Рататуй. Навчальний посібник для студентів, що навчаються у вищих навчальних закладах іii1V рівнів акредитації за напрямом Ветеринарна медицина
 Скачать 5.29 Mb.
|
|
Ароматичні речовини мікробів. Деякі види дріжджів, плісеневих грибів та актиноміцетів продукують ароматичні речовини — складні ефіри, легкі органічні кислоти та ін. Їх використовують для надання приємного запаху винам та деяким харчовим продуктам, особливо сиру, сметані та маслу. Грибний, хлібний, медовий, тютюновий та інші аромати властиві грибам багатьох видів. Це може бути таксономічною ознакою при ідентифікації видів. Світіння мікробів. Окремі мікроорганізми мають здатність до світіння — фосфоресценції. Вони поширені в природі і зумовлюють світіння, наприклад, трухлявого дерева, риби, м'ясних туш, морської води та інших об'єктів навколишнього середовища. Світіння бактерій — своєрідна форма звільнення енергії при окислювальних процесах, що відбуваються в клітині, їх неможливо спостерігати в анаеробних умовах. Випромінювати фосфоричне світло, зокрема, здатні мікроби — жителі морів та океанів. Світіння особливо помітне при коливанні морських хвиль. Серед фотобактерій не виявлено патогенних видів. 6.ГЕНЕТИКА МІКРООРГАНІЗМІВ 107 Генетика вивчає механізми спадковості та мінливості живих істот. Вона започаткована блискучими експериментами Грегора Менделя в 60-х роках позаминулого століття. Народження генетики бактерій як науки відбулось у 1943 р., коли С.Лурія описав мутації стійкості у відношенні до бактеріофагів. Проте існує і інша думка з цього приводу. Ряд дослідників вважають, що датою народження генетики мікроорганізмів слід вважати 1940 р., коли Г.Бідл і Е.Таум індукували мутації у Neurospora crassa і здійснили генетичний аналіз. 6.1. Організація генетичного матеріалу у бактерій . Генетичний матеріал у бактерій, так же як і у еукаріотів, представлений дволанцюговою молекулою дезоксирибонуклеїнової кислоти, проте , на відміну від останніх, розміщена не у диференційованому ядрі, а в прототипі ядра – нуклеоїді. Нуклеоїд – відносно компактний утвір, знаходиться переважно у центральній частині клітини, на відміну від ядра еукариотів він не має оболонки, безпосередньо контактує з цитоплазмою. ДНК бактерій прийнято називати хромосомою. Величина геному у різних видів бактерій варіює в межах 0,8 – 8 х 10 6 пар основ. У мікробній клітині міститься один геном. Проте під час росту і ділення клітин виявляють їх більше. Так, у Eschericyia coli виявляють- від 2 до 8, у Azotobacter chroococcum - від 20 до 25 геномів. До структури ДНК входять пуринові (аденін, гуанін) та піримідинові (тимін, цитозин) нуклеїнові основи - гетероциклічні азотисті сполуки, цукор дезоксирибоза та залишок фосфорної кислоти. Кількість аденінових основ така ж як і тимінових, а гуанінових міститься стільки ж як і цитозинових. 108 Хромосома у функціональному відношенні поділяється на фрагменти, які називаються генами,що несуть генетичну інформацію і виконують роль структур , які детермінують спадкові ознаки . Ген - елементарна одиниця спадковості, що контролює синтез специфічного поліпептидного ланцюга (структурний ген) або діяльність структурних генів (ген-регулятор, ген-оператор). Генетичний код у мікроорганізмів такий же як і код у еукаріотів – триплетний. Кожний триплет (кодон) - три , розташовані поряд, нуклеїнові основи , кодуює одну амінокислоту. Гени, що відповідають за синтез сполуки, позначають рядковими літерами латинського алфавіту, які відповідають назві сполуки. Наприклад, his + - гістидиновий ген, leu + - лейциновий ген. Гени, що контролюють резистентність до антибіотиків, інших препаратів, позначаються літерою r (resistance - стійкість). Чутливі до препаратів бактерії позначаються літерою s (sensitive - чутливий). Існує певний механізм, за допомогою якого послідовність нуклеотидів у гені визначає послідовність амінокислот у білку (рис. 7.1, 7.2). Спочатку ДНК клітини деспіралізується, і на одній із її ниток, як на матриці, фермент ДНК-залежна РНК-полімераз за принципом комплементарності формує полірибонуклеотидний ланцюг – інформаційну (матричну) РНК (іРНК, мРНК). Ця стадія синтезу білка називається транскрипція(transcriptio - переписую). Інформаційна РНК транспортується в цитоплазму , де розміщені рибосоми. Розпочинаєтся наступний етап - трансляція (translatio - перенесення). На цьому етапі відбувається синтез поліпептидних ланцюгів. 