Морфологические, физиологические, биохимические
 Скачать 398.4 Kb.
|
|
Универсальным инструментом для производства посевов является бактериальная петля. Кроме нее, для посева уколом применяют специальную бактериальную иглу, а для посевов на чашках Петри — металлические или стеклянные шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлей используют пастеровские и градуированные пипетки. При пересеве бактериальной культуры берут пробирку в левую руку, а правой, обхватив ватную пробку IV и V пальцами, вынимают ее, пронося над пламенем горелки. Удерживая другими пальцами той же руки петлю, набирают ею посевной материал, после чего закрывают пробирку пробкой. Затем в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская ее до конденсата в нижней части среды, и зигзагообразным движением распределяют мате риал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив. Пробирки с посевами надг писывают, указывая дату посева и характер посевного материала (номер исследования или название культуры). Посевы «газоном» производят шпателем на питательный агар в чашке Петри. Для этого, приоткрыв левой рукой крышку, петлей или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питательного агара. Затем проводят шпатель через пламя горелки, остужают его о внутреннюю сторону крышки и растирают материал по всей поверхности среды. После инкубации посева появляется равномерный сплошной рост бактерий. Методы культивирования При выращивании бактерий применяют стационарный способ, способ глубинного культивирования с аэрацией и метод проточных питательных сред. В соответствии со способами выращивания бактериальные культуры разделяют на периодические (при стационарном и глубинном культивировании) и непрерывные (при проточном культивировании). Стационарный способ — наиболее часто используемый на практике. Состав сред остаётся постоянным, с ними не проводят никаких дополнительных манипуляций. Способ глубинного культивирования применяют при промышленном выращивании бактериальной биомассы, для чего используют специальные котлы-реакторы. Они снабжены системами поддержания температуры, подачи в бульон различных питательных веществ, перемешивания биомассы и постоянной подачи кислорода. Метод проточных сред (промышленный способ культивирования) позволяет постоянно поддерживать бактериальную культуру в экспоненциальной фазе роста, что достигают постоянным внесением питательных веществ и удалением определённого числа бактериальных клеток. Пребывание бактерий в экспоненциальной стадии роста обеспечивает максимальный выход различных БАВ (витамины, антибиотики и др.). Питательной средой в микробиологии называют среды, содержащие различные соединения сложного или простого состава, которые применяются для размножения бактерий или других микроорганизмов в лабораторных или промышленных условиях. Питательные среды готовят из продуктов животного или растительного происхождения. Большое значение имеет наличие в питательной среде ростовых факторов, которые катализируют метаболические процессы микробной клетки (витамины группы В, никотиновая кислота и др.). Искусственные среды готовят по определенным рецептам из различных настоев или отваров животного или растительного происхождения с добавлением неорганических солей, углеводов и азотистых веществ. В бактериологической практике чаще всего используют сухие питательные среды. Для их приготовления используют экономически рентабельное непищевое сырье: утратившие срок годности кровезаменители (гидролизин—кислотный гидролизат крови животных, аминопептид — ферментативный гидролизат крови; продукты биотехнологии (кормовые дрожжи, кормовой лизин, виноградная мука, белколизин). Сухие питательные среды могут храниться в течение длительного времени, удобны при транспортировке и имеют относительно стандартный состав. Культуральные свойства бактерий При росте на жидких питательных средах бактерии чаще всего вызывают равномерное помутнение, иногда — выпадение осадка: крошковатого (стрептококки), хлопьевидного (стрептобациллы), бульон при этом остается прозрачным. Некоторые бактерии образуют пленку на поверхности жидкой среды: сухую чешуйчато-бородавчатую (туберкулезная палочка), тонкую, нежную (холерный вибрион), рыхлую, с отходящими вниз отростками — «сталактитами» (возбудитель чумы). Еще более разнообразен рост бактерий на плотных питательных средах. Образуемые при этом колонии различаются по многим признакам: размерам, форме, консистенции, структуре, прозрачности, цвету и др. Колонии бывают очень мелкими (0,1-0,5 мм), мелкими (0,5-3,0 мм), средних размеров (3-5 мм) и крупными (более 5 мм в диаметре). Они могут быть круглыми (дисковидными); плоскими; иметь форму, напоминающую львиную гриву («голову Медузы»); ризоидными и т. п.. Края колонии могут быть гладкими, зазубренными, фестончатыми, изрезанными. Поверхность колонии бывает гладкая или шероховатая, влажная или сухая, ровная или складчатая, плоская или выпуклая, а ее консистенция — плотная, рыхлая, слизистая. Колонии могут быть прозрачными, полупрозрачными, непрозрачными и различаться по другим признакам, например у некоторых бактерий центр мутный, а периферическая зона полупрозрачна. Методы выделения чистых культур аэробных и анаэробных бактерий. Бактерии чётко разделяют по отношению к содержанию кислорода в атмосфере культивирования. Аэробы. Посевы аэробных бактерий культивируют в простых термостатах. Некоторые факультативно анаэробные виды также можно культивировать при атмосферном воздухе, но более оптимально помещение посевов в термостаты с дозированной подачей кислорода. На практике их чаще помещают в эксикаторы, куда вносят горящую свечу; после её выгорания в атмосфере снижается содержание кислорода и повышается содержание С02. Анаэробы. Посевы анаэробных бактерий в жидких средах заливают вазелиновым или другим маслом. При использовании плотных сред посевы культивируют в специальных устройствах — анаэростатах (откуда откачивают воздух) либо заливают посевы тонким слоем агара. Анаэробные условия можно создать химическим путём, поместив посевы в эксикаторы, на дно которых заливают щелочной раствор пирогаллола, поглощающего кислород. Также можно использовать методы Фортнера, Цейсслера и Вёйнберга. Метод Фортнера. Посевы проводят на чашку Петри с толстым слоем среды, разделённым пополам узкой канавкой, вырезанной в агаре. На одну половину засевают культуру аэробных бактерий, на другую — анаэробных. Края чашки заливают парафином и инкубируют в термостате. Первоначально наблюдают рост аэробов, а затем (после поглощения кислорода) — рост анаэробов. Метод Цейсслера используют для выделения чистых культур спорообразующих анаэробов. Для этого проводят посев на среду Китта-Тароцци, прогревают 15 мин при 80°С (для уничтожения вегетативных форм), заливают вазелиновым маслом и инкубируют 24 ч. Затем проводят посев на сахарно-кровяной агар для получения чистых культур. После 24-часового культивирования подозрительные колонии изучают и отсевают на среду Китта-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры). Метод Вёйнберга используют для получения чистых культур строгих анаэробов. Культуры, выращенные на среде Китта-Тароцци, вносят в сахарный бульон. Затем пастеровской пипеткой с запаянным концом материал переносят в узкие пробирки (трубки Виньяля) с сахарным МПА, погружая пастерку до дна пробирки. Засеянные пробирки быстро охлаждают холодной водой, что позволяет зафиксировать отдельные бактериальные клетки в толще затвердевшего агара. Пробирки инкубируют, и изучают выросшие колонии. При обнаружении подозрительной колонии на её месте делают распил, колонию быстро отбирают и засевают на среду Китта-Тароцци (с последующим контролем чистоты выделенной культуры). Бактериологический метод диагностики, его этапы, достоинства и недостатки. 1 этап : Выделение чистой культуры. Посев исследуемого материала на плотные питательные среды (для получения изолированных колоний) Инкубация посевов при оптимальных условиях (обычно 18-20 часов при 37 ⁰ С 2 этап: Накопление чистой культуры а) изучение культуральных свойств изолированных колоний б) микроскопия окрашенных мазков (изучение морфологических и тинкториальных свойств) в) пересев колоний на среду для накопления Инкубация посевов при оптимальных условиях (обычно 18-20 ч при 37⁰ С) 3 этап: Идентификация и изучение свойств выделенной чистой культуры а) проверка чистоты выделенной культуры; б) изучение биохимической активности (протео- и сахаролитических свойств); в) внутривидовая идентификация и эпидемиологическое маркирование (при необходимости): серо-, био-, фаго-, колицино-, генотипитрование; г) определение токсигенности (вирулентности); д) определение чувствительности к антибиотикам и другим антимикробным средствам Инкубация посевов при оптимальных условиях (обычно 18-20 ч при 37⁰ С) 4 этап: Учет результатов. Бактериологический метод является основным при диагностике инфекционных заболеваний. Его сущность заключается в определении вида возбудителя инфекции, следовательно, на основании результатов бактериологического метода можно поставить этиологический (окончательный) диагноз. Основной недостаток метода — длительность исследования — от 3 до 5 суток, а в отдельных случаях и более. Определение вирусов как особых форм организации живого. Принципы классификации и таксономии вирусов. Основные свойства вирусов. Нет клеточной структуры. Не имеют обмена веществ, нет питания и дыхания, нет ферментных и белоксинтезирующих систем. Являются облигатными внутриклеточными паразитами. Критерии живой природы вирусов. Способны к размножению, обладают наследственностью, способны к изменчивости. Классификация вирусов. При классификации вирусов учитываются следующие свойства. • 1. тип и характеристика нуклеиновой кислоты • 2.