил и других).

К виду V.cholerae относят грамотрицательные, аспорогенные, полиморфные па­лочки, слегка изогнутые или прямые, активно подвижные, с одним полярно рас­положенным жгутиком, образующие индофенолоксидазу, ферментирующие глюкозу в аэробных и анаэробных условиях до кислоты (без газа), расщепляющие маннит, маннозу, сахарозу, но не активные в отношении к арабинозе, инозиту, салицину и некоторым другим субстратам. Холерные вибрионы декарбоксилируют лизин и орнитин, но не об­ладают дигидролазой аргинина, образуют индол, обладают нитратредуктазой, не про­дуцируют сероводород. Таксономическое положение холерных вибрионов и признаки, дифференцирующие их от родственных микроорганизмов, приведены на рис. 2 и в табл. 2, 3, 4.

Возбудителями холеры являются V.cholerae 01 (биоваров классического и эль-тор; сероваров Инаба, Огава или Гикошима) и 0139 серогрупп.

Токсигенные, эпидемически значимые варианты холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп, содержащие гены холерного токсина (ctx AB) и токсин-корегулируемых пилей (tcp А), вызывают заболевания холерой, склонные к эпидемическому распростра­нению.

Нетоксигенные (не содержащие гена холерного токсина), эпидемически не­опасные варианты холерных вибрионов 01 могут вызывать спорадические или группо­вые заболевания холерой при общем источнике заражения.

Вид V.cholerae помимо возбудителей холеры включает холерные вибрионы других О серогрупп, в настоящее время их известно более 200. Отдельные штаммы не­которых из них могут вызывать единичные случаи диарей или заболевания с внекишечной локализацией возбудителя. Известны отдельные групповые заболевания или вспышки диарей, обусловленных ими, при общем источнике заражения.

Идентификацию выделенных на полиуглеводной среде или щелочном агаре агг­лютинирующихся на стекле культур проводят по сокращенной или полной схеме.


Примечания: 1) таксономия вибрионов представлена по Bergeys manual of Determinative Bacteriology, 1994; 2) типовые штаммы О2-О39 соответствуют Sakazaki (1970); 040-083, а также 012; 023 и 026 не изучены в сравнении с международной коллекцией типовых штаммов.
























Сокращенная схема идентификации типичных по культуральным и морфологи­ческим препаратам оксидазопозитивных культур, агглютинирующихся в слайд-агглютинации холерной 01 или 0139 сывороткой предусматривает изучение культуры в развернутой реакции агглютинации с холерными сыворотками 01, Инаба, Огава и РО, определение чувствительности к диагностическим бактериофагам классическому и эльтор, отношения к глюкозе в среде Хью-Лейфсона, сахарозе, маннозе, манниту и арабинозе в средах Гиса, а также лизину, орнитину и аргинину, и ориентировочную оцен­ку эпидемической значимости по гемолитической активности в пробе Грейга и чувст­вительности к холерным эльтор ctx⁺ и ctx^ фагам.

Культуры оксидазопозитивных, активно подвижных вибрионов, расщепляющие глюкозу в среде Хью-Лейфсона до кислоты без газа, декорбоксилирующие лизин и орнитин, не обладающие дигидролазой аргинин, ферментирующие сахарозу, маннозу, маннит в средах Гисса и инактивные по отношению к арабинозе, агглютинирующиеся не менее чем до 1/2титра сыворотками О1 и одной из вариантоспецифических сыворо­ток, относят к V.cholerae 01 серовара Огава или Инаба. Культуры, агглютинирующие­ся обеими вариантоспецифическими сыворотками не менее чем до 1/2 титра, относят к серовару Гикошима. В случае агглютинабельности выделенной культуры обеими вари­антоспецифическими сыворотками целесообразно повторить исследование с использо­ванием различных серий коммерческих препаратов.

Для подтверждения принадлежности выделенной культуры холерных вибрионов к 0139 серогруппе достаточно положительного результата в слайд-агглютинации с со­ответствующей сывороткой в рабочем разведении.