109 У цитоплазмі мікробних клітин так же як і у еукаріотів є особливі нуклеїнові кислоти, які називаються транспортними РНК (тРНК). На одному з кінців вони мають триплет нуклеотидів (антикодон), а на іншому – місце для з'єднання з відповідною амінокислотою (кодон). Вони доставляють необхідну амінокислоту до рибосоми з іРНК ,де розпочинається синтез та відбувається елонгація (elongatio - подовження) поліпептидного ланцюга. Після завершення синтезу білкової молекули, вона за допомогою фермента звільняється та піддається певній модифікації (посттрансляційні перетворення білкових молекул). Процес реплікації нуклеїнових кислот у мікроорганізмів відбувається за напівконсервативним механізмом. Полінуклеотидні ланцюги подвійної спіралі ДНК «розплітаються» , внаслідок чого утворюються дві нові спіралі, кожна з яких складеться із старого і зановосинтезованого ланцюга. Генетичні дослідження також показали, що певні властивості мікробів зумовлені в першу чергу ферментами. Це положення стало базою теорії «один ген — один фермент», яка стверджує, що кожний ген відповідає за утворення специфічного ферменту, тобто кожний ген контролює лише одну хімічну реакцію, що каталізується відповідним ферментом. У бактеріальній хромосомі всі гени розташовані в лінійній послідовності в певних ділянках ДНК, що називаються локусами. Окрім хромосомної ДНК у багатьох бактерій виявляють також позахромосомну ДНК у вигляді плазмід (епісом). Плазміди- кільцеві молекули ДНК молекулярною масою до 10 6 -10 8 Дальтон з 1,5-400 тис пар основ. Вони можуть існувати в цитоплазмі у вільному стані або бути інтегрованими з клітинною хромосомою. Тоді їх називають 110 епісомами. Плазміди містять у своєму складі tra-оперон (transfer - перенос), який забезпечує їх здатність до передачі, і гени, які кодують якусь ознаку, їх називають трансмісивними,якщо вони самостійно передаються іншим клітинам за допомогою кон'югації, і нетрансмісивними, коли не мають власного апарату передачі, а переносяться разом з трансмісивними або під час трансдукції. Вони можуть існувати в клітині у декількох копіях. Плазміди виконують регуляторну та кодуючу функції. Регуляторний ефект їх полягає в здатності представляти власні реплікони при порушенні функціонування клітинних генів; кодуюча роль - у внесенні в клітину нових ознак, які надають їй певних переваг при взаємодії зорганізмом хазяїна. Нині відомо десятки різноманітних плазмід. Серед них найдетальніше вивчено плазміди F, Col, R, Ent, Hly, бактеріоциногенності, біодеградації. Плазміди F забезпечують перенос бактеріальної хромосоми при кон'югації. R- плазміди є факторами множинної резистентності до лікарських засобів. Вони кодують стійкість до 10 антибіотиків та солей важких металів (Ni, Cu, Hg). Col-плазміди забезпечують синтез коліцинів - білків з летальною активністю проти коліформних мікроорганізмів. Hly-плазміди зумовлюють утворення гемолізинів у золотистих стафілококів. Ent-плазміди забезпечують ентеротоксигенну активність штамів кишкової палички. Плазміди біодеградації надають мікроорганізмам здатність утилізувати незвичні субстрати: Cam- плазміда - камфору, Oct-плазміда - октану тощо. Плазміди не мають вирішального значення для забезпечення існування бактерійних клітин, однак відіграють чи не найважливішу роль у створенні розмаїття генетичного матеріалу , детермінують 111 синтез факторів