Рататуй. Навчальний посібник для студентів, що навчаються у вищих навчальних закладах іii1V рівнів акредитації за напрямом Ветеринарна медицина
 Скачать 5.29 Mb.
|
|
5.4. Дихання бактерій Це один із шляхів біологічного окислення, який відбувається з утворенням молекул АТФ, тобто супроводжується нагромадженням 95 енергії. Під час цього процесу одні речовини (органічні та неорганічні сполуки) являються донорами електронів і при цьому окислюються, акцепторами електронів виступають неорганічні сполуки, які відновлюються. В одних мікроорганізмів кінцевим акцептором електронів виступає кисень, у інших - неорганічні сульфати, нітрати, карбонати. Л. Пастером було вперше помічено, що деякі мікроби одержують енергію без участі кисню. У 1863 р. він запропонував терміни "аероб" та "анаероб". Залежно від умов одержання енергії (способу дихання), прокаріоти поділяються на ряд груп. Облігатні аероби- мікроорганізми, для оптимального росту яких необхідно 21 % кисню. До них належать збудники туберкульозу, чуми, холерний вібріон та ін. Облігатні анаероби- бактерії, які ростуть при відсутності вільного молекулярного кисню, за рахунок процесів бродіння. Вони одержують кисень із органічних сполук у процесі їх метаболізму. Деякі з них не переносять навіть незначної кількості вільного кисню. Такими бактеріями є збудники правця, ботулізму, газової анаеробної інфекції, бактероїди, фузобактерії та ін. Окремі клостридії можуть бути аеротолерантними. Для культивування їх використовують спеціальні живильні середовища й апарати (анаеростати), в яких створюються анаеробні умови за рахунок поглинання кисню або заміни його індиферентними газами (азотом, воднем). Факультативні анаероби (факультативні аероби) пристосувались, залежно від умов середовища (наявності або відсутності кисню), переключати свої метаболічні процеси з використанням молекулярного кисню на бродіння та навпаки. Групу факультативних анаеробів формують численні представники родини кишкових бактерій (ешеріхії, сальмонели, шигели), стафілококи та деякі інші бактерії. Мікроаерофіли - особлива 96 група мікробів, для яких концентрація кисню при культивуванні може бути зменшена до 2 %. Вищі його концентрації здатні затримувати ріст. Ця група представлена молочнокислими, азотфіксуючими бактеріями. Капнеїчними називають такі мікроорганізми, які потребують, крім кисню, ще й до 10 % вуглекислого газу. Типовими представниками останніх є збудник бруцельозу бичачого типу. В облігатних аеробів кисень використовується як кінцевий акцептор електронів у реакціях, що каталізуються цитохромоксидазами та оксигеназами. У клітинах факультативних анаеробів також є цитохромоксидази, проте в облігатних анаеробів ферментів, які каталізують взаємодію з молекулярним киснем, немає. Детальне вивчення механізмів дихання у бактерій довело, що першими мікроорганізмами на земній кулі були анаероби, тому що до виникнення фотосинтезуючих еукаріотів вміст кисню в атмосфері був незначним порівняно із сьогоденням. За розрахунками, щоб відбулось переключення механізму бродіння на аеробне дихання, достатньо було 0,2 % кисню в атмосфері (на сьогодні його концентрація становить 21 %). У свою чергу зростання вмісту кисню призвело до зміни характеру атмосфери із відновлювальної на окисну за рахунок відповідних реакцій. В умовах безкисневої атмосфери існував дефіцит акцепторів електронів, а з появою кисню ця проблема була розв'язана. 