Национальный медицинский исследовательский центр эндокринологии министерства здравоохранения российской федерации на правах рукописи кравцова наталия Сергеевна стимуляция сперматогенеза гонадотропинами и антиэстрогенами при патозооспермии и бесплодии
 Скачать 0.81 Mb.
|
|
2.1 ПЛАНИРОВАНИЕ И ДИЗАЙН Исследование предполагало 3 этапа Этап 1 – одномоментное сплошное исследование бесплодных пар с целью определения частоты и основных патогенетических факторов мужского бесплодия. Этап 2 - проспективное исследование с целью оценки эффективности кло- мифена цитрата по сравнению с конкурирующим вмешательством - комбинированным использованием препарата ХГ в сочетании с препаратом р-ФСГ у мужчин с олиготератозооспермией. Гипотеза исследования – эффективность вмешательств будет отличаться. При выполнении этого этапа ряд результатов был получен в ретроспективном исследовании, где группы были сформированы поре- зультатам терапии. Этап 3 - проспективное исследование с целью оценки эффективности комбинированной терапии препаратами ХГ и р-ФСГ по сравнению с отсутствием вмешательства в отношении увеличения частоты успешных попыток ВРТ. Гипотеза исследования – вмешательство по сравнению сего отсутствием повысит эффективность ВРТ. На первом этапе не предполагалось формирование контрольной группы, в исследование были включены все бесплодные пары, обратившиеся за медицинской помощью. Второй этап исследования не предполагал формирование контрольной группы, так как препараты, используемые в исследовании, применялись в соответствии с официально зарегистрированными показаниями. Однако, поскольку третий этап исследования требовал наличие контрольной группы, которая была сформирована из пациентов с олиготератозооспермией, не получавших стимулирующей терапии перед ВРТ, а мы имели возможность наблюдать этих пациентов в 6 месячной динамике за время документальной подготовки к ВРТ, 34 данные обследования этих мужчин представлены для сравнения и при описании результатов второго этапа исследования. План обследования включал общеклинические и андрологические методы обследования, включая методы оценки качества эякулята проводимые исходно ив динамике. Дизайн исследования представлен на рисунке 1. 1 этап 2 этап 3 этап Рисунок 1. Дизайн исследования Все пары с бесплодием (n=2140) Мужчины с олиготератозооспермией (n=150) Мужчины с олиготератозооспермией и здоровыми партнершами (n=120) Группа кломифена цитрата 6 месяцев (n=40) (n=40) Группа ХГ+рФСГ 6 месяцев (n=40) Контрольная группа (n=40) Беременности нет Беременность, выбытие из исследования Беременности нет ЭКО Терапия ХГ+рФСГ 6 месяцев Беременности нет 35 2.2 Характеристики выборки больных Было обследовано 2140 супружеских пар, обратившихся первично в ФГБУ ЭНЦ Минздрава РФ в период с 2009 по 2018 год по поводу бесплодия, и прошедших клиническое обследование в отделении андрологии и урологии (зав. отд. проф, дм. н. Курбатов Д. Г отделе стационарозамещающих технологий (зав. отд. км. н. Ульянова И. Н отделении вспомогательных репродуктивных технологий (зав. отд. км. н. Витязева И.И.) ФГБУ НМИЦ Эндокринологии Минздрава РФ. Способ формирования выборки – сплошной. Выборка является репрезентативной для российской популяции мужчин по основным параметрам – возрасту обращаемости по поводу бесплодия (для российской популяции – 30-40 лет, ИМТ пациентов (для российской популяции 22-32 кг/м 2 ), длительности бесплодия до обращения (для российской популяции 2-5 лет, распространенности эн- докринопатий [14]. Так как, формирование выборки проводилось из мужчин, наблюдавшихся в крупном федеральном медицинском центре возможно искажение репрезентативности в отношении российской популяции по уровню образования и доходов пациентов. Все пациенты добровольно подписали информированное согласие на участие в исследовании. ЛЭК ФГБУ ЭНЦ Минздрава РФ постановил, что рассматриваемая работа соответствует требованиям этических стандартов добросовестной клинической практики, протокол № 19 от 22.09.2009 г. Авторы работы декларируют полное отсутствие конфликта интересов. Клинические характеристики выборки пациентов (n=2140) представлены в таблице 1. 