Нивелирование влияния биологической матрицы при определении лекарственных препаратов в плазме крови методом хроматомассспектрометрии
 Скачать 2.29 Mb.
|
|
ГЛАВА II. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ II.1. Аппаратура Работа выполнялась на хромато-масс-спектрометрах: Agilent 1100 (рис.22), включающий насос (G1310A), автоматический дозатор (G1329A), термостат (G1330A) и масс-спектрометрический детектор с электрораспылительной ионизацией и квадрупольным масс-анализатором (G1946A); высокоэффективный жидкостный хроматограф Shimadzu Prominence с дегазатором (DGU-20A5), двумя градиентными насосами (LC-20AD), термостатируемым автодозатором (SIL- 20AC), соединенный с масс-спектрометром API 4000 AB Sciex с электроспрей ионизацией и тройным квадрупольным масс-анализатором (рис.22); хромато- масс-спектрометр Shimadzu с электрораспылительной ионизацией, времяпролетным масс-анализатором и ионной ловушкой. При определении аналитов использовали различные хроматографические колонки (табл.2). Рис.22. Хромато-масс-спектрометр Agilent 1100 (слева) и хроматограф Shimadzu Prominence, соединенный с масс-спектрометром API 4000 AB Sciex (справа). 62 Таблица 2. Хроматографические колонки, использованные в работе Название колонки Характеристики Аналит REPROSYL-PUR C18-AQ 100×2.0 мм, 3 мкм Цисплатин YMC-Triart C18 50×2.1 мм, 3 мкм Силденафил YMC-Pack SIL-06 150×4.6 мм; 3 мкм Циклосерин YMC-Pack SIL-06 100×2.1 мм; 5 мкм Ропинирол YMC-Pack ODS-AQ 100×2.1 мм, 5 мкм Капецитабин и 5-фторурацил При пробоподготовке плазмы крови к анализу использовали микродозаторы переменного объема Biohit mLINE; шейкер Heidolf Multi Reax; термостат BIOSAN CH-100с функцией нагрева и охлаждения (-10°С – 100°С); систему для пробоподготовки Waters (рис.23) с вакуумным насосомGAST; систему для выпаривания TurboVap LV (Calliper) (рис.24); центрифуги Eppendorf Рис.23. Система Waters для проведения процедуры сорбционного конценрирования. 63 Centrifuge 5415R и 5702R; электронные весы Ohaus Discovery DV215CD (предел допускаемой погрешности ±0,01 мг, класс точности – А). Для исследования стабильности аналитов использовали биомедицинский морозильники Sanyo (-40ºC – -18ºC и -80ºC – -60ºC). Деионизованную воду (далее «воду») получали с помощью станции очистки воды Millipore Milli Q Advantage A10. II.2. Реагенты Для приготовления подвижных фаз и проведения пробоподготовки использовали ацетонитрил (Biosolve, HPLC Grade), метанол (Merck, HPLC Grade), пропанол-2 (ВЕКТОН, х.ч.), этилацетат (ВЕКТОН, 99,7%), ацетат аммония (Sigma Рис.24. Система для выпаривания TurboVap LV. 64 Aldrich, ≥98%), формиат аммония (Sigma Aldrich, ≥99%), уксусную кислоту (Sigma-Aldrich, ≥99,7%), муравьиную кислоту (Sigma-Aldrich, 98%), трифторуксусную кислоту (Merck, for protein sequence analysis), соляную кислоту (Sigma-Aldrich, 37%), натрия диэтилдитиокарбамат (ДДТК) тригидрат (ВЕКТОН, ЧДА),гидроксид натрия(Merck, 99%), раствор гидроксида аммония (Sigma- Aldrich, 28-30%), воду, очищенную с помощью системы Milli Q Advantage A10 (далее везде «воду»), сорбционные патроны Waters Oasis HLB(30 мг, 1 мл), Sep- Pac ® Vac tC18(100 мг, 1 мл), Oasis MCX(30 мг, 1 мл), сверхсшитый полистирол Purosep 200. Определяемые аналиты. Список стандартных веществ, использованных в работе, приведен в табл. 3. Таблица 3. Стандартные вещества, использованные в работе Название Производитель Чистота Цисплатин Sigma-Aldrich 99% Цитрат силденафила Synfine research 99,7% Гидрохлорид тразодона Sigma-Aldrich 99% D-Циклосерин LKT Laboratories, Inc 99,3% Никотиновая кислота (ниацин) Sigma-Aldrich 100% Ропинирола гидрохлорид LKT Laboratories, Inc. 99% S-циталопрама