5.5. Ріст і розмноження бактерій Будь-яка жива істота здатна до росту та розмноження. Під ростом розуміють координоване відтворення бактеріальних структур і відповідно збільшення маси мікробної клітини. Розмноження- це 97 здатність мікробів до самовідтворення, при цьому збільшується кількість особин у популяції на одиницю об'єму середовища. Розмноження бактерій - складний процес, пов'язаний із синхронною взаємодією багатьох їх структур. Починається воно з відтворення генетичного матеріалу - ДНК, яка локалізована в нуклеоїді. Спочатку відбувається реплікація (подвоєння) генетичного матеріалу напівконсервативним шляхом. Розпочинається вона з реплікативної точки на ДНК, розташованої в місці з'єднання мезосоми з цитоплазматичною мембраною. Нуклеїнова кислота деспіралізується, й нитки ДНК розходяться. Кожна з них є матрицею, на якій за принципом комплементарності синтезуються їх копії, які згодом об'єднуються у двониткову ДНК. Синтез дочірніх ниток ДНК відбувається ступенево, невеликими фрагментами по 1-2 тис нуклеотидів, які пізніше зшиваються ферментом лігазою. Залежно від умов, реплікація може тривати 20-40 хвилин. Паралельно з реплікацією починається утворення поперечної перегородки за рахунок цитоплазматичної мембрани. Потім вона оточується пептидогліканом. Під час реплікації та утворення перегородки клітина росте, синтезуються біополімери, з яких складатимуться цитоплазматична мембрана, рибосоми, цитоплазма. Клітини відділяються одна від іншої, а в грамнегативних мікробів синтезується додатково зовнішня мембрана. Якщо клітини зберігають зв'язки, утворюються ланцюги з кокоподібних чи паличкоподібних форм. Як правило, бактерії розмножуються простим поділом, що відбувається в різних площинах. Це сприяє, зокрема, утворенню різних морфологічних типів кокоподібних мікроорганізмів - диплококів, стафілококів, тетракоків, сарцин. Актиноміцети можуть 98 розмножуватись шляхом фрагментації ниткоподібних клітин, брунькуванням. Можливе утворення клітин, подібних до спор, конідій. Облігатні внутрішньоклітинні паразити - хламідії - розмножуються, проходячи ряд стадій: елементарні тільця, ініціальні тільця, проміжні тільця. Саме останні є тим джерелом, з якого формується нове покоління елементарних тілець. Тривалість циклу складає 40-48 годин. Мікоплазми також можуть утворювати особливі елементарні тіла, що здатні до розмноження фрагментацією або брунькуванням. Однак вони можуть розмножуватись і простим бінарним поділом. Швидкість розмноження бактерій залежить від багатьох факторів: віку культури, складу живильного середовища, його рН, окисно-відновного потенціалу, температури, аерації тощо. Бактерії розмножуються у геометричній прогресії. Якщо вважати, що за оптимальних умов бактерія подвоюється кожні 30 хвилин, то за годину їх буде 4, через дві години - 16, через 4 - 256, через 15 - мільйони. Через 35 год їх об'єм становитиме до 1000 м 3 , а маса – понад 400 т. При внесенні у живильне середовище бактерії розмножуються за певними закономірностями. Вони ростуть і розмножуються, досягаючи певного максимуму до того часу, поки не будуть вичерпані запаси живильних речовин. Якщо не видаляти кінцеві продукти обміну і не додавати необхідні речовини, то можна одержати періодичну культуру (популяція в обмеженому просторі). Мікроорганізми в такій культурі поводять себе як багатоклітинні системи з генетично обмеженим ростом. 99 Крива, яка описує залежність логарифму числа живих клітин від часу культивування, називається кривою росту. Розрізняють чотири основні фази росту періодичної культури: початкову ( лагфаза),експоненціальну (логарифмічна), стаціонарну та відмирання. Початкова або лаг-фаза охоплює проміжок між інокуляцією бактерій і досягненням найвищої швидкості їх поділу. В цей період відбувається адаптація бактерій до умов існування. В клітині у 8-12 разів зростає кількість РНК, збільшується концентрація ферментів. Тривалість фази 1-2 год. Експоненціальна (логарифмічна) фаза характеризується постійною максимальною швидкістю поділу клітин і зростанням їх кількості у геометричній прогресії. Вона залежить від віку мікробів