патогенності, резистентності до лікарських засобів та ін. Повний набір генів мікробної клітини становить їїгенотип . Прояв генетично детермінованих ознак при різних обставинах може відрізнятись . У таких випадках йдеться про фенотип мікроорганізму. Нерідко можна зустріти аналогічні за генотипом , але помітно відмінні за фенотипом мікроорганізми.. Фенотип- індивідуальний вияв генотипу в конкретних умовах існування. Протягом багатьох століть панувала думка, що кожний вид мікробів є незмінним і його морфологічні ознаки залишаються постійними. Прихильниками такого вчення, яке дістало назву мономорфізму, були Р. Кох і Ф. Кон, а також їхні послідовники. Вони вважали, що зміни морфологокультуральних ознак, які виникають у окремих мікроорганізмів під впливом умов існування, є тимчасовими і не можуть похитнути основних положень вчення мономорфістів. Але досвід багатьох вчених про зміни морфології та фізіологічних властивостей мікробів призвів до іншої крайності — появи нової концепції плеоморфізму, яка noлягає у визнанні можливостей різних перетворень мікроорганізмів, включаючи перехід одного виду в інший.Плеоморфісти — К. Негелі, Т. Більрот та ін. повністю заперечували постійність морфологічних та біохімічних властивостей мікробів. Наприклад, К. Негелі та його школа зовсім не визнавали специфічності виду у мікроорганізмів. Подальші досягнення в галузі мікробіології показали помилковість обох теорій, їх метафізичність. До таких же висновків привела й висунута закордонними вченими гіпотеза про циклічність розвитку мікробів, згідно з якою властивості окремих видів 112 мікроорганізмів змінюються начебто по замкненому колу, проходячи через ряд етапів, після чого мікробна клітина повертається у початковий стан. Таким чином, циклогеністи заперечували еволюцію мікросвіту і відповідно еволюційну теорію Ч. Дарвіна, яка пояснювала шляхи і причини удосконалення живих організмів під впливом природного добору. Засновники вітчизняної мікробіологічної науки І. І. Мечников, Л.С. Ценковський, С.М. Виноградський та інші вчені підходили до вивчення мінливості мікроорганізмів з дарвінівських позицій. Так, І. І. Мечников з цього приводу писав: «Тільки в галузі мікробіології доведена можливість зміни природи бактерій шляхом зміни зовнішніх умов, причому можна було добитися стійких змін, що передаються за спадковістю». Встановлено, що мікроорганізми здатні до втрати вірулентності при збереженні агентних властивостей, набувати стійкості до антибіотиків, збільшувати синтез певних продуктів життєдіяльності, змінювати морфологічні, культуральні та біохімічні ознаки. Морфологічні зміни у старих мікробних клітин спостерігав М. Ф. Гамалія, який назвав це явище гетероморфізмом. Відомо, що температура, хімічні речовини, в тому числі антибіотики, антисептики, пестициди та інші екологічні фактори викликають зміни морфології мікробів. Наприклад, кишкова паличка під впливом пеніциліну може набувати кулястої форми, утворювати вирости або ризоїди. Мінливістю називають здатність організмів змінювати свої властивості відповідно до зміни умов навколишнього середовища. 113 6.2.Форми мінливості мікробів Прояв мінливості мікробів різнобічний. Відомо, що у багатьох видів мікробів існують різні варіанти, раси, типи та ін., які відрізняються поміж собою за рядом ознак. Якщо набуті ознаки носять тимчасовий характер, вони спадково не закріплюються нащадками і зберігаються доти , поки діє фактор, що спричинив їх (фенотипова - неспадкова мінливість). Наприклад, мікроби- збудники сибірки при температурі 42,5°С і вище припиняють спороутворення, але повернення до умов звичайного температурного режиму (37°С) веде до поновлення здатності бацил утворювати спори. Інший приклад: обробка бактерій із джгутиками фенолом припиняє процес джгутикування. Однак у нового покоління безджгутикових мікробів ,за умов вирощування їх на вільних від згаданого