морфология и строение вириона • 3.размеры вириона • 4. наличие оболочек вируса • 5. антигенная структура • 6. внутриядерная или цитоплазматическая локализация • 7. резистентность к температуре, РН среды, эфиру • 8. тропизм к тканям • 9. способность образовывать тельца включений Таксономия вирусов. Царство - Vira Подцарства - РНК и ДНК-вирусы Семейства( 13 РНК –содержащих и 6 ДНК-содержащих) Подсемейства Роды Виды Морфология и структура вирусов. Понятие о вирионе. Типы симметрии нуклеокапсида. Химический состав вирусов. Методы культивирования вирусов. Типы взаимодействия вирусов с клеткой. Основные стадии взаимодействия вирусов с клеткой хозяев при продуктивном типе инфекции. Особенности репродукции ДНК и РНК-содержащих вирусов. Морфология и структура вирусов, роль отдельных компонентов вириона. Вирусы устроены примитивно просто. В состав любого вируса входит нуклеиновая кислота (НК) и белковая оболочка. В состав вируса входит только один тип НК – либо ДНК, либо РНК. НК – это геном вируса. Белковая оболочка вируса называется капсид. Капсид образуют отдельные белковые молекулы – капсомеры. У просто устроенных вирусов больше ничего нет. Сложные вирусы имеют суперкапсид – наружную оболочку. Суперкапсид по химической структуре состоит их липопротеидов, липидов, полисахаридов. Суперкапсид чаще всего имеет клеточное происхождение. Вирион – это полноценная вирусная частица, состоящая из нуклеиновой кислоты и находящаяся вне живой клетки. В состав вириона могут также входить ферменты – ДНК-полимераза, обратная транскриптаза. Функции НК вируса. 1. Сохранение и передача наследственной информации. 2.Инфекционные свойства вируса обусловлены также НК, именно НК проникает в клетку и заставляет клетку синтезировать новые вирусные чатицы, клетка в конечном итоге погибает. Существует три типа симметрии вирусов: кубический, спиральный, смешанный. Тип симметрии определяется расположением капсомеров в капсиде. При кубическом типе симметрии капсомеры располагаются так, что образуют геометрическую фигуру – многогранник (напр.икосаэдр), в этом случае в вирусной частице есть полость, в которой располагается НК. Такие вирусы под электронным микроскопом обычно имеют шаровидную форму. При спиральном типе симметрии капсомеры располагаются по спирали, повторяя ход спирали НК. В этом случае полости внутри вируса нет, капсомеры плотно прилегают к НК. Такие вирусы имеют обычно палочковидную, цилиндрическую, нитевидную форму. При смешанном типе смметрии в составе вируса есть части и со спиральным, и с кубическим типом симметрии, напр., бактериофаги. Методы культивирования вирусов. Вирусы – облигатные внутриклеточные паразиты, поэтому они не растут на питательных средах. Для их культивирования нужна живая клетка. Существует три модели для культивирования вирусов: куриный эмбрион, организм чувствительного лабораторного животного, культура клеток. Культура клеток – это клетки многоклеточного организма, выращенные в пробирке. Разновидности культур клеток: 1. первично- трипсинизированные 2. полуперевиваемые 3.Перевиваемые. Индикация вирусов при разных методах культивирования. 1. Заражение восприимчивых лабораторных животных: гибель животного, проявление клинических симптомов, обнаружение телец включений 2. Заражение куриных эмбрионов( 4-12 дневных): гибель эмбриона, появление бляшек на хорион-аллантоисной оболочке, реакция гемагглютинации с аллантоисной жидкостью. 3. Заражение культур клеток: цитопатическое действие (ЦПД), бляшкообразование , тельца включений, реакция гемагглютинации с культуральной жидкостью, реакция гемадсорбции ,цветная реакция. Типы взаимодействия вирусов с клеткой. • Автономный тип взаимодействия • 1.Продуктивная инфекция • 2. Абортивное инфекция • Интегративный тип взаимодействия Продуктивная инф. - заканчивается гибелью клеток и образованием популяции новых вирусных частиц. На фоне продуктивного взаимодействия вируса с клеткой возникает обычно острая вирусная инфекция. Абортивная инф. - не приводит к появлению вирусной популяции и гибели клеток хозяина Интегративное взаимодействие - нуклеиновая кислота вируса встраивается в геном клетки и сосуществует с клеткой длительное время. Такой вирус называется провирус, явление перехода вируса в форму провируса наз. вирогенией, а клетка, содержащая вирус в форме провируса - вирогенная клетка. На фоне интегративного взаимодействия вируса с клеткой возникает персистентная вирусная инфекция. Она может проявляться тремя типами инфекций: латентная вирусная инфекция, хроническая вирусная инфекция, медленная вирусная инфекция. Этапы вирусной репродукции при продуктивной вирусной инфекции. 