Полная схема идентификации культур, агглютинирующихся холерными сыво­ротками 01 серогруппы, предусматривает изучение их по дополнительным тестам, оп­ределяющим принадлежность к биовару (гемагглютинация, чувствительность к поликсимину, реакция Фогес-Проскауэра), определение антибиотикограммы, окончатель­ную оценку эпидзначимости по результатам исследования в ПЦР на наличие генов ctx и tcp, и определение токсигенности на модели кроликов-сосунков.

В случае выделения культур холерных вибрионов 0139 серогруппы, их также изучают по чувствительности к антибиотикам, определяют эпидемическую значимость ориентировочно по гемолитической активности в пробе Грейга, окончательно – ука­занными выше специальными методами.

Токсигенные штаммы холерных вибрионов 01 и 0139 серогрупп, как правило, не лизируют эритроциты барана в пробе Грейга в отличие от нетоксигенных штаммов.

На культуры, имеющие характерные для вибрионов морфологические, культу-ральные и биохимические признаки, агглютинирующиеся 01 и одной из вариантоспе­цифических сывороток не менее чем до 7 г титра, лизирующиеся и не лизирующиеся холерным и эльтор фагами, а также на культуры, агглютинирующиеся сывороткой 0139, выдают окончательный ответ, указывая чувствительность их к антибиотикам и оценку эпидемической значимости по результатам ориентировочных или специальных исследований.

Кроме того, для холерных вибрионов 01 серогруппы указывают биовар на осно­вании чувствительности к одному из диагностических фагов (эльтор или классическо­му) и (или) по дополнительным признакам - для фагорезистентных культур (табл. 5).

Культуры, имеющие признаки вибрионов по морфологии колоний и клеток, тес­ту на индофенолоксидазу и ферментативной активности на полиуглеводной среде, не агглютинирующиеся на стекле холерными сыворотками 01 и 0139 серогрупп, выде­ленные от больных острыми кишечными инфекциями, идентифицируют по тестам, определяющим принадлежность к роду Vibrio и виду V.cholerae (табл. 2 и 3). Принадле­жащие к V.cholerae культуры изучают в пробе с диагностическими фагами. При выде­лении чувствительных к холерным диагностическим монофагам, но не агглютинирую­щихся холерными сыворотками 01 культур, особое значение имеет изучение их кле­точного состава, т. к. в популяции таких штаммов могут находиться типичные холер­ные вибрионы О1 серогруппы. Если культура по совокупности признаков относится к виду холерных вибрионов, но не агглютинируется холерными 01 и 0139 сыворотками, ее изучают в реакции агглютинации с набором диагностических холерных сывороток 02-083 серогрупп по отечественной классификации (рис. 2).

На культуры, агглютинирующиеся одной из сывороток, выдают ответ о выделе­нии V.cholerae 02, О5 или другой серогруппы.

Если культуры не типируются указанными холерными сыворотками или они от­сутствуют в лаборатории, то выделенную культуру обозначают обобщенно – V.cholerae non 01/0139 серогрупп.

Кроме этого, штаммы V.cholerae поп 01 типируют бактериофагами диагности­ческими холерными ТЭПВ 1-7.

Энтеропатогенные холерные вибрионы не 01 группы относятся преимущест­венно к 02, 05, Об, 08, 011, 013, 018, 037, 047, 050, 062, 065, 082, 083 серогруппам и, как правило, лизируются фагами ТЭПВ 1, 4, 7.

У выделенных от больных штаммов холерных вибрионов не 01/0139 серогрупп определяют антибиотикограмму. Для выделенных из окружающей среды вибрионов, не агглютинирущихся холерными 01 и 0139 сыворотками, целесообразность полной так­сономической характеристики определяется в каждом случае отдельно для конкретных территорий и объектов с учетом эпидситуации по холере и регистрации острых кишеч­ных заболеваний, обусловленных этими микроорганизмами.