компоненту субстратах , утворюються нормальні джгутики. Такі форми мінливості називаються модифікаціями. У мікробній клітині можуть з»являтись нові ознаки, які спадково закріплюються в новому поколінні — це генотипова - спадкова мінливість. Механізм генотипової мінливості мікробів може бути у вигляді мутацій та генетичних рекомбінацій. Основними видами спадкової мінливості є адаптація, дисоціація, мутація, трансформація, трансдукці та ко н'югація (рис. 7.3). Адаптація — пристосування мікробів до нових умов існування під впливом фізичних, хімічних, біологічних і антропогенних факторів. Набуті мікробами властивості закріплюються спадково. Наприклад, окремі клітини в популяціях золотистого стафілокока набувають стійкості до певних концентрацій пеніциліну і спадково передають цю властивість нащадкам, які за допомогою адаптивних 114 ферментів (у даному випадку пеніцилінази) інактивують антибіотик. При цьому спостерігають морфологічні зміни клітин (кулясті клітини стають паличкоподібними). Дисоціація— один із видів культуральної мінливості мікробів, що спричинюється змінами складу живильного середовища. Відомо ,що бактерії можуть утворювати на живильному середовищі різні типи колоній: тип S (англ.— smooth — гладенький) — гладенькі, прозорі, з рівними краями,і тип R (англ, rough — шорсткий) — сухі, непрозорі, з шорсткою і борознистою поверхнею, контурами неправильної форми і нерівномірними зазубреними краями. Між ними існують перехідні форми, нестійкі типи, які позначають літерами Оі М (відповідно проміжні і слизові). Такі культури відрізняються за морфологічними, фізіологічними, антигенними та вірулентними властивостями. У більшості патогенних мікробів тип S вірулентніший, ніж тип R. Збудник сибірки є винятком: у нього R - форми більш вірулентні ніж S-форми. Можливий перехід типу S в тип R. Зворотній перехід спостерігається дуже рідко. Мутація— це стійкі спадкові зміни властивостей у мікробів, обумовлені змінами у її ДНК. Нові варіанти мікробів, що виникають в результаті мутацій, називають мутантами. Вони спадково зберігають набуті морфологічні, культуральні чи інші властивості оскільки у них змінений генотип.Мутації можуть утворюватись в результаті випадіння певних нуклеотидів у ДНК клітини (делеції), переміщення їх у молекулі нуклеїнової кислоти (інверсія). Якщо зміни торкаються лише однієї пари нуклеотидів, такі мутації називають крапковими, якщо вини охоплюють обширні ділянки ДНК - хромосомними. Мутації можуть бути спонтанними та індукованими. 115 Спонтанні мутації відбуваються без будь -якого свідомого впливу на мікроорганізм. Вони можуть обумовити зміну любої ознаки (ферментативної активності, чутливості до антибіотиків тощо) мікробної клітини. Спонтанні мутації є основним механізмом еволюції мікробів. Природа селекціонує мутанти з найбільш адекватними властивостями, що забезпечують їх ріст і розмноження. Частота появи мутатів у мікробній популяції мізерна – в середньому 1 мутант на 1 000 000 мікробних клітин протягом однієї генерації, проте може бути і значно вищою. Індуковані мутації виникають в результаті свідомого застосування впливу на мікробну популяцію різноманітних факторів, що отримали назву мутагенів. Мутагени поділяють на фізичні, хімічні, біологічні. До фізичних відносять променисту енергію і ультрафіолетові промені, рентгенівське, альфа-, бета-, гамма- випромінювання; до хімічних—сильнодіючі речовини: отрути (іприт), лікувальні засоби (йод, камфору, перекис водню), кислоти (азотисту), до біологічних – віруси бактерій. Мутагенні фактори застосовують з метою одержання мікроорганізмів з корисними властивостями – вакцинних штамів, продуцентів вітамінів, амінокислот, антибіотиків тощо. 6.4. Генетичні рекомбінації. Генетичні рекомбінації- це обмін генетичним матеріалом (ділянками ДНК) між клітинами бактерій різних варіантів у межах одного виду. Рекомбінанти, що при цьому