1. адсорбция вирусов 2. проникновение вирусов в клетку путем рецепторного эндоцитоза 3. синтез ранних вирусных белков (ферменты репликации и синтеза структурных белков вируса) 4. репликация вирусной нуклеиновой кислоты и синтез поздних вирусных белков 5. сборка вирусов 6. выход вирусов из клетки Методы обнаружения вирусов при культивировании их в культуре ткани, в организме чувствительных лабораторных животных, в курином эмбрионе. Методы титрования вирусов. Индикация вирусов при разных методах культивирования. Заражение восприимчивых лабораторных животных: гибель животного, проявление клинических симптомов, обнаружение телец включений Заражение куриных эмбрионов( 4-12 дневных): гибель эмбриона, появление бляшек на хорион-аллантоисной оболочке, реакция гемагглютинации с аллантоисной жидкостью. Заражение культур клеток: цитопатическое действие (ЦПД), бляшкообразование , тельца включений, реакция гемагглютинации с культуральной жидкостью, реакция гемадсорбции ,цветная реакция. Реакции гемагглютинации и гемадсорбции вирусов, их механизм. Многие вирусы имеют рецептор гемагглютинин, который вызывает агглютинацию различных эритроцитов – куриных, эритроцитов лягушки, бараньих, человеческих и др. Такой способностью обладают многие вирусы, т.е. реакция гемагглютинации неспецифическая, идентифицировать вирус по ней нельзя, а обнаружить можно. Реакция проста в постановке: на стекле к капле взвеси эритроцитов добавляют каплю культуральной или аллантоисной жидкости, и наблюдают агглютинацию эритроцитов. Феномен гемадсорбции – это способность вирусов адсорбироваться на клетках культуры ткани, содержащих вирус. В основе этой реакции также лежит действие рецептора гемагглютинина. Эта реакция используется тогда, когда вирус не вызывает ЦПД и длительно не покидает клетки. Методы идентификации вирусов. Вирусы идентфицируются по антигенной структуре в реакциях торможения гемагглютинации (РТГА), торможения гемадсорбции (РТГАдс.), нейтрализации (РН), связывания комплемента (РСК). Для идентификации вирусов по антигенной структуре необходимы диагностические сыворотки, содержащие антитела к антигенам вирусов. Методы лабораторной диагностики вирусных инфекций: микроскопический, вирусологический, иммунологический. Методы диагностики вирусных инфекций. Вирусоскопический метод диагностики – обнаружение вирусов путем световой или электронной микроскопии; обнаружение телец включений в клетках, пораженных вирусами. Вирусологический метод диагностики – выделение и идентификация вирусов. Этапы: а) накопление вирусов при культивировании их на одной из моделей; б) индикация и титрование вирусов; в) идентификация вирусов. 3. Биологический метод диагностики - заражение восприимчивых лабораторных животных с целью получения типичной клинической картины заболевания. Иммунологические методы 1. Собственно-имунный метод– выявляют вирусные антигены в патологическом материале с помощью ИФА, ИФ, ИП, имунный электрофорез и т.д. 2. Серологический метод – определение наличие антител, их титр или динамику нарастания титра с помощью РСК, РТГА, РН, ИФА. Генетический метод – ПЦР, поиск и идентификация вирусной НК в патологическом материале. Вирусы бактерий – бактериофаги. Морфология и строение бактериофагов, их химический состав. Фаги вирулентные и умеренные, стадии их взаимодействия с бактериальной клеткой. Явление лизогении, фаговая конверсия, значение этих явлений. Формы существования фагов 1. Вирион – вне клетки бактерий 2. Вегетативный фаг – внутри клетки и размножается 3. Профаг – в составе генома клетки бактерий Бактериофаг не имеет клеточного строения Размер фаговых частиц от 20 до 200 нм Строение фагов: 1. Головка, в которую заключена нуклеиновая кислота (ДНК или РНК). Головка состоит из белков. Головка выполняет защитную функцию: упаковка и хранение генетической информации фага. 2. Воротничок – отграничивает головку от хвостового отростка. 3. Хвостовой отросток - это полый цилиндр, через который проходит нуклеиновая кислота. Хвостовой отросток покрыт чехлом, способным сокращаться. Хвостовой отросток и чехол состоят из белков. Хвостовой отросток необходим для введения нуклеиновой кислоты фага в клетку бактерий. 