36 Таблица 1. Характеристики выборки (n=2140) Параметр n Значение Возраст, лет 2140 34[20;48]* ИМТ, кг/м2 2140 27[21;35]* Дети в анамнезе, % 449 21,0 Бесплодие в браке, лет 2140 3[1;5]* Наличие попыток ВРТ в анамнезе, % 321 15,0 Ожирение, % 471 22,0 НТГ, % 128 6,0 Сахарный диабет, % 107 5,0 Первичный гипогонадизм, % 43 2,0 Вторичный гипогонадизм, % 280 13,1 Гиперпролактинемия, % 81 3,8 Хромосомные аномалии, % 66 3,0 Хирургические вмешательства на половых органах, % 43 2,0 Патозооспермия,% 1650 77,1 Примечание *Me[Q1;Q3] Из представленной выборки были отобраны мужчины, соответствующие критериям включения и не имевших состояний, расцениваемых как критерии исключения. Критерии включения мужчин 1. Отсутствие наступления беременности в паре в течение 1 года и более при регулярной половой жизни без использования средств и методов контрацепции. Возраст 19 до 35 лет. 3. Олиготератозооспермия. 37 4. Наличие у партнерши условий для наступления спонтанной беременности. Критерии исключения мужчин 1. Недееспособные субъекты. 2. Подозрение на серьезное психическое заболевание, наркоманию, алкоголизм согласно анамнезу и/или клиническому обследованию. 3. Наличие в анамнезе травм или хирургических вмешательств на половых органах. 4. Криптозооспермия, азооспермия (любая форма. 6. Гипергонадотропный гипогонадизм, гипотиреоз, гиперпролактинемия, гиперкортицизм, сахарный диабет 1 и 2 типов, ожирение. 7. Нарушения кариотипа и половых хромосом. 8. Одновременное участие в другом клиническом исследовании. 9. Опухолевые заболевания, включая в анамнезе. 10. Варикоцеле. 11. Урогенитальные инфекции, воспалительные заболевания половых желез, бактериоспермия, лейкоспермия. 12. Носительство антиспермальных антител. 13. Подозрение на то, что пациент неготов следовать рекомендациям исследователя или медицинского персонала. 14. Использование непредусмотренных протоколом исследования методов половой реабилитации. Пациенты, имеющие урогенитальные инфекции, воспалительные заболевания половых желез, бактериоспермию, лейкоспермию на момент первичного обследования получили соответствующее антибактериальное, противовирусное и противовоспалительное лечение, после чего были включены в исследование. Несмотря на то, что дальнейшее исследование предполагало включение пациентов только мужского пола, для исключения женского фактора бесплодия, 38 препятствующего наступлению спонтанной беременности, партнерши мужчин также были обследованы в отделении вспомогательных репродуктивных технологий. Критерии исключения женщин 1. Наружный генитальный эндометриоз тяжелой формы, включая эндо- метриомы яичников. 2. Двусторонняя резекция яичников или единственного яичника. 3. Множественная миома матки с нарушением питания или деформацией полости матки. 4. Аномалия развития матки. 5. Толщина эндометрия менее мм надень менструального цикла. 6. Невынашивание беременности в анамнезе. 7. Множественные неудачные попытки ВРТ. 8. Опухолевые заболевания, включая в анамнезе. 9. Эндокринные заболевания гипотиреоз, гиперпролактинемия, гипер- кортицизм, СД 1 и 2 типов, ожирение, синдром поликистозных яичников. Таким образом, 150 мужчин, в результате обследования, не имели состояний, расцениваемых, как критерии исключения и соответствовали критериям включения. Однако, после обследования женщин, лишь 120 пар из них были включены в исследование, таблица 2. 