виникають, успадковують деякі ознаки обох "батьківських" клітин. Генетичні рекомбінації 116 створюють невичерпне джерело різноманітних комбінацій генів, які природа використовує в процесі еволюції. Вважається, що здатність клітин до рекомбінацій детермінується особливими гесгенами (recombination - рекомбінація). Виділяють три основні види генетичних рекомбінацій: трансформація, трансдукція та кон'югація. Трансформація — передача певних властивостей одного мікроба (донора) іншому (реципієнту) шляхом перенесення ділянок ДНК. В результаті трансформовані клітини можуть набувати нових ознак (здатність до утворення капсул, стійкість до антибіотиків тощо). Вперше на явище трансформації звернув увагу Ф. Гриффітс у 1928 p., вивчаючи пневмококи (Streptococcus pneumoniae), які утворюють капсулу в організмі, а на агарі ростуть у вигляді гладеньких (S-форма) колоній. При введенні білим мишам вбитих нагріванням вірулентних капсульних пневмококів III типу разом із авірулентними безкапсульними пневмококами II типу (R-форма) лабораторні тварини через декілька днів гинули, а з їх крові висівались живі капсульні пневмококи II серотипу. Тобто було встановлено, що авірулентний штам перетворився у вірулентний завдяки тому , що набув здатності утворювати капсулу. І ця ознака передавалась спадково (рис.7.4). У 1944 р. О. Евері, К. Маклеод та М. Маккарті змоделювали цей феномен in vitro. Вони, виділили та очистили трансформуючий агент. Ним виявилась молекула ДНК. Трансформація відбувається тільки в тих клітинах, які здатні до неї. Такий стан визначається поняттям компетентності, природа якої остаточно не з'ясована. Вважається, що вона зумовлюється наявністю особливого білка - компонента клітинної мембрани, здатного 117 розщеплювати деякі структурні елементи клітинної поверхні. Таким чином, вивільняються рецепторні ділянки, з якими взаємодіє ДНК. Стан компетентності формується на певних стадіях розвитку бактеріальної клітини. Механізм явища трансформації полягає в тому, що спочатку на поверхні клітини-реципієнта адсорбується невеликий фрагмент двониткової ДНК (1/250-1/500 частина хромосоми клітини-донора). Згодом він проникає всередину клітини, де одна нитка ДНК перетравлюється ендонуклеазами, а інша - вмонтовується у клітинну хромосому. Настає остання фаза процесу - експресія рекомбінантів. Такий процес інтеграції відбувається дуже швидко. Для появи рекомбінантів достатньо п'яти-десятихвилинного контакту клітини- реципієнта з донорською ДНК, а сам процес завершується за 2 год. Здатність до трансформації виявлено у багатьох мікроорганізмів - представників родів Bacillus, Neisseria, Haemophilias, Staphylococcus, Escherichia тa інших. За допомогою трансформації у бактерій можна підвищити вірулентність, надати їм резистентності до лікарських засобів чи навпаки – підвищити чутливість та ін.. Трансдукція– це процес переносу генетичного матеріалу від клітини донора до клітини – реципієнта за участю бактеріофага, тобто фаг відіграє роль "гамети", переносячи в реципієнтну клітину фрагмент ДНК клітини-донора. Явище трансдукції було відкрито у 1952 р. Н. Ціндером і Д. Ледербергом, які, вивчаючи процес кон'югації між різними штамами сальмонел, звернули увагу, що іноді обмін генетичним матеріалом відбувається не в результаті кон'югації, а внаслідок вивільнення з батьківських штамів помірного бактеріофага 118 Трансдукція часто спостерігається у ентеробактерій, псевдомонад, стафілококів та бацил. Розрізняють три типи трансдукції: загальну (неспецифічну), специфічну і абортивну. При загальній транcдукції відбувається передача одної або кількох ознак одночасно від клітин-донорів до клітин-реципієнтів за участю помірних трансдукуючих фагів. Фаг та діянка ДНК клітини- донора інтегруть з геномом клітини-реципієнта. Специфічна трансдукція характеризується здатністю бактеріофагів переносити лише певні гени від