оксалат Toronto Research Chemicals Inc. 99,8% Капецитабин Cayman Chemical Company 100% Капецитабин-d11 TLC PharmaChem 98% 5-фторурацил LKT Laboratories, Inc. 99,5% 5-бромурацил Toronto Research Chemicals Inc. 98% II.3. Приготовление стандартных растворов аналитов Стандартный раствор цисплатина с концентрацией 1 мг/мл готовили растворением точной навески 10 мг цисплатина в 10 мл воды и хранили при +4ºС в течение 1 месяца. Рабочие растворы цисплатина (10, 1, 0.1 мкг/мл), а также градуировочные растворы (10, 20, 50, 100, 200, 400 нг/мл) готовили ежедневно последовательным разбавлением стандартного раствора плазмой крови. 65 Индивидуальные стандартные растворы силденафила и тразодона (внутренний стандарт) с концентрациями 1 мг/мл готовили в мерных колбах вместимостью 10 мл растворением 10 мг цитрата силденафила или гидрохлорида тразодона в метаноле. Полученные растворы хранили при -25ºС. Из стандартного раствора силденафила путем последовательного разбавления плазмой крови готовили градуировочные растворы (1, 5, 10, 50, 100, 500 и 1000 нг/мл) и растворы для контроля качества QC (3, 180, 800 нг/мл). Стандартный раствор циклосерина с концентрацией 1 мг/мл готовили в стеклянной мерной колбе вместимостью 10 мл растворением навески 10 мг в 0,1M HCl. Полученный раствор стабилен при +4ºС в течение 1 месяца. Для приготовления стандартного раствора ниацина (внутренний стандарт) с концентрацией 1 мг/мл навеску 10 мг никотиновой кислоты помещали в мерную колбу вместимостью 10 мл и растворяли в метаноле. Готовый раствор стабилен при -25ºС в течение 1 месяца. Из стандартного раствора циклосерина путем последовательного разбавления плазмой крови готовили градуировочные растворы с концентрациями циклосерина 0.3, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30 мкг/мл и растворы для контроля качества QC (0.75, 7.5, 25 мкг/мл). Стандартный раствор ропинирола с концентрацией целевого вещества 0.877 мг/мл готовили в мерной колбе вместимостью 10 мл растворением точной навески гидрохлорида ропинирола (10 мг) в метаноле. Полученный раствор ропинирола хранили при -25ºС. Из стандартного раствора ропинирола готовили градуировочные растворы с концентрациями 10, 20, 50, 200, 500, 1000, 2000 пг/мл и растворы контроля качества QC с концентрациями 30, 300, 1600 пг/мл путем последовательного разбавления в плазме крови. Стандартный раствор циталопрама с концентрацией целевого вещества 0.783 мг/мл готовили в мерной колбе на 10 мл растворением точной навески оксалата S-циталопрама (10 мг) в метаноле. Полученный раствор хранили в при - 25ºС. Стандартный раствор капецитабина с концентрацией 10 мг/мл готовили в мерной колбе вместимостью 10 мл растворением точной навески 100 мг 66 капецитабина в метаноле. Стандартные растворы 5-фторурацила, 5-бромурацила, капецитабина-d11 с концентрациями 1 мг/мл готовили индивидуально в мерных колбах на 10 мл растворением точных навесок 10 мг соответствующих веществ в метаноле. Полученные стандартные растворы хранили при -25ºС в морозильной камере. Из стандартных рабочих растворов капецитабина и 5-фторурацила путем последовательного разбавления в плазме крови готовили градуировочные растворы с концентрациями капецитабина 20, 100, 500, 1200, 2000, 2800, 4000 нг/мл и 5-фторурацила 20, 40, 100, 200, 300, 500, 800 нг/мл, а также растворы образцов контроля качества с концентрациями капецитабина 30, 800, 3000 нг/мл и 5-фторурацила 50, 240, 700 нг/мл. II.4. Приготовление вспомогательных растворов Вспомогательные растворы готовили путем аккуратного смешения компонентов в определенном соотношении (табл. 4). Все полученные растворы хранили в холодильнике при +4ºС. Таблица 4. Приготовление вспомогательных растворов Наименование раствора Раствор 1 Объем раствора 1 Раствор 2 Объем раствора 2 0,2 М раствор гидроксида натрия 1М р-р NaOH 6 мл Вода 24 мл 0,1 М раствор гидроксида натрия 1М р-р NaOH 3 мл Вода 27 мл 0,04 М раствор гидроксида натрия 1М р-р NaOH 1,2 мл Вода 28,8 мл 1 М раствор муравьиной кислоты HCOOH, конц. 385 мкл Вода 9615 мкл 1 М формиатно- аммонийный буфер, рН 2.5 («Буфер 1») 1М р-р HCOOH 9 мл 1М р-р HCOONH 4 1 мл 0,1 М формиатно- «Буфер 1» 3 мл Вода 27 мл 67 аммонийный буфер, рН 2.8 («Буфер 2») 0,1 М раствор ацетата аммония 1М р-р H 3 СCOONH 4 3 мл Вода 27 мл 1 М раствор соляной кислоты HCl, конц. 4,17 мл Вода 10 мл 0,1 М раствор соляной кислоты 1 М р-р HCl 1 мл Вода 9 мл 0,07 мМ раствор соляной кислоты в метаноле 0,1 М р-р HCl 15 мкл Метанол 20985 мкл 20%-ный раствор трифторуксусной кислоты ТФУ, конц. 1 мл Вода 4 мл 2%-ный раствор уксусной кислоты в ацетонитриле H 3 CCOOH, конц. 500 мкл Ацето- нитрил 9500 мкл 30%-ный раствор метанола CH 3 OH 30 мл Вода 70 мл 50%-ный раствор ацетонитрила CH 3 CN 15 мл Вода 15 мл 5%-ый раствор гидроксида аммония в метаноле 30%-ный NH 3 ·H 2 O, (конц.) 5 мл Метанол 25 мл 5%-ый раствор гидроксида аммония в ацетонитриле 30%-ный NH 3 ·H 2 O, (конц.) 5 мл Ацето- нитрил 25 мл Раствор для перерастворения проб (при определении циклосерина) * CH 3 OH 21 мл Пропанол-2 9 мл * с добавкой 75 мкл 20%-ого р-ра ТФУ 68 Некоторые вспомогательные растворы готовили из твердых веществ путем растворения навесок в соответствующем растворителе (табл. 5). Все полученные растворы хранили в холодильнике при +4ºС. Таблица 5. Приготовление вспомогательных растворов из твердых реагентов Наименование раствора Твердое вещество Масса навески Раствори тель Объем растворителя 1М раствор гидроксида натрия NaOH 2 г Вода 25 мл 5%-ый раствор диэтилдитиокарбамата натрия в 0,2 М гидроксиде натрия ДДТК 342,5 мг 0,2 М р-р NaOH 5 мл 1 М раствор формиата аммония HCOONH 4 630 мг Вода 10 мл 1 М раствор ацетата аммония H 3 СCOONH 4 770,8 мг Вода 10 мл II.5. Характеристика анализируемого объекта Определение всех аналитов осуществляли в плазме крови человека, содержащей K 2 ЭДТА в качестве антикоагулянта (антикоагулянт – вещество, предохраняющее кровь от свертываемости и увеличивающее срок ее использования в аналитических целях). Плазму получали путем центрифугирования цельной крови человека и последующего отбора плазмы в пробирки Эппендорфа. 69 II.6. Пробоподготовка плазмы крови к анализу II.6.1. Пробоподготовка плазмы крови при определении цисплатина К 500 мкл плазмы крови либо градуировочного раствора добавляли 500 мкл 5%-го раствора диэтилдитиокарбамата натрия в 0,2 М растворе NaOH и выдерживали при 45ºС в течение 50 мин. Реакционную смесь, разбавленную в 2 раза (объемн.) водой, пропускали через патрон для сорбционного концентрирования с гидрофильно-липофильным сорбентом Oasis HLB, предварительно кондиционированным 1 мл метанола и 1 мл воды; затем промывали сорбент 1 мл воды и 1 мл смеси вода-метанол (50:50, объемн.) и элюировали образующийся комплекс [Pt(DDTC) 3 ] + 500 мкл 2%-ного раствора уксусной кислоты в ацетонитриле. Элюат выпаривали в токе азота при 30ºС, и сухой остаток растворяли в 500 мкл ацетонитрила. II.6.2. Пробоподготовка плазмы крови при определении силденафила К 500 мкл плазмы крови, градуировочного раствора либо раствора QC добавляли 5 мкл водного раствора внутреннего стандарта (10 мкг/мл), доводили pH раствора образца до 9.0 с помощью раствора NaOH и перемешивали в шейкере в течение 10 мин при 2000 об/мин. Затем проводили сорбционное концентрирование на гидрофобном сорбенте Sep-Pak®Vac tC18. Для этого в предварительно кондиционированный 1 мл метанола и 1 мл воды сорбционный патрон загружали подготовленный образец, промывали последовательно водой и 30%-ным (объемн.) раствором метанола, элюировали аналиты 1 мл метанола. Полученный элюат выпаривали при 30ºС в токе азота, сухой остаток растворяли в 500 мкл 50%-ного водного раствора ацетонитрила для дальнейшего хромато-масс-спектрометрического определения. 