4. Базальная пластинка, на которой расположены шипы и фибриллы. На шипах может быть фермент лизоцим. Шипы необходимы, чтобы механически прокалывать и с помощью лизоцима растворять клеточную стенку бактерий. Длинные нити фибриллы осуществляют адсорбцию фага на поверхности клеток бактерий. Различают следующие морфологические типы фагов: 1 тип – нитевидные фаги. тип – имеют головку и зачаток хвостового отростка (мелкие РНК- содержащие фаги). тип – имеют головку и короткий хвостовой отросток тип имеют головку и длинный несокращающийся хвостовой отросток. 5 тип имеет головку и длинный сокращающийся хвостовой отросток По характеру взаимодействия с клеткой бактерий фаги делят на вирулентные и умеренные. Вирулентные фаги Взаимодействие вирулентного фага с бактериальной культурой заканчивается ее лизисом. Формы существования вирулентного фага: вирион, вегетативный фаг. Литический цикл развития вирулентных фагов: 1. Адсорбция – прикрепление фага на поверхности чувствительной клетки бактерий. На первых этапах адсорбции реализуется электростатическое притяжение фага к клетке, а затем рецепторное узнавание. 2. Проникновение нуклеиновой кислоты фага в цитоплазму клетки бактерий. Нуклеиновая кислота фага проникает в цитоплазму клетки по типу инъекции. Белки капсида, хвостовой отросток остаются снаружи клетки. 3. Репродукция фага внутри клетки: эклипс, синтез ранних фаговых белков (ферменты фага), репликация нуклеиновой кислоты фага, синтез поздних фаговых белков (структурные белки), сборка фаговых частиц – морфогенез. 4. Выход фага из клетки путем ее лизиса. Умеренные фаги Взаимодействие умеренного фага с бактериальной клеткой не всегда заканчивается ее лизисом. Формы существования умеренного фага: вирион, профаг, вегетативный фаг. Лизогенный цикл развития умеренного фага: 1. Адсорбция 2. Проникновение нуклеиновой кислоты фага в цитоплазму клетки 3. Встраивание нуклеиновой кислоты фага в геном клетки бактерий и существование в форме профага. Все клетки бактерий, несущие в геноме копию профага, будут лизогенными. Это явление получило название лизогении. Умеренные фаги могут вносить в геном бактерий новые свойства (устойчивость к антибиотикам, токсинообразование и т. д.) – это явление фаговой конверсии. Индукция профага – при условиях, неблагоприятных для клетки (облучение культуры УФЛ, старение культуры, истощение питательной среды, содержание в питательной среде анитибиотиков и т. д.), профаг может выйти из состава бактериальной хромосомы и перейти на литический цикл развития, который заканчивается лизисом бактериальной культуры. Умеренные фаги могут нанести вред микробиологическому производству. Так, если микроорганизмы, используемые в качестве продуцентов вакцин, антибиотиков и других биологических веществ, оказываются лизогенными, существует опасность перехода умеренного фага в вирулентную форму, что неминуемо приведёт к лизису производственного штамма. Методы культивирования фагов, их титрование. Применение бактериофагов в микробиологии и медицине. Культивирование фагов Фаги культивируют на чувствительных культурах бактерий. На жидких питательных средах получают фаголизаты. На плотных средах можно получить негативные колонии, или бляшки. Из изолированной бляшки можно получить чистую культуру бактериофага. Методы обнаружения и титрования фагов Метод стекающей капли. На газон чувствительной культуры наносят каплю фаголизата. Посевы культивируют сутки. По ходу стекающей капли наблюдают зону лизиса бактериальной культуры. Титрование фагов в жидкой питательной среде по Аппельману. В жидкой питательной среде делают серийные десятикратные разведения фаголизата (с первого по десятое разведение). В каждую пробирку добавляют по 0,1 мл чувствительной тест-культуры бактерий, посевы помещают на сутки в термостат. В качестве контроля используют культуру бактерий без фага. Определяют титр бактериофага – самое большое разведение фага, при котором наблюдается лизис тест-культуры бактерий. Титрование фагов на плотной питательной среде по Грациа. Делают серийные десятикратные разведения фаголизата в физрастворе. В пробирку с 5мл расплавленного и остуженного агара добавляют 1 мл соответствующего разведения фаголизата и 0,1 мл чувствительной тест-культуры бактерий. Эту смесь верхним слоев выливают на чашку Петри с агаром. Посевы помещают в термостат, через сутки на газоне бактериальной культуры появляются негативные колонии бактериофага. Это методика точная, так как позволяет определить количество фага в фаголизате с точностью до одной фаговой частицы. Применение фагов в медицине Бактериофаги делят диагностические и лечебно-профилактические. Диагностические фаги используют: 1. Для идентификации культур бактерий 2. Для типирования культур бактерий с целью определения источника инфекции и путей ее распространения (используют типовые наборы фагов). 