Идентификация атипичных культур холерных вибрионов

К атипичным относят культуры холерных вибрионов, отклоняющиеся от типич­ных по отдельным родовым и видовым признакам, а также по агглютинабельности группо- и вариантоспецифическими сыворотками 01 и чувствительности к диагности­ческим фагам (классическому и эльтор). Антигенная изменчивость холерных вибрио­нов 01 может выражаться в ослаблении до ¼ титра или утрате агглютинабельности холерными сыворотками 01, Инаба, Огава. Встречаются штаммы, агглютинирующиеся только холерной сывороткой 01 серогруппы и не реагирующие с вариантоспецифиче­скими сыворотками (Инаба и Огава), что делает невозможным установление их серова-ра. В случае S-R диссоциации культуры холерных вибрионов начинают агглютиниро­ваться РО-сывороткой. При этом в одних случаях штаммы агглютинируются всеми хо­лерными сыворотками, в т. ч. и РО, их обозначают как SR-варианты, в других – изме­ненные холерные вибрионы в диагностических титрах агглютинируются только с РО сывороткой и не агглютинируются холерными сыворотками 01, Инаба и Огава, их от­носят к R-вариантам.

В последние годы возросла частота встречаемости резистентных к диагностиче­ским холерным фагам штаммов среди холерных вибрионов 01, выделяемых как от лю­дей, так и из объектов окружающей среды.

При этом фагоустойчивость вибрионов, снижение или отсутствие агглютина­бельности холерными сыворотками иногда сочетается с вариабельностью по другим признакам (культурально-морфологическим и биохимическим). Штаммы, атипичные по морфологическим признакам, образуют шероховатые, слизистые, мутные и пигмен­тированные колонии. Размер их также может варьировать, вплоть до появления едва видимых карликовых колоний. У таких культур нередко снижена подвижность, наблюдается спонтанная агглютинация в 0,9%-м растворе натрия хлорида. Отмечена воз­можность обнаружения в организме больного и в воде открытых водоемов холерных вибрионов в Л-форме. В мазках, сделанных из атипичных культур холерных вибрио­нов, клетки имеют форму шаров, сферопластов, встречаются вытянутые, извитые, неделящиеся клетки в виде цепей или нитей.

Нередко встречаются штаммы, измененные по биохимическим свойствам, у ко­торых отмечается ослабление, замедление или утрата способности расщеплять углево­ды и многоатомные спирты (крахмал, маннит, маннозу, сахарозу), аминокислоты (триптофан, лизин, орнитин) и другие субстраты.

Во всех случаях выделения атипичных культур обязательно изучение их по при­знакам, определяющим их принадлежность к роду Vibrio и виду Vibrio cholerae (опре­деление типа расщепления глюкозы в среде Хью и Лейфсона, декарбоксилаз лизина и орнитина и дигидролазы аргинина, чувствительности в вибриостатику 0129 – 2,4-диамино-6,7-диизопропилптеридину и др.).

Атипичные культуры холерных вибрионов, обладающие указанными выше при­знаками рода Vibrio и вида Vibrio cholerae, агглютинирующиеся сывороткой 01 до ¼ титра, лизирующиеся и не лизирующиеся диагностическими монофагами до ДРТ, сле­дует относить к серогруппе О1.

Для всестороннего изучения все атипичные культуры холерных вибрионов сле­дует направлять в специализированные лаборатории.

Для подтверждения принадлежности к V.cholerae 01 слабоагглютинирующихся (ниже ¼ титра), диссоциирующих и фагорезистентных культур обязательным является использование высокочувствительных методов (мультиплексным ПЦР набором праймеров) и, по возможности, реакции агглютинации с кроличьими холерными сыворот­ками, обладающими большей специфичностью, чем лошадиные, поскольку они не со­держат пула неспецифических иммуноглобулинов.

Рекомендуется при изучении измененных по антигенной структуре культур ис­пользовать также такие методы, как РНГА, РНАт, иммунофлюоресценцию, преципита­цию в геле, адсорбцию агглютининов по Кастеллани, реакцию агглютинации с убиты­ми кипячением культурами, пробу с комплементом, позволяющую отбирать из популя­ции измененных штаммов типичные, резистентные к нему клоны в S-форме.

При получении сомнительных результатов слайд-агглютинации с холерной сы­вороткой 0139 серогруппы следует повторить исследование с гретой культурой.

Для серологической идентификации спонтанно агглютинирующихся культур применяют те же методы и дополнительно реакцию агглютинации с использованием осажденной культуры и 0,3%-го раствора натрия хлорида для разведения диагностиче­ских сывороток и приготовления взвеси изучаемой культуры.