39 Таблица 2. Характеристики выборки мужчин, включенных в дальнейшее исследование (n=120) Параметр Значение Возраст, лет 27[24;32] * ИМТ, кг/м2 Дети в анамнезе, % 41 Объем яичек, мл Тестостерон, нмоль/л 15,1[12,9;17,1]* ЛГ, ЕД/мл 3,9[3,3;4,1]* ФСГ, ЕД/мл 4,7[4,2;5,3]* Ингибин В, пг/мл 55[23;109]* Количество сперматозоидов, млн/мл 10[7;11]* Подвижность А+В, % 18[14;23]* % морфологически нормальных форм 2[0;3]* Примечание *Me[Q1;Q3] Поскольку больные поступали на исследование не одновременно, а в течение длительного периода времени, при этом назначение каждого из видов исследуемой терапии или ВРТ как с предшествующей стимуляцией, таки без таковой было допустимо любому из пациентов, группы формировались произвольно. Тем не менее при формировании групп учитывался возраст пациента и наличие детей в анамнезе, что позволило сформировать группы сопоставимые по этим параметрам. Несмотря на то, что исследование проводилось на протяжении 8 лет, проблема исторического смещения представилась малоактуальной, поскольку за это время не было изменений нив диагностических критериях, нив лечебных подходах, группы пациентов были гомогенны по возрасту, ИМТ, основному диагнозу данные об изменении российской популяции мужчин с бесплодием за приводимый срок также отсутствуют в литературе. 40 Пациенты первой группы (группа кломифена цитрата, n=40) получали кло- мифена цитрат в дозе 50 мг перорально утром ежедневно. Пациенты второй группы (группа ХГ+рФСГ, n=40) получали комбинированную терапию препаратами Хорионического гонадотропина в индивидуально подобранной дозе, которая составила от 1000 до 3000 ЕД 1 разв дня внутримышечно и препарат р-ФСГ в дозе 75 ЕД подкожно через день. Доза ХГЧ определялась путем оценки уровня общего тестостерона утром натощак после инъекции препарата (целевым значением являлось 20-33 нмоль/л). Эффективность лечения оценивалась через 6 месяцев. Под эффективностью терапии понималось наступление беременности у партнерши и/или устранение олиготератозооспермии. Пациенты, у которых наступило зачатие в дальнейшее исследование не включались. Больным с отсутствием зачатия после использования кломифена была назначена комбинированная терапия препаратами Хорионическим гонадотропином в индивидуально подобранной дозе, которая составила от 1000 до 3000 ЕД 1 разв дня внутримышечно и рекомбинантный препарат ФСГ в дозе 75 ЕД подкожно через день на 6 месс дальнейшей оценкой эффективности лечения. Далее был проведен ретроспективных анализ данных в группах пациентов, сформированных по результатам терапии – группы эффективного и неэффективного лечения. Всем больным с отсутствием зачатия на фоне комбинированной терапии гонадотропинами лечение бесплодия осуществлялось с использованием ВРТ. 40 человек составили группу контроля, не получавшую стимулирующей терапии перед ВРТ. Плацебо в группе контроля не применялось. Лечение бесплодия проводилось методом экстракорпорального оплодотворения с использованием техники микрохирургического оплодотворения ИКСИ. Все этапы подготовки и ведения пациентов в протоколе осуществлялись в соответствии с Приказом Минздрава России нот февраля 2013 года " О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению. 41 Для оценки эффективности экстракорпорального оплодотворения оценивались следующие показатели 1. Частота оплодотворения 2. Частота формирования бластоцисты высокого качества 3. Частота наступления клинической беременности. 4. Частота родов живыми детьми За время проведения исследования никто из пациентов не выбыл, все закончили полный курс планируемой терапии. 