70 II.6.3. Пробоподготовка плазмы крови при определении циклосерина К 500 мкл плазмы крови, градуировочного раствора либо раствора QC добавляли 10 мкл водного раствора ниацина (50 мкг/мл), 500 мкл 100 мМ формиатно-аммонийного буфера (рН 2,8) и 20 мкл концентрированной муравьиной кислоты, после чего перемешивали в шейкере 5 мин. Затем образцы центрифугировали 2 мин при скорости 10000 об/мин и температуре 4ºС и проводили процедуру сорбционного концентрирования на катионообменном сорбенте Oasis MCX. Для проведения ТФЭ на кондиционированный 1 мл метанола и 1 мл 100 мМ формиатно-аммонийного буфера (рН 2,8) сорбент загружали подготовленные пробы, после чего осуществляли промывку сорбента 1 мл воды и 1 мл 0,07 мМ раствора соляной кислоты в метаноле. Элюировали аналиты 1 мл 5%-ого (объемн.) раствора гидроксида аммония в метаноле. Полученный элюат выпаривали при 30ºС в токе азота, сухой остаток растворяли в 500 мкл смеси метанол – пропанол-2 (70 : 30 по объему) с добавкой 0,05% трифторуксусной кислоты. II.6.4. Пробоподготовка плазмы крови при определении ропинирола Аликвоту 500 мкл плазмы крови, градуировочного раствора или раствора QC помещали в пробирку Эппендорфа, добавляли 5 мкл водного раствора циталопрама с концентрацией 100 нг/мл, 500 мкл 100 мМ раствора ацетата аммония и перемешивали в вортексе 3 мин при 1500 об/мин. После этого образцы центрифугировали 2 мин при скорости 10000 об/мин и температуре 4ºС и проводили процедуру сорбционного концентрирования на катионообменном сорбенте Oasis MCX. На первой стадии отмывали сорбент 1 мл метанола и 1 мл 0,1 М раствора гидроксида натрия. Затем осуществляли кондиционирование сорбента 1 мл метанола и 1 мл 100 мМ раствора ацетата аммония и загружали образец плазмы 71 крови. На стадии промывки через сорбент пропускали 1 мл воды и 1 мл метанола. Элюировали аналиты 1 мл 5%-ого раствора гидроксида аммония в ацетонитриле. После этого выпаривали элюат в токе азота при 30ºС и растворяли сухой остаток в 500 мкл ацетонитрила. II.6.5. Пробоподготовка плазмы крови при определении капецитабина и 5-фторурацила Аликвоту 500 мкл плазмы крови, градуировочного раствора либо раствора QC помещали в полипропиленовую пробирку, добавляли 20 мкл водного раствора 5-бромурацила (100 мкг/мл), 10 мкл водного раствора капецитабина-d11 (100 мкг/мл) и перемешивали в шейкере в течение 2 мин при 1200 об/мин. Затем проводили процедуру жидкостно-жидкостной экстракции. Для этого добавляли в пробирку 5 мл этилацетата и осуществляли перемешивание в течение 5 мин при 2000 об/мин, после чего проводили центрифугирование в течение 5 мин при 4200 об/мин. Затем отбирали из пробирки 4500 мкл надосадочной жидкости в пробирки из борсиликатного стекла и выпаривали экстрагент в токе азота при 30ºС. Сухой остаток растворяли в 500 мкл воды. II.7. Условия хроматографического и масс-спектрометрического определения аналитов II.7.1. ВЭЖХ-МС условия определения цисплатина Определение цисплатина выполняли на хромато-масс-спектрометре Agilent 1100.