ГЛАВА III. ВЫЯВЛЕНИЕ И УСТРАНЕНИЕ МАТРИЧНЫХ
ЭФФЕКТОВ, ПРИВОДЯЩИХ К НЕУДОВЛЕТВОРИТЕЛЬНОЙ
СХОДИМОСТИ РЕЗУЛЬТАТОВ АНАЛИЗА
III.1. Матричный эффект при определении цисплатина в плазме
крови
Для определения цисплатина опробованы различные варианты хроматографических и масс-спектрометрических условий, включающие варьирование элюирующих систем (природа органического растворителя, процент его содержания, добавка кислоты), диапазона регистрируемых масс, концентраций аналита в пробе (табл.12).
Таблица 12. Опробованные хроматографические условия при определении цисплатина
Колонка:
REPROSYL-PUR C18-AQ, 150x2 мм, 3мкм
Элюирующие системы:
10, 60, 80% CH
3
OH+0,01% H
3
CCOOH;
CH
3
OH:CH
3
CN:H
2
O (50:30:20)+0,1% HCOOH;
80% CH
3
CN+0,1% HCOOH
Регистрируемые сигналы
m/z:
Scan: 190-450, 280-350, 295-325, 250-325
SIM: 266, 284, 301, 323
Диапазон концентраций:
0.25 – 2.5 мкг/мл
Согласно литературным данным [125-127] ВЭЖХ-МС определение цисплатина чаще всего проводится в виде комплексов платины с различными агентами.
В качестве комплексообразующего агента на основании [125] был опробован глутатион в восстановленной форме. Реакцию проводили по следующей схеме:
Смешивали эквимолярные количества глутатиона и цисплатина (300 мкл раствора цисплатина, 1 мкг/мл и 276 мкл раствора глутатиона, 1 мкг/мл)
88
Инкубировали при 37ºС в течение 1 ч
Проводили жидкостно-жидкостную экстракцию. В качестве экстрагента использовали 2 мл хлороформа. Органический слой, выпаривали досуха и остаток перерастворяли в 300 мкл CH
3
CN.
Массы ожидаемых аддуктов цисплатина с глутатионом m/z 570 и 835
(рис.36).
Cl
Pt
H
3
N
NH
3
H
2
C
H
C
C
O
NH
CH
2
COOH
H
N
C
O
CH
2
CH
2
HC
NH
2
COOH
S
Рис.36. Структуры возможных аддуктов цисплатина и глутатиона [128].
При масс-спектрометрическом анализе не был обнаружен ни один из ожидаемых сигналов m/z. По этой причине от такого комплексообразующего агента пришлось отказаться.
Другой подход – взаимодействие цисплатина с диэтилдитиокарбаматом
(ДДТК, DDTC) натрия с образованием соответствующего двухлигандного комплекса (рис. 37) (раствор цисплатина и 10% ДДТК в 0,1 M р-ре NaOH в соотношении 10:1 (объемн.) и инкубирование при 37 ºС в течение 30 мин)
[126].
Рис.37.
Образование двухлигандного комплекса платины и диэтилдитиокарбамата.
Для определенияцисплатина в такой аналитической форме использовали колонку REPROSYL-PUR C18-AQ. Выявлено влияние на хроматографические и
m/z 570
m/z 835
Pt
Cl
Cl
NH
3
NH
3
+ 2
S
-
S
C
N
Pt
S
S
C
N
S
S
C
N
-2NH
3
-2Cl
89 масс-спектрометрические характеристики пика аналита содержания ацетонитрила в составе подвижной фазы (75 – 85%), муравьиной и уксусной кислот (0,01 –
0,5%), ацетата аммония (2 – 15 мМ) и аммонийно-ацетатного буфера с различными значениями рН (3, 4, 5).
Для выбора параметров ионизации при определении цисплатина в виде двухлигандного комплекса с диэтилдитиокарбаматом варьировали значение фрагментора (50 – 200 В), напряжение на капилляре (500 – 4000 В), давление распыляющего газа азота (20 – 60 psig), скорость потокаосушающего газа
(7 - 11 л/мин), температуру осушающего газа (200 – 350 ºС). Выбирали те значения параметров, при которых площадь и интенсивность хроматографического пика аналита была максимальна.
Определение двухлигандного комплекса платины и ДДТК осуществляли по сигналу m/z 491.
После выбора условий хромато-масс-спектрометрического определения циклосерина необходимо было разработать процедуру пробоподготовки плазмы крови для извлечения комплекса платины и диэтилдитиокарбамата.
Первоначально для этой цели были выявлены возможности жидкостно- жидкостной экстракции с использованием различных органических растворителей (хлороформ, гексан, гептан, этилацетат). Установлено, что для извлечения комплекса из реакционной смеси, общий объем которой составлял 550 мл, требуется 1 мл хлороформа (использование для этой цели других растворителей оказалось малоэффективным).
На границе водного и органического слоев наблюдалось образование еще одного слоя – белкового, который мешал отделению органического растворителя
(нижний слой). Для эффективного разделения фаз опробована процедура замораживания при -25ºС. Однако при анализе подготовленных таким образом проб, выяснилось, что после замораживания площадь хроматографического пика, соответствующего комплексу Pt(DDTC)
2
, значительно меньше, чем в случае экстракции без замораживания. Поэтому было решено отказаться от использования такого способа разделения водного и органического слоев.
90
В связи с этим в процедуру пробоподготовки перед ЖЖЭ была введена стадия осаждения белков ацетонитрилом.
Степень извлечения при ЖЖЭ из плазмы крови составила 66±5 %.