і складу середовища. Так, ентеробактерії діляться кожні 15-30 хв, стрептококи - 30 хв, а ґрунтові нітробактерії й збудники туберкульозу - 5-18 год. Час, протягом якого відбувається поділ мікроба, називається часом генерації. Стаціонарна фаза наступає тоді, коли число клітин перестає збільшуватись. Настає рівновага між кількістю живих мікробів і тих, що відмирають. Цьому сприяє висока щільність популяції, дефіцит живильних речовин у середовищі, низький парціальний тиск кисню, накопичення токсичних продуктів обміну. Однак кількість біомаси в цей період сягає найвищого рівня, тому концентрацію клітин позначають як максимальну(М-) концентрацію, а величину біомаси - терміном вихід або урожай.Ця ознака є специфічною й характерною для кожного виду бактерій. Триває фаза 6-7 год. Фаза відмирання супроводжується різким зменшенням числа живих клітин. Цьому сприяють значний дефіцит поживних речовин у 100 середовищі, нагромадження кислот, автоліз під впливом власних ферментів. Отже, у періодичній культурі умови культивування весь час змінюються: густина мікробів зростає, а запаси живильних речовин зменшуються. Однак у багатьох випадках необхідно підтримувати клітини у фазі експоненціального росту та М-концентрації, тому що саме в цей період вони найбільш фізіологічно і функціонально активні: синтезують багато білка, продукують велику кількість різноманітних ферментів, токсинів, антибіотиків, інших біологічно активних речовин. Це досягається постійним виділенням популяцій бактерій, що ростуть, оновленням живильного середовища, додатковою аерацією (для аеробних бактерій). Саме за такими принципами працюють хемостати і турбідостати - прилади, які дозволяють проводити безперервне культивування у промислових і лабораторних умовах. Ріст мікробів на твердих живильних середовищах відбувається за аналогічними закономірностями, однак щільність клітин значно вища. 5.6. Культивування бактерій Для вирощування бактерій у лабораторних умовах, дослідження їх різноманітних властивостей, тривалого зберігання використовують живильні середовища. Вони повинні відповідати певним стандартам, створюючи оптимальні умови для росту, розмноження й життєдіяльності мікроорганізмів. В першу чергу бактерії потребують азоту, вуглецю та водню для побудови власних білків. Водень і кисень для клітин постачає вода. Джерелом азоту виступають численні речовини, в основному, тваринного 101 походження (м'ясо яловиче, риба, м'ясо-кісткове борошно, казеїн), а також білкові гідролізати, пептиди, пептони. Можна використовувати й замінники м'яса - плаценту, кров'яні згустки, дріжджі. Отже, до складу середовищ повинні бути введені джерела живильних речовин і води, а також ростові фактори (вітаміни, ферменти). Універсальним джерелом їх є екстракти з білків тваринного й рослинного походження, білкові гідролізати. Для мікробів з більш складними харчовими потребами до складу середовищ включають нативні субстрати - кров, сироватку, асцитичну рідину, яєчний жовток, кусочки печінки, нирок, мозкової тканини та ін. Середовища повинні бути збалансованими за мікроелементним складом і містити іони заліза, міді, марганцю, цинку, кальцію, натрію, калію, мати у своєму складі неорганічні фосфати. Допустимим є вживання речовин, які усувають дію інгібіторів росту і токсиноутворення мікробів (окремі амінокислоти, твіни, активоване вугілля тощо). Важливим є стабілізація оптимуму рН середовища, його буферності. Середовища повинні мати певну в'язкість, густину (рідкі, напіврідкі, щільні), бути ізотонічними, прозорими й обов'язково стерильними. Численні потреби мікроорганізмів зумовлюють велике розмаїття живильних середовищ, а для окремих видів бактерій існують спеціальні середовища. Частину їх готують у лабораторіях безпосередньо перед