На основании серии предварительных экспериментов выбрана подвижная фаза состава: ацетонитрил – 15 мМ ацетато-аммонийный буферный раствор с рН 4 (85:15, объемн.); скорость потока подвижной фазы 0,25 мл/мин; объем вводимой пробы 20 мкл. 72 Подобраны условия электрораспылительной ионизации: напряжение на капилляре 2200 В, давление распыляющего газа 40 psig, скорость потока и температура осушающего газа 10 л/мин и 300ºС, соответственно. Хроматограммы записывали в режиме регистрации выбранного иона по значению m/z 639,2, соответствующего трехлигандному комплексу платины с ДДТК. Пример хроматограммы приведен на рис.25. Рис.25. Хроматограмма пробы плазмы крови с добавкой цисплатина 10 нг/мл (1) и без добавки (2). Условия: хромато-масс-спектрометр Agilent 1100, колонка REPROSYL-PUR C18-AQ, п.ф. ацетонитрил–15мМ ацетато-аммонийный буфер с рН 4 (85:15, объемн.), скорость потока подвижной фазы 0,25 мл/мин; объем вводимой пробы 20 мкл. Доказательство структуры образующегося в ходе пробоподготовки комплекса выполняли на хромато-масс-спектрометре Shimadzu LC-IT-TOF. Условия: колонка YMC-Pack ODS-AQ, п.ф. 85% CH 3 CN, 15мМ аммонийно- ацетатный буфер (рН 4), скорость потока 200 мкл/мин, объем ввода 10 мкл, режим сканирования ионов m/z 635-645. min 1 2 3 4 5 6 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 70000 80000 MSD1 TIC, MS File (P2415041.D) API-ES, Pos, SIM, Frag: 100 MSD1 TIC, MS File (P2415040.D) API-ES, Pos, SIM, Frag: 100 1 2 73 II.7.2. ВЭЖХ-МС/МС условия определения силденафила Определение силденафила осуществляли на хроматографе Shimadzu Prominence с масс-спектрометром API 4000 в качестве детектора. Состав подвижной фазы ацетонитрил – 5 мМ раствор формиата аммония (40 : 60, объемн.), скорость потока подвижной фазы 0,3 мл/мин, объем вводимой пробы 5 мкл, температура термостата автодозатора 4ºС. Основные характеристики ионизации и фрагментации представлены в таблице 6. Пример хроматограммы силденафила представлен на рис. 26. Таблица 6. Масс-спектрометрические параметры при определении силденафила Параметр Условия Силденафил Тразодон (IS) Давление газа соударений (CAD), psi 6 6 Газовая завеса (CUR), psi 10 10 Давление осушающего газа (GS1), psi 20 20 Давление распыляющего газа (GS2), psi 40 40 Напряжение на игле, V 2000 2000 Температура нагревателей, ºC 650 650 Потенциал декластеризации (DP), V 70 70 Входной потенциал (EP), V 10 10 Энергия соударений (CE) 75 45 Выходной потенциал из ячейки соударений, V 2 8 MRM переход, m/z 475,2 → 57,9 372,2 → 147,6 Время, мс 500 400 Полярность (+) положительная (+) положительная 74 Рис.26. Хроматограммы образцов плазмы крови, не содержащих силденафил, и образца с добавкой 1 нг/мл силденафила (SILD). Условия: жидкостный хроматограф Shimadzu с масс-спектрометрическим детектором API 4000 (AB Sciex), колонка YMC-Triart C18, п.ф. ацетонитрил – 5 мМ раствор формиата аммония (40:60, объемн.), скорость потока подвижной фазы 0,3 мл/мин, объем вводимой пробы 5 мкл. II.7.3. ВЭЖХ-МС/МС условия определения циклосерина Хроматографическое определение циклосерина проводили на хроматографе Shimadzu, совмещенном с масс-спектрометром API 4000 AB Sciex (рис. 27). В результате предварительного исследования хроматографического поведения аналита на обращенно-фазовых (С18) и модифицированных («гидрофильная» дериватизация концевых групп: С18-AQ, Atlantis T3) сорбентах выбран режим HILIC (Hydrophilic interaction liquid chromatography) – жидкостной хроматографии с участием гидрофильных взаимодействий – с использованием подвижной фазы сложного состава. Фаза A: метанол-пропанол-2 (70:30, объемн.), 0.075% ТФУ, Фаза B: 0.075% ТФУ в воде. Элюирование осуществляли в изократическом режиме, 5% фазы В. Скорость потока подвижной фазы 500 мкл/мин, объем вводимой пробы 1 мкл, температура термостата автодозатора 4 ºС. SILD 75 Ионизационные характеристики и параметры