5.4. Учет анализов, оформление направлений и выдача результатов

Ответ о положительном результате может быть предварительным и оконча­тельным.

Предварительный положительный ответ выдают по результатам ускоренного исследования нативного материала и после подращивания его в пептонной воде с по­мощью иммунофлюоресцентного метода, специфической иммобилизации, РНГА, а также по слайд-агглютинации сыворотками О1 и 0139 подозрительных на холерный вибрион колоний. При наличии возможности на этом этапе может быть использована ПЦР со специфическими праймерами.

Предварительный ответ, в случаях проведения срочных анализов, сообщают устно и только при совпадении результатов не менее двух методов.

В условиях эпидемии холеры при проведении массовых исследований после идентификации первых культур такой ответ дает право на проведение противоэпиде­мических мероприятий.

Окончательный положительный ответ выдают по результатам сокращенной или полной идентификации выделенной культуры в течение 36-48 ч.

При проведении массовых исследований в очаге заболеваний холерой, когда первые культуры холерных вибрионов уже были идентифицированы по полной схеме, положительные результаты тестирования в слайд-агглютинации с холерными сыворот­ками О1 или 0139 серогрупп в сочетании с морфологией и подвижностью клеток куль­тур, выделенных от больных диареями или при обследовании на вибриононосительство, следует считать окончательными для решения вопросов о проведении противоэпи­демических мероприятий. Достоверность таких результатов повышается при использо­вании ускоренных методов диагностики: иммунофлюоресцентного, иммобилизации соответствующими сыворотками, ПЦР и др.

Для полной идентификации выделенные культуры передают в назначенную для этих целей группу или лабораторию, специалисты которой при необходимости вносят в ответ соответствующие коррективы и дополнения, касающиеся определения антибиотикограммы, эпидемической значимости и токсигенности.

Отрицательный ответ может быть дан только по окончании исследования по полной схеме через 36-48 ч; при осуществлении эпиднадзора в условиях односменной работы лаборатории, допускающей использование теллурита калия, продолжитель­ность анализа увеличивается до 3-4 суток.

Не допускается выдавать отрицательные ответы по результатам ускоренного ис­следования (МФА, РИВ, РИГА, и др.) до окончания анализа как в условиях эпидемии холеры, так и при проведении эпидемиологического надзора.

Схему выдачи ответов см. на рис. 3.

При осуществлении эпидемиологического надзора направление к анализу, а со­ответственно и ответ на него, оформляют индивидуально на каждого больного. При проведении большого объема исследований в очаге холеры направления к анализам и ответы на них оформляют списком. При обследовании здоровых людей на вибриононосительство и исследовании на холеру объектов окружающей среды групповые формы направления и ответов допускаются как при эпиднадзоре, так и в очаге холеры.

Учет анализов и культур ведут по установленным формам (прилож. 6, 7). Обяза­тельным является ведение рабочих записей идентификации исследования подозритель­ных культур (прилож. 8), регистрация выделенных культур (прилож. 9), составление паспорта штамма (прилож. 10).

При работе в очаге холеры используют упрощенные формы регистрации анали­зов, учитывая, что более подробные сведения имеются в бланках направлений, нахо­дящихся в лаборатории до ликвидации очага. Для удобства работы направления за ка­ждый день подшивают отдельно.

6. Методы изучения свойств холерных вибрионов

6.1. Серологические методы

Принадлежность холерных вибрионов к О1 или 0139 серогруппе определяют в слайд-агглютинации или развернутой реакции агглютинации с холерными агглютини­рующими сыворотками 01, Инаба, Огава, РО и с холерной сывороткой 0139 серогруппы в соответствии с инструкциями по применению препаратов, а также в других реак­циях с иммуноглобулиновыми препаратами, предназначенными для ускоренной диаг­ностики холеры и идентификации возбудителя.

Слайд-агглютинацию ставят на обезжиренном стекле, помещенном в чашку Петри или на дне самой чашки, используя подозрительную на холерный вибрион коло­нию и (или) агаровую 12-18-часовую культуру и сыворотки 01 серогруппы в разведе­нии 1:50-1:100. Сыворотку 0139 разводят в соответствии с указанием на этикетке. Реакцию обязательно сопровождают контролями культуры в 0,9%-м растворе хлорида натрия.