3. Для индикации возбудителя (есть фаг, следовательно, есть и возбудитель). Лечебно-профилактические фаги: 1. Для профилактики инфекционных заболеваний в очагах инфекции 2. Для комплексного лечения инфекционных заболеваний Производят брюшнотифозный, дизентерийный, синегнойный, стафилококковый фаги и комбинированные препараты. Способы введения фагов в организм человека: местно, энтерально и реже парентерально. Фаги используют ограниченно для лечения инфекционных заболеваний, так как не все штаммы возбудителей будут чувствительны к фагам. Фаги не позволяют полностью очистить организм от возбудителя, но способны существенно снизить дозу возбудителя. Умеренные фаги используют в генной инженерии и биотехнологии в качестве векторов для получения рекомбинантных ДНК. Организация генетического материала бактериальной клетки: бактериальная хромосома, плазмиды, транспозоны, Is - последовательности. Генотип и фенотип бактерий. ОРГАНИЗАЦИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА У БАКТЕРИЙ ГЕНОТИП – совокупность всех генов организма. ФЕНОТИП – совокупность внешних признаков, зависит от генотипа и факторов окружающей среды. НОСИТЕЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ИНФОРМАЦИИ – молекула ДНК. Нуклеиновая кислота состоит из азотистых оснований - ПУРИНОВЫХ (А, Г) и ПИРИМИДИНОВЫХ (Ц, У, Т). Пуриновые и пиримидиновые основания комплементарны друг другу. ОСОБЕННОСТИ ГЕНЕТИЧЕСКОГО КОДА • Генетический код считывается триплетами азотистых оснований – кодонами • Кодоны не перекрываются • Вырожденность генетического кода, т.е. одну аминокислоту могут кодировать несколько кодонов ХРОМОСОМА БАКТЕРИЙ (НУКЛЕОИД) • Бактерии гаплоидны – имеют одну хромосому • Бактериальная хромосома представлена двумя нитями ДНК, замкнутыми в кольцо • Белков гистонов нет, бактериальная хромосома находится в суперскрученном состоянии • Механизм репликации полуконсервативный • Хромосома бактерий содержит до 4000 генов, размер 5 х 106 п.н., у человека - 2,9 х 109 п.н. • Гены организованы в опероны ПЛАЗМИДЫ БАКТЕРИЙ ПЛАЗМИДЫ – внехромосмные кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, способные к автономной репликации • Плазмиды несут от 40 до 50 генов • Жизненно важные признаки не кодируют и могут утрачиваться клеткой • В клетке выполняют регуляторные и кодирующие функции • Плазмиды могут находиться в цитоплазме клетки автономно или встраиваться в бактериальную хромосому (интегративные плазмиды) • Конъюгативные плазмиды могут обеспечить свой перенос из клетки в клетку • Неконъюгативные плазмиды – не передаются самостоятельно из клетки в клетку ГРУППЫ ПЛАЗМИД • R-плазмиды • Плазмиды токсинообразования (Tox-плазмиды) • Плазмиды бактериоциногенности (Col-плазмида) • F-плазмида, в составе бактериальной хромосомы - Hfr-фактор • Плазмиды биодеградации природных и неприродных соединений • Плазмиды патогенноси: Tox- , Hly-, Ent- плазмиды, плазмиды адгезии, капсулообразования и др. МОБИЛЬНЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭЛЕМЕНТЫ • ИНСЕРЦИОННЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ (Is-элементы) • ТРАНСПОЗОНЫ (Tn-элементы) Транспозиция – процесс встраивания транспозонов или инсерционных элементов в геноме бактерий ИНСЕРЦИОННЫЕ ЭЛЕМЕНТЫ • Размер примерно 1500 п.н. • Содержат только гены, обеспечивающие их транспозицию • Фенотипические свойства не кодируют • Самостоятельно не реплицируются, только в составе бактериальной хромосомы, плазмид, бактериофагов • Автономно в цитоплазме клеток не обнаруживаются • Регулируют активность генов в клетке («включают» и «выключают» гены) • Участвуют в процессах рекомбинации внутри генома • Вызывают мутации ТРАНСПОЗОНЫ • Размер от 2000 до 7000 п.н. • Кодируют фенотипические свойства (устойчивость к антибиотикам, токсинообразование и пр.) • Самостоятельно не реплицируются, только в составе бактериальной хромосомы, плазмид, бактериофагов • Передаются из клетки в клетку бактерий с плазмидами, фагами и фрагментами бактериальной хромосомы • Участвуют в процессах рекомбинации внутри генома • Вызывают мутации Виды изменчивости у бактерий: модификационная и генотипическая изменчивость. Мутации, виды мутаций, механизмы мутаций, мутагены. ВИДЫ ИЗМЕНЧИВОСТИ • ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ: модификации • ГЕНОТИПИЧЕСКАЯ ИЗМЕНЧИВОСТЬ: мутации и рекомбинации МОДИФИКАЦИИ – фенотипическое изменение одного или нескольких признаков МОДИФИКАЦИИ • Не связаны с изменениями в первичной структуре ДНК • Не