фрагментации при определении циклосерина представлены в табл. 7. Таблица 7. Параметры ионизации и фрагментации при определении циклосерина Параметр Условия Циклосерин Ниацин (IS) Давление газа соударений (CAD), psi 6 6 Газовая завеса (CUR), psi 10 10 Давление осушающего газа (GS1), psi 14 14 Давление распыляющего газа (GS2), psi 20 20 Напряжение на игле, V 5500 5500 Температура нагревателей, ºC 650 650 Потенциал декластеризации (DP), V 44 36 Входной потенциал (EP), V 10 10 Энергия соударений (CE) 15 47 Выходной потенциал из ячейки соударений, V 6 14 MRM переход, m/z 102.9 → 75 123.9 → 80 Время, мс 300 450 Полярность (+) положительная (+) положительная Рис.27. Хроматограммы образцов плазмы крови, не содержащих циклосерин (CYC), и с добавкой 0.3 мкг/мл (LLOQ). Условия: жидкостный хроматограф Shimadzu с масс-спектрометрическим детектором API 4000 (AB Sciex), колонка YMC-Pack SIL-06, Фаза А:Фаза В в соотношении 95:5. Фаза A: метанол-пропанол-2 (70:30, объемн.), 0.075% ТФУ, Фаза B: 0.075% ТФУ. Скорость потока подвижной фазы 500 мкл/мин, объем вводимой пробы 1 мкл. CYC 76 II.7.4. ВЭЖХ-МС/МС условия определения ропинирола Определение ропинирола осуществляли на хроматографе Shimadzu Prominence с масс-спектрометрическим детектором API 4000. В результате предварительных экспериментов решено использовать режим HILIC с применением подвижной фазы состава ацетонитрил – 10мМ раствор ацетата аммония (80:20, объемн.). Скорость потока подвижной фазы – 300 мкл/мин, объем вводимой пробы – 20 мкл, температура термостата автодозатора 4 ºС. Ионизационные и фрагментационные параметры определения ропинирола представлены в табл. 8. Таблица 8. Параметры ионизации и фрагментации при определении ропинирола Параметр Условия Ропинирол Циталопрам (IS) Давление газа соударений (CAD), psi 6 6 Газовая завеса (CUR), psi 10 10 Давление осушающего газа (GS1), psi 50 50 Давление распыляющего газа (GS2), psi 50 50 Напряжение на игле, V 5500 5500 Температура нагревателей, ºC 650 650 Потенциал декластеризации (DP), V 70 71 Входной потенциал (EP), V 10 10 Энергия соударений (CE) 27 35 Выходной потенциал из ячейки соударений, V 8 8 MRM переход, m/z 261,1 → 113,8 325,2 → 108,8 Время, мс 450 300 Полярность (+) положительная (+) положительная Пример соответствующей хроматограммы представлен на рис. 28. 77 Рис. 28. Хроматограммы образцов плазмы крови без добавок и образца с добавкой 10 пг/мл ропинирола (ROP). Условия: жидкостный хроматограф Shimadzu с масс-спектрометрическим детектором API 4000 (AB Sciex), колонка YMC-Pack SIL-06, п.ф. ацетонитрил – 15мМ ацетат аммония (80:20, объемн.), скорость потока подвижной фазы 300 мкл/мин, объем ввода 20 мкл. II.7.5. ВЭЖХ-МС/МС условия определения капецитабина и 5-фторурацила Определение капецитабина и 5-фторурацила осуществляли в градиентном режиме элюирования с применением двух подвижных фаз (рис.29). Фаза А: 0,1% муравьиная кислота в воде; Фаза В: 0,1% муравьиная кислота в ацетонитриле. Элюирование осуществляли по следующей схеме: Время, мин % фазы В 0 0 0,8 0 2,5 65 3,5 65 3,6 0 8,5 Stop ROP 78 Профиль градиента 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 0 1 2 3 4 5 6 7 8 Время анализа, мин % фаз ы В Рис. 29. Профиль градиента при определении капецитабина и 5-фторурацила. Скорость потока подвижной фазы - 300 мкл/мин, объем вводимой пробы 25 мкл; температура термостата автодозатора 4ºС. Основные характеристики ионизации и фрагментации представлены в табл. 9. Таблица 9. Параметры ионизации и фрагментации при определении капецитабина (CAP) и 5-фторурацила (FU) Параметр Условия 5-фтору рацил 5-брому рацил (IS FU ) Капецита бин Капецита бин-d11 (IS