посівом, але з кожним роком з’являються все нові середовища заводського виготовлення (сухі), які здатні задовільнити найвибагливіші потреби мікробіологів. Вони зберігаються тривалий час, мають стандартний склад. Залежно від густини, середовища поділяються на рідкі, напіврідкій щільні. Напіврідкі та щільні середовища готують з рідких, 102 додаючи відповідно 0,3-0,7% та 1,5-2,0% агару. Останній представляє собою волокнистий матеріал, який добувають з морських водоростей. Складається він з полісахаридів (70-75 %) та білків (2-3%) . При 100 0 С агар розчиняється (розплавляється) уводі а, застигаючи при 42 -46 0 С, в разі достатньої концентрації (близько 2%), обумовлює щільність середовища. Саме за цю властивть він набув широкого розповсюдження у мікробіологічній практиці. Для створення щільних середовищ використовують також желатин (10-15 %), згорнуту сироватку крові. Середовища поділяються на природні та штучні. Як природні використовують згорнуту сироватку, молоко, яйця, м’язову тканину. Штучні середовища створюють шляхом комбінування різноманітних субстратів, що забезпечують ті чи інші потреби мікроорганізмів. Залежно від потреб бактеріологів існуючі живильні середовища поділяються на чотири основні групи. Перша група – універсальні (прості) середовища. До них належать прості середовища: м’ясо – пептонний бульйон (МПБ) та м’ясо – пептонний агар (МПА). Вони придатні для культивування багатьох видів бактерій. Друга група – спеціальні середовища. Вони використовуються в тих випадках, коли мікроорганізми не ростуть на простих. До них належать кров'яний, сироватковий агари, сироватковий бульйон, асцитичний бульйон та асцит-агар. Третя група – селективні середовища, їх використовують для ціле-спрямованого виділення та накопичення бактерій з матеріалу, який містить багато сторонніх мікробів. Створюючи такі середовища, враховують біологічні особливості бактерій певного виду, які відрізняють їх від інших. Наприклад, елективним для холерних 103 вібріонів є 1 % лужна пептонна вода, середовища Ру та Леффлера – для збудників дифтерії, середовище Плоскирева – для дизентерійних паличок. Гарний ріст стафілококів спостерігаєтся на середовищах, у складі яких є до 10 % хлориду натрію. Мікрококи та коринебактерії ростуть на агарі, що містить фуразолідон. Додавання антибіотиків до складу живильних середовищ робить їх елективними відносно антибіотикостійких штамів. Четверта група – диференціально-діагностичні середовища. Це середовища, які дозволяють визначити певні біохімічні властивості мікроорганізмів і здійснювати їх первинну диференціацію. Вони поділяються на середовища для визначення протеолітичних, пептолітичних, цукролітичних, гемолітичних, ліполітичних, редукуючих властивостей тощо. На поверхні щільного живильного середовища мікроорганізми можуть утворювати суцільний, густий ріст або ізольовані колонії. Колонія - це видимі неозброєним оком скупчення бактерій на поверхні або в товщі живильного середовища. Як правило, кожна колонія формується з нащадків однієї мікробної клітини (клон), тому їх склад досить однорідний. Утворення її є проявом культуральних властивостей бактерій. Характеристика колоній - важлива складова частина роботи бактеріолога а, адже мікроорганізмам кожного виду притаманні свої особливі колонії (рис. 3.2). Характеризувати колонії можна за різним ознаками. За розміром(діаметром) вони поділяються на великі (4-6 мм і більше), середні (2-4 мм), дрібні (1- 2 мм), карликові або точкові (менше 1 мм). Форма колоній може бути найрізноманітнішою: правильно кругла, неправильна (амебоподібна), ризоїдна. Вони бувають прозорими, напівпрозорими, непрозорими - мутними. За рельєфом і контуром 104 форми у вертикальному розрізі колонії поділяються на