наследуются • В основе модификаций индуцибельный синтез ферментов МУТАЦИИ – изменение в первичной структуре ДНК, ведущее к изменению одного или нескольких признаков МУТАЦИИ • Связаны с изменением первичной структуры ДНК • Наследуются КЛАССИФИКАЦИЯ МУТАЦИЙ ПО ПРОИСХОЖДЕНИЮ • Спонтанные («дикие») – возникают без видимого воздействия • Индуцированные – возникают под влиянием физических и химических факторов – мутагенов Физические мутагены: УФО, ионизирующая радиация, высокие температуры и др. Химические мутагены: аналоги азотистых оснований, азотистая кислота, акридиновые красители, алкилирующие агенты, нитрозосоединения (нитрозогуанин, нитрозометилмлчевина – это супермутагены), некоторые химиотерапевтические препараты (препараты нитрофуранового ряда). КЛАССИФИКАЦИЯ МУТАЦИЙ ПО ХАРАКТЕРУ ИЗМЕНЕНИЙ В ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЕ ДНК • Генные (точковые) – затрагивают одну пару азотистых оснований: транзиции; трансверсии; мутации со сдвигом рамки считывания; нонсенс-мутации (образуются терминальные кодоны – УАА, УАГ, УГА). • Хромосомные – затрагивают целый фрагмент ДНК: делеции; инверсии; дупликации; амплификации; инсерции и др. Различают прямые и обратные мутации (реверсии) Прямая мутация – вызывает повреждение в гене Обратная мутация – компенсирует эффект прямой мутации КЛАССИФИКАЦИЯ МУТАЦИЙ ПО ФЕНОТИПИЧЕСКИМ ПОСЛЕДСТВИЯМ ДЛЯ КЛЕТКИ • Нейтральные – фенотипически никак не отражаются • Условно-летальные – приводят к гибели клетки при определенных условиях • Летальные – всегда ведут к гибели клетки СИСТЕМЫ РЕПАРАЦИИ У БАКТЕРИЙ Репарация – процессы, направленные на восстановление поврежденной структуры ДНК • ФОТОРЕАКТИВАЦИЯ (световая репарация) – ферменты этой системы работают на свету, восстанавливает поврежденную ДНК с точностью до одного нуклеотида. • ЭКСЦИЗИОННАЯ (темновая репарация) – ферменты этой системы работают без света, восстанавливает поврежденную ДНК с точностью до одного нуклеотида. • SOS-репарация – эта система работает, когда клетка находится на грани гибели, при множественных повреждениях ДНК. Эта система работает быстро, но совершает «ошибки» - точно не восстанавливает поврежденный участок ДНК. Генотипические рекомбинации: трансформация, трансдукция, конъюгация. Их механизм. РЕКОМБИНАЦИЯ У БАКТЕРИЙ Рекомбинация – обмен генетической информацией • Рекомбинация внутри генома обеспечивают интегративные плазмиды, транспозоны, инсерционные элементы • Рекомбинация между геномами обеспечивается за счет конъюгации, трансформации и трансдукции ТИПЫ РЕКОМБИНАЦИЙ • НЕСПЕЦИФИЧЕКАЯ (общая рекомбинация) – между любыми гомологичными участками ДНК • СПЕЦИФИЧЕСКАЯ (сайт-специфическая рекомбинация) – только между определенными гомологичными участками ДНК • НЕЗАКОННАЯ – между любыми, даже негомологичными участками ДНК КОНЪЮГАЦИЯ У БАКТЕРИЙ 1949 г., Ледерберг и Татум – открыли конъюгацию у бактерий КОНЪЮГАЦИЯ – перенос генетической информации из клетки-донора в клетку-реципиент с помощью конъюгационного мостика. СТАДИИ КОНЪЮГАЦИИ • Контакт донора и реципиента с помощью F-пилей • Образование конъюгационного мостика • Передача копии генетического материала по конъюгационному мостику от донора к реципиенту • Встраивание ДНК донора в геном реципиента, т. о., реципиент получает новые свойства Все этапы конъюгации контролирует F-плазмида Доноры несут F-плазмиду и имеют фенотип F+ Реципиенты не имеют F-плазмиды и имеют фенотип – F- Рекомбинатты могут иметь фенотип F+ или F/ , это зависит от типа конъюгации F-плазмида относится к интегративным плазмидам, в составе хромосомы донора носит название Hfr-фактора. ТИПЫ КОНЪЮГАЦИИ • Плазмидная • Хромосомная • Сексдукция (вариант плазмидной конъюгации) Методом прерванной конъюгации осуществляется картирование бактериальной хромосомы ТРАНСФОРМАЦИЯ У БАКТЕРИЙ 1928 г, Гриффитс – открыл трансформацию у бактерий ТРАНСФОРМАЦИЯ – процесс поглащения реципиентной клеткой чистого препарата ДНК донора из окружающей среды. СТАДИИ ТРАНСФОРМАЦИИ • Адсорбция ДНК донора на поверхности реципиента • Проникновение ДНК донора в клетку реципиента • Встраивание ДНК донора в геном реципиента, т. о., реципиент получает новые свойства Компетентные клетки – клетки реципиента, способные поглащать ДНК донора. Трансформацию используют для картирования. ТРАНСДУКЦИЯ 1951 г., Ледерберг и Циндер – открыли трансдукцию. ТРАНСДУКЦИЯ – передача генетического материала от донора к реципиенту с помощью бактериофагов. ЭТАПЫ ТРАНСДУКЦИИ • Формирование трансдуцирующего фага в клетках донора • Адсорбция трансдуцирующего фага на поверхности реципиента • Проникновение нуклеиновой кислоты фага в цитоплазму реципиента • Встраивание нуклеиновой кислоты фага в геном реципиента, т. о., реципиент получает новые свойства Трансдуцирующие фаги являются умеренными. Это дефектные фаги, утратившие часть своего генома и неспособные к самостоятельной репликации. ТИПЫ ТРАНСДУКЦИИ • Неспецифическая - бактериофаг от донора к реципиенту переносит разные гены • Специфическая - бактериофаг от донора к реципиенту переносит одни и те же гены • Абортивная – бактериофаг не встраивается в хромосому реципиента и теряется в потомстве КАК ОПРЕДЕЛИТЬ ЧАСТОТУ КОНЪЮГАЦИИ, ТРАНСФОРМАЦИИ, ТРАНСДУКЦИИ Количество рекомбинантных клонов в 1 мл поделить на общее количество клеток реципиента или донора, участвующего в опыте (все расчеты на 1мл) ДИССОЦИАЦИИ В МИКРОБНОЙ ПОПУЛЯЦИИ – разделение культуры бактерий на два или более типов, обычно наблюдаются при неблагоприятных условиях окружающей среды. ПРИЧИНЫ ДИССОЦИАЦИЙ • Модификации • Мутации • Рекомбинации ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ являются причиной формирования лекарственной устойчивости и передачи вирулентных свойств у бактерий: • В результате модификаций клетки бактерий образуют ферменты, разрушающие антибиотики • Мутации в плазмидных и хромосомных генах бактерий ведут к утрате «мишени» для антибиотика • При конъюгации, трансформации и трансдукции осуществляется перенос генов лекарственной устойчивости и генов, обеспечивающих вирулентные свойства бактерий Плазмиды бактерий, виды плазмид и их роль в детерминации патогенных признаков и лекарственной устойчивости. ПЛАЗМИДЫ БАКТЕРИЙ ПЛАЗМИДЫ – внехромосмные кольцевые двухцепочечные молекулы ДНК, способные к автономной репликации • Плазмиды несут от 40 до 50 генов • Жизненно важные признаки не кодируют и могут утрачиваться клеткой • В клетке выполняют регуляторные и кодирующие функции • Плазмиды могут находиться в цитоплазме клетки автономно или встраиваться в бактериальную хромосому (интегративные плазмиды) • Конъюгативные плазмиды могут обеспечить свой перенос из клетки в клетку • Неконъюгативные плазмиды – не передаются самостоятельно из клетки в клетку ГРУППЫ ПЛАЗМИД • R-плазмиды • Плазмиды токсинообразования (Tox-плазмиды) • Плазмиды бактериоциногенности (Col-плазмида) • F-плазмида, в составе бактериальной хромосомы - Hfr-фактор • Плазмиды биодеградации природных и неприродных соединений • Плазмиды патогенноси: Tox- , Hly-, Ent- плазмиды, плазмиды адгезии, капсулообразования и др. У бактерий различных видов обнаружены R-плазмиды,несущие гены, ответственные за множественную устойчивость к лекарственным препаратам — антибиотикам, сульфаниламидам и др., F-плазмиды,или половой фактор бактерий, определяющий их способность к конъюгации и образованию половых пилей, Ent-плазмиды,детерминирующие продукцию энтеротоксина. Распространение микроорганизмов в окружающей среде. Понятие о микробных биоценозах. Экологические связи в микробиоценозах: симбиоз, комменсализм, паразитизм. Микроорганизмы распространены повсюду. Они заселяют почву, воду, воздух, растения, организмы животных и людей- экологические среды обитания микробов. Выделяют свободноживущие и паразитические микроорганизмы. Всюду, где есть хоть какие- то источники энергии, углерода, азота, кислорода и водорода (кирпичиков всего живого), обязательно встречаются микроорганизмы, различающиеся по своим физиологическим потребностям и занимающих свои экологические ниши. Титаническая роль микроорганизмов в круговороте веществ в природе имеет исключительное значение для поддержания динамического равновесия биосферы. Микроорганизмы в экологических нишах сосуществуют в виде сложных ассоциаций- биоценозов с различными типами взаимоотношений, в конечном счете обеспечивающих сосуществование многочисленных видов прокариот и различных царств жизни. Все типы взаимоотношений микроорганизмов объединяются понятием симбиоз. Он может быть антогонистическим и синэргическим. Роль микроорганизмов в круговороте веществ в природе. Под круговоротом веществ в природе понимают циклы превращения химических элементов, из которых построены живые существа, происходящие вследствие разнообразия и гибкости метаболизма микроорганизмов. Наибольшее значение для всего живого имеет обмен (кругооборот) углерода, кислорода, водорода, азота, серы, фосфора и железа. Этапы кругооборота различных химических элементов осуществляется микроорганизмами разных групп. Непрерывное существование каждой группы зависит от химических превращений элементов, осуществляемых другими группами микроорганизмов. Жизнь на Земле непрерывна, поскольку все основные элементы жизни подвергаются циклическим превращениям, в значительной степени определяемых микроорганизмами |