бактерії-донора, які локалізуються по обидва боки від місця інтеграції фага в геном клітини. При абортивній трансдукції фагова ДНК та гени бактерії-донора не інтегруються в хромосому реципієнта, а залишаються в цитоплазмі. Під час поділу клітини вони передаються тільки одній з дочірніх клітин, а згодом просто елімінуються з неї. Кон'югація — статевий процес, при якому батьківські клітини з'єднуються за допомогою кон'югаційних містків, через які відбувається обмін генетичним матеріалом. Кон'югація досліджувалася у різних родів бактерій (Escherichia, Shigella, Salmonella, Pseudomonas), особливо досконало вона вивчена у кишкової палички (Е. соlі). Статевий фактор F (англ. fertititi — плідність), який являє собою фрагмент ДНК, обумовлює утворення на поверхні клітини однієї чи двох так званих статевих фімбрій, або пілі,які беруть участь у кон'югації. Вважають, що статевий фактор знаходиться в цитоплазмі автономно, тобто не в бактеріальній хромосомі, а входить до складу епісом, або плазмід. Через статеві фімбрії, або пілі, хромосома (або її частина) передається від донорів F + (чоловічі особини) до реципієнтів 119 F - (жіночі особини). Клітина, яка отримала кон'югативну плазміду F, набуває здатності синтезувати статеві ворсинки на поверхні, отже, може сама вступати в кон'югацію. Частота цьогопроцесу – 10 -6 –10 -8 В деяких випадках F-плазміда здатна інтегрувати з хромосомою. Якщо така інтеграція стабільна, утворюється клон клітин, у якому всі бактерії здатні вступати в кон'югацію з досить високою частотою – 10 - 1 -10 -4 . Такий штам називають штамом Hfr (high frequency of recombination - висока частота рекомбінацій). На відміну від F + -клітин в Hfr-донорах F-фактор інтегрований з хромосомою бактерій. Коли такі клітини вступають у кон'югацію з F - -штамами, до них передається тільки одна нитка ДНК. Триває процес 60-90 хвилин, а швидкість переносу становить до 5·10 4 пар нуклеїнових основ за одну хвилину. Таким чином, у клітині-реципієнті експресується власний геном та частина генома донора. Деколи в клітинах Hfr може відбуватись відщеплення F-фактора і він переходить в автономне існування в цитоплазмі, захопивши з собою сегменти хромосоми клітини-господаря. Такий F-фактор називається F-генота, а клітина, що його несе, клітиною F'. В її хромосомі є дефект, відповідний втраченому фрагменту. Таким чином, від бактерії до бактерії можна перенести різноманітні властивості донорського штаму. Крім того, перериваючи процес кон'югації через певні проміжки часу і вивчаючи нові властивості, які набула клітина-реципієнт, можна визначити локалізацію генів на хромосомі, тобто провести її картування. Кон'югувати можуть штами не тільки одного, але й різних видів. Крім F -фактора, плазміди містять R-фактор (фактор резистентності), Ure-фактор (уреазний), Hli-фактор (гемолітичний) та ін. 120 У кишкових бактерій під контролем плазмід продукуються речовини білкової природи, які одержали назву коліцинів. Вони можуть адсорбуватися на поверхні чутливих клітин, пригнічувати їх метаболітичні процеси, призводячи до загибелі. Коліцини пригнічують ріст патогенних бактерій кишкової групи, можуть у такий спосіб нормалізувати біоценоз (мікробоценоз) шлунково- кишкового тракту. Плазміди широко розповсюджені і в інших видів мікроорганізмів, вони контролюють утворення бактеріоцинів— антибіотичних речовин, що бактерицидно впливають на близькі види. Таким чином, всі три форми генетичної рекомбінації (комбінативної мінливості)—трансформація, трансдукція та кон'югація — різні за формою, але однакові за своєю суттю. При трансформації ділянка ДНК клітини-донора входить до клітини- реципієнта, при трансдукції цю роль виконує фаг, при кон'югації генетична інформація переноситься через цитоплазматичний місток пілі. В залежності від нових комбінацій генетичного матеріалу в потомстві мікробів можуть виникнути рекомбінанти різного типу. |