плоскі, опуклі, куполоподібні, каплеподібні, конусоподібні, плоскоопуклі, плоскі, що стеляться по поверхні середовища, із вдавленим центром, з припіднятою у вигляді соска серединою. Поверхню колоній вивчають спочатку неозброєним оком, а потім за допомогою лупи чи малого збільшення мікроскопа. Вона може бути матовою або блискучою, з глянцем, сухою або вологою, гладенькою або шорсткою. Гладенькі колонії позначають як S-форми (smooth - гладенький), а шорсткі - R-форми (rough - шорсткий, нерівний). Форма шорстких поверхонь також може бути різноманітною: зморшкуватою, бородавчастою, мати радіальну посмугованість тощо. Переважна більшість мікроорганізмів утворює безбарвні колонії або мутно-молочного кольору. Однак деякі з них формують кольорові колонії, їх колір визначається пігментом, який синтезують бактерії: білі, кремові, жовті, золотисті, сині, червоні тощо. Структуру колоній досліджують у прохідному світлі при малому збільшенні мікроскопа. Вони можуть бути зернисті, ниткоподібні і волокнисті, які характеризуються наявністю переплетених ниток у товщі колоній. При доторканні до колонії петлею можна визначити її консистенцію: пастоподібна, в'язка або слизова, суха, крихка тощо. На рідких живильних середовищах бактерії також можуть рости по-різному, хоча особливості проявів росту бідніші, ніж на щільних. Бактерії здатні викликати дифузне помутніння середовища, колір його при цьому може не змінюватись або набувати кольору пігменту. Такий характер росту найчастіше спостерігається у більшості факультативно-анаеробних мікроорганізмів. Деколи відбувається утворення осаду на дні пробірки. Він може бути крихтоподібним, гомогенним, в'язким, слизистим та ін. Якщо мікроби пігменту не утворюють, осад має сірувато-білий або 105 жовтуватий колір. Подібним чином ростуть, як правило, анаеробні бактерії. Пристінковий ріст проявляється утворенням пластівців, зерен, прикріплених до внутрішніх стінок пробірки. Середовище при цьому залишається прозорим. Аеробні бактерії мають тенденцію до поверхневого росту. Часто утворюється ніжна безбарвна або голубувата плівка у вигляді ледь помітного нальоту на поверхні, яка зникає при струшуванні або збовтуванні середовища. Плівка може бути волога, товста, мати в'язку, слизову консистенцію та прилипати до петлі, тягнучись за нею. Однак, зустрічається й щільна, суха, крихка плівка, колір якої залежить від пігменту, що виробляється мікроорганізмами. 5.7. Утворення мікроорганізмами пігментів та ароматичних речовин. Світіння мікробів Пігменти мікробів. Наявність пігментів у мікроорганізмів генетикно детермінована і передається по спадовості. Багато кольорових бактерій знаходиться в повітрі. Вважають, що пігменти виконують захисну функцію проти згубної дії на мікроорганізми ультрафіолетового випромінювання. Забарвлені колонії у кисневому середовищі та при освітленні зберігаються краще, ніж безпігментні. Більшість пігментоутворюючих мікробів — сапрофіти. Першим пігментом, відомим людству, був криваво-червоного кольору продигіозин, який утворює чудова паличка (Bact. prodigiosum). Синій пігмент піоціанін продукує Pseudomonas aeruginosa, фіолетовий — Chromobacterium violaccum. Ці види бактерій характеризуються антибіотичною активністю. Вони нерідко забруднюють рани, забарвлюючи гній у синьо-зелений колір. Жовтий пігмент утворюють сарцини, стафілококи; чорний (меланіни) — деякі види дріжджів та міцеліальних грибів 106 Stachybotrys alternans тощо. Важливою групою мікробних пігментів є каротиноїди, які утворюють більшість фототрофних бактерій, деякі родини дріжджів, мікроміцетів та актиноміцетів. У фототрофів каротиноїди беруть участь у процесах фотосинтезу. У гетеротрофів вони локалізуються в цитоплазматичній мембрані. У гіфоміцетів каротиноїди зв'язані, головним чином, з ліпідами. |