CAP ) Давление газа соударений (CAD), psi 6 6 6 6 Газовая завеса (CUR), psi 15 15 10 10 Давление осушающего газа (GS1), psi 30 30 10 10 Давление распыляющего газа (GS2), psi 10 10 10 10 Напряжение на игле, V -4500 -4500 -2500 -2500 Температура нагревателей, ºC 650 650 650 650 Потенциал декластеризации (DP), V -31 -31 -31 -31 Входной потенциал (EP), V -10 -10 -10 -10 Энергия соударений (CE) -40 -40 -40 -40 Выходной потенциал из ячейки соударений, V -15 -15 -15 -15 MRM переход, m/z 128.9 → 42 188.9 → 42.0 358 → 153 369 → 154 Время, мс 150 150 600 800 Полярность (-) отрица- тельная (-) отрица- тельная (-) отрица- тельная (-) отрица- тельная 79 Регистрация MRM-переходов для 5-фторурацила и 5-бромурацила продолжалась с начала анализа до 4,4 мин, а затем регистрировались MRM-переходы капецитабина и его внутреннего стандарта до окончания анализа. Примеры хроматограмм образца плазмы крови с добавкой капецитабина и 5-фторурацила представлены на рис.30. Рис.30. Хроматограммы образцов плазмы крови с добавкой 20 нг/мл (LLOQ) капецитабина (CAP) (а) и 20 нг/мл (LLOQ) 5-фторурацила (FU) (б). Условия: жидкостный хроматограф Shimadzu с масс-спектрометрическим детектором API 4000 (AB Sciex), колонка YMC-Pack ODS-AQ, градиентное элюирование (см. рис.29). Скорость потока подвижной фазы 300 мкл/мин, объем вводимой пробы 25 мкл. CAP FU (а) (б) 80 II.8. Валидационные характеристики методов Согласно требованиям EMA (European Medicines Agency) основными параметрами биоаналитической методики, подтверждающими эффективность и надежность результатов, являются селективность определения, нижний предел количественного определения, калибровочный диапазон, правильность, повторяемость, матричный эффект, стабильность аналита в биологической матрице и стабильность аналита и внутреннего стандарта в экстрактах при условиях хранения и пробоподготовки. Значения валидационных параметров для каждой разработанной методики, полученные в соответствии с описанными требованиями, приведены в табл.10. 81 Таблица 10. Валидационные характеристики разработанных методик Параметр Цисплатин Силденафил Циклосерин Ропинирол Капецитабин 5-фторурацил Допустимое значение параметра Селективность 100% 100% 100% 100% 100% 100% >90% LLOQ 10 нг/мл 1 нг/мл 0,3 мкг/мл 10 пг/мл 20 нг/мл 20 нг/мл - Калибровочный диапазон 10-400 нг/мл 1-1000 нг/мл 0,3-30 мкг/мл 10 – 2000 пг/мл 20-4000 нг/мл 20-800 нг/мл - Повторяемость LLOQ 15 1,2 3,3 5,1 5,7 8,6 <20% Верхний уровень QC 3,7 6,7 1,2 5,0 1,5 7,6 <15% Правильность LLOQ 98 89,3 95,3 102,5 100,3 98,6 80-120% Верхний уровень QC 104,9 94,9 96,8 104,3 103,9 98,6 85-115% Степень извлечения, (n=5) 92±3 95±4 77±2 89±5 60±8 47±4 - Матричный эффект 5,2 4,0 0,8 4,4 13,2 8,4 <15% 82 На рис. 31-35 приведены градуировочные зависимости, характеризующие линейный диапазон каждой из разработанных биоаналитических методик. y = 3E+06x + 6E+06 R 2 = 0,9984 0 200000000 400000000 600000000 800000000 1000000000 1200000000 1400000000 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Концентрация, нг/мл Пл о щ ад ь Рис.31. Градуировочная зависимость для цисплатина. Рис.32. Градуировочная зависимость для силденафила y = 0.008x + 0.00232 r = 0.9984 Весовой коэффициент 1/х 2 83 Рис.33. Градуировочная зависимость для циклосерина Рис.34. Градуировочная зависимость для ропинирола y = 0.95x + 0.00327 r = 0.9992 Весовой коэффициент 1/у y = 0,0024 x + 0,0616 r = 0,9981 Весовой коэффициент 1/х 2 84 Рис.35. Градуировочная зависимость для капецитабина (а) и 5-фторурацила (б) Проведена оценка стабильности аналитов в различных условиях: стабильность замораживания и размораживания, краткосрочная и долгосрочная