2.3 Методы исследования Все включенные в исследование пациенты были обследованы по стандартной единой схеме, включающей сбор жалоб, данных анамнеза, анализ медицинской документации, клиническое обследование. Регистрировались следующие результаты обследования рост, вес, индекс массы тела, объем яичек, показатели уровней ЛГ, ФСГ, тестостерона, ингибина В, спермограммы. Физикальное обследование включало общий осмотр с определением характеристик оволосения, в том числе и лобкового, типа телосложения, состояния грудных железа также оценку состояния и степени развития наружных половых органов. С целью оценки объема яичек проводилась ультразвуковое исследование на аппарате GE Lodgiq 3 с использованием линейного датчика с частотой 10 МГц. При лабораторном обследовании проводилось определение уровней ЛГ, ФСГ, общего тестостерона и ингибина В в трех аликвотах сыворотки крови. Уровни ЛГ (норма 2,5-11,0 ЕД/л), ФСГ (норма 1,6-9,7 ЕД/л) и тестостерона норма нмоль/л) определялись на автоматическом анализаторе Vitros 3600 (Johnson and Johnson (США) методом усиленной хемилюминесценции, а уровни ингибина В (норма 25-325 пг/мл) методом иммуноферментного анализа с использованием наборов Beckman Coulter (США. Кровь для исследования забиралась в пробирки типа «вакутейнер» в утреннее время натощак из локтевой вены. Оценка качества эякулята осуществлялась в соответствии с рекомендациями ВОЗ, 2010 г. путем световой микроскопии с помощью микроскопа Olimpus 41 CX (Япония) и камеры Маклера того же производителя. Спермограмму анализировали двукратно (ориентировались на лучший результат, оценивались следующие показатели количество сперматозоидов в 1 млн. эякулята (норма 15 млн. и более, количество морфологически нормальных форм (норма 4% и более (критерий Крюгера)), подвижность А+В (норма 40% и более. Забор эякулятата осуществлялся в одноразовые стерильные контейнеры Sarstedt (Австралия) путем мастурбации при половом воздержании 3-5 суток. Кроме того, на базе медико-биологической лаборатории МГУ, при окончательной оценке эффективности лечения проводилось Электронно- микроскопическое исследование эякулята (ЭМИС) путем центрифугирования, этаноловой, далее эпоксидной фиксации клеток эякулята с дальнейшим электронным микроскопированием х для исследования органоидов их для исследования жгутиков [4]. Оценивались число интактных головок (норма > 4%), содержание сперматозоидов с недостаточно конденсированным хроматином (норма <30%), содержание деградировавших сперматозоидов. 2.4 Статистические методы анализа данных Статистическая обработка полученных данных была проведена с использованием пакета прикладных программ STATISTICA (Stat Soft Inc. США, версия 8.0) [17]. Поскольку объемы выборок былине большими, а распределения признаков не являлись нормальными, сравнение по количественным признакам осуществлялось непараметрическим методом с использованием критерия Манна- Уитни для х независимых группа также теста Вилкоксона – для х зависимых групп. Сравнение групп по качественным признакам осуществлялось непараметрическим методом путем анализа таблиц сопряженности с использованием двухстороннего точного критерия Фишера для независимых групп. Статистически значимыми считали различия при p < 0,05, а наличие статистической тенденции при p < 0,1. При множественных сравнениях проводился перерасчет уровня значимости p с применением поправки Бонферрони (перерасчитывались достигнутые уровни значимости. Результаты исследований представлены в виде медиан параметров, интерквартильного отрезка для количественных признаков (возраст, ИМТ, объем яичек, уровни