Развернутую реакцию агглютинации ставят и учитывают по общепринятой ме­тодике в соответствии с инструкцией по применению диагностических сывороток.

Для исключения спонтанной агглютинации рекомендуется ставить развернутую реакцию в 0,3%-м растворе NaCl.

Диагностические сыворотки двукратно разводят 0,3%-м раствором натрия хло­рида в объеме 0,5 мл соответственно величине диагностического титра. Суспензию изу­чаемой культуры готовят в этом же растворе концентрацией 3 × 10⁹ – 5 × 10⁹ м.к./мл в объеме 8-10 мл. Взвесь выдерживают при комнатной температуре в течение 1,0-1,5 ч. В реакции используют поверхностный слой микробной взвеси, разведенной 0,3 %-м раствором натрия хлорида до концентрации 1 млрд м.к./мл, добавляя ее по 0,5 мл во все разведения сыворотки и контроль культуры (0,5 мл 0,3%-го раствора натрия хлорида + 0,5 мл взвеси культуры). Учет и оценка результатов аналогичны основному варианту развернутой реакции.

Флюоресцентно-серологический метод (МФА — метод флюоресцирующих антител)

Метод дает возможность ускоренно идентифицировать выделенную культуру, а также выявить возбудителя холеры 01 и 0139 серогруппы при содержании его в ис-следуемом материале не менее чем 10 м.к./мл. Исследованию подлежат выделенная культура, нативный материал (испражнения и рвотные массы) и материал после под­ращивания.

Порядок приготовления мазков, обработка их флюоресцирующими иммуногло­булинами, микроскопия и оценка результатов, являющиеся общими для всех бактерий, описаны в «Наставлениях по применению иммуноглобулинов диагностических флюо­ресцирующих холерных адсорбированных лошадиных сухих».

Положительный результат может быть получен через 1,5—2,0 ч от начала ис­следования.

При просмотре мазков, обработанных иммуноглобулином холерным флюорес­цирующим, особое внимание следует обращать на морфологию светящихся микробов, т. к. в отдельных случаях в мазках из испражнений здоровых людей может наблюдать­ся свечение микроорганизмов, отличающихся по морфологии от вибрионов (грубые крупные палочки, кокки).

Для устранения неспецифического свечения целесообразно использовать в каче­стве «гасителя» бычий альбумин, меченый родамином. Методика его использования описана в «Инструкции по применению альбумина бычьего, меченого родамином, сухого».

Реакция иммобилизации вибрионов под влиянием специфических холерных сывороток 01 и O139 серогрупп (РИВ)

Метод дает возможность обнаружить возбудителя в течение нескольких минут при концентрации его в исследуемом материале не менее 10⁵ м.к/мл. На предметное стекло пипеткой или петлей наносят 2 капли испражнений, рвотных масс или поверх­ностного слоя среды обогащения. Первую каплю накрывают покровным стеклом (кон­троль), ко второй добавляют каплю 01 сыворотки в разведении 1:50, перемешивают и также накрывают покровным стеклом. Раздавленную каплю смотрят под микроскопом при увеличении ×400-600, используя фазово-контрастное устройство или конденсор темного поля.

При наличии в исследуемом образце холерных вибрионов в первой капле на­блюдают характерную подвижность, во второй – иммобилизацию отдельных микроб­ных клеток и образование неподвижных микроагглютинатов немедленно или в течение 1-2 мин. В случае неспецифического взаимодействия с диагностическими сыворотка­ми наблюдается образование мелких подвижных конгломератов при активной подвиж­ности отдельных клеток.

Реакция иммобилизации специфична и позволяет дать первый сигнальный ответ через 15-20 мин от начала исследования нативного материала. При отрицательном результате исследование повторяют после подращивания в 1%-й пептонной воде.

В случае отрицательного результата необходимо провести аналогичное исследо­вание с холерной сывороткой 0139 серогруппы, которую разводят 1:5.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА) с использованием диагностикума эритроцитарного холерного иммуноглобулинового

Порядок подготовки материала, ингредиентов, постановки реакции и ее учет из­ложены в «Инструкции по применению диагностикума эритроцитарного холерного ан­тительного иммуноглобулинового», прилагаемой к препарату.