температурная стабильность в плазме крови, стабильность образцов после пробоподготовки в автодозаторе. В соответствии с установленными требованиями проведены исследования стабильности каждого из рассматриваемых аналитов. Результаты представлены в табл. 11. y = 0,000345 x + 0,00116 r = 0,9981 Весовой коэффициент 1/х 2 y = 0,00208 x + 0,0206 r = 0,9907 Весовой коэффициент 1/х 2 (б) (а) 85 Таблица 11. Оценка стабильности аналитов при различных условиях хранения (указано отклонение в % от номинальной концентрации) Условия Циспла тин Силде нафил Цикло серин Ропини рол Капецита бин 5-фторур ацил Замораживание- размораживание (3 цикла) 8,4% 11,3% 7,1% 13,8% 10,0% 8,5% Краткосрочная стабильность 11,6% (8 ч) 7,5% (18 ч) 7,1% (14 ч) 8,9% (18 ч) 8,8% (24 ч) 4,7% (24 ч) Долгосрочная стабильность 10,7% (1 мес.) 8,2% (1 мес.) 13,1% (1 мес.) 12,0% (3 мес.) 7,8% (3 мес.) 2,9% (3 мес.) Стабильность в автодозаторе 12,7% (8 ч) 5,8% (18 ч) 3,3% (15 ч) 0,7% (18 ч) 6,7% (24 ч) 10,8% (24 ч) II.9. Клинические исследования, выполненные с применением разработанных методик Разработанная методика определения цисплатина в плазме крови была применена при проведении исследования общей токсичности при изолированной перфузии легкого (содержание 250 мг). Концентрацию цисплатина определяли через 0; 5; 15; 30; 60; 80; 120 мин после проведения перфузии. Всего проанализировано 70 образцов плазмы крови. Методика определения силденафила в плазме крови применена дважды при проведении двух исследований сравнительной фармакокинетики и биоэквивалентности силденафила (100 мг) и препарата сравнения у здоровых добровольцев. В каждом исследовании принимали участие 30 пациентов. Заборы крови осуществлялись исходно (до приема препарата) и через 2, 4, 8, 12, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 48, 96, 168, 336, 504, 672 часа после приема препарата. В каждом из двух исследований по определению силденафила проанализировано 1080 образцов плазмы крови. Методика определения циклосерина в плазме крови применена при проведении двух открытых рандомизированных перекрестных исследований сравнительной фармакокинетики и биоэквивалентности циклосерина и препарата 86 сравнения (капсулы 250 мг) при пероральном приеме здоровыми взрослыми добровольцами. В каждом исследовании принимали участие 23 пациента. Забор крови осуществлялся до приема препарата и через 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 12, 16, 24, 36, 52 часа после приема. В каждом из двух исследований по определению циклосерина проанализировано 644 образца плазмы крови. Разработанная методика определения ропинирола применена при проведении открытого рандомизированного перекрестного исследования сравнительной фармакокинетики и биоэквивалентности ропинирола и препарата сравнения (2 мг). В исследовании принимало участие 24 человека. Забор крови осуществлялся до приема препарата и через 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 18, 24, 36, 48 часов после его приема. Всего проанализировано 912 образцов плазмы крови. Методика совместного определения капецитабина и 5-фторурацила применена при проведении открытого рандомизированного перекрестного исследования сравнительной фармакокинетики и биоэквивалентности капецитабина и препарата сравнения (200 мг). В исследовании принимала участие группа из 24 человек. Забор крови осуществлялся исходно (до приема) и через 0, 0.5, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 часов после приема препарата. Всего в рамках исследования проанализировано 1536 образцов плазмы крови. Все описанные исследования проводились в биоаналитическом центре «ЦКП «Аналитическая Спектрометрия». |