тестостерона, ЛГ, ФСГ, Ингибина В, количество сперматозоидов в мл эякулята, процентное содержание подвижных сперматозоидов А+В, процентное содержание морфологически нормальных форм сперматозоидов, процентное содержание сперматозоидов с интактными головками, некон- денсированным хроматином, деградировавших сперматозоидов, количество полученных у пациентки яйцеклеток, число перенесенных эмбрионов, частота оплодотворения, частота формирования бластоцисты высокого качества, атак же абсолютных чисел и процентов с указанием 95%ДИ для бинарных признаков наличие детей в анамнезе, устранение олиготератозооспермии, наступление беременности, показатель родов живыми детьми по отношению к числу наступивших беременностей. 95% ДИ рассчитывался с использованием программного обеспечения ресурса www.graphpad.com/quickcalcs/confinterval1/ «Exact» confi- dence intervals (метод Clopper и Pearson, Biometrica 26:404-413, 1934). 44 ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Характеристика основных факторов бесплодия Согласно результатам обследования пациентов, были выявлены женский, мужской и сочетанные факторы бесплодия, таблица 3. Таблица 3. Частота видов бесплодия в парах (n=2140) Фактор бесплодия n % Изолированный фактор мужского бесплодия 306 14 Изолированный фактор женского бесплодия 447 21 Сочетанный фактор бесплодия 1344 63 Бесплодные пары с неустановленным фактором Таким образом, на долю мужского бесплодия суммарно приходится 77,1 (95%ДИ 75,3-91,1), на долю женского – 83,7 (95%ДИ 82,1-91,4)%. 2,0 (95%ДИ 1,5-2,7)% составляют пары с отсутствием беременности менее года и невыявлен- ными факторами бесплодия. Причины мужского бесплодия представлены в таблице 4. 45 Таблица 4. Причины мужского бесплодия (n=1650) Причина % Урогенитальные инфекции в сочетании с заболеваниями орхо-эпидидимо-простатовезикулярного комплекса 18,0 Варикоцеле изолированное 12,0 Ожирение, сопровождающееся патозооспермией без гипогонадизма 11,0 Ожирение с гипогонадизмом 9,0 Обструкция семявыносящих путей 6,0 Носительство урогенитальных инфекций 5,0 Гиперпролактинемия 5,0 Урогенитальные инфекции в сочетании с заболеваниями орхо-эпидидимо-простатовезикулярного комплекса и гипогонадизмом 3,0 Ретроградная эякуляция при СД 3,0 Урогенитальные инфекции в сочетании с заболеваниями орхо-эпидидимо-простатовезикулярного комплекса с носительством антиспермальных антител 2,0 Урогенитальные инфекции в сочетании с варикоцеле 2,0 Гиперпролактинемия в сочетании с гипогонадизмом 2,0 Эректильная дисфункция при СД 2,0 Носительство антиспермальных антител изолированное 2,0 Синдром Клайнфельтера с гипогонадизмом 2,0 Варикоцеле в сочетании с гипогонадизмом 2,0 Крипторхизм без исхода гипогонадизм 2,0 Вирусный паротит 1,2 46 Варикоцеле с носительством антиспермальных антител 1,0 Ожирение, гиперкортицизм в сочетании с гипогонадиз- мом 1,0 Делеции AZF 1,0 Синдром Клайнфельтера без гипогонадизма 0,6 Крипторхизм с исходом гипогонадизм 0,6 Хроническая почечная недостаточность 0,6 Травмы половых органов без исхода гипогонадизм 0,6 Последствия комбинирванного лечения семиномы 0,6 Урогенитальные инфекции в сочетании с заболеваниями орхо-эпидидимо-простатовезикулярного комплекса, ожирением, гипогонадизмом и гиперкортицизмом 0,5 Урогенитальные инфекции в сочетании с заболеваниями орхо-эпидидимо-простатовезикулярного комплекса и гиперпролактинемией 0,5 Синдром Каллмана 0,4 Гипоспадия 0,4 Травмы половых органов с исходом гипогонадизм 0,4 Последствия химиотерапии лимфомы 0,3 Цирроз печени 0,2 Последствия химиотерапии лейкоза 0,1 Причина не установлена 2,0 На основании выявленных причин мужского бесплодия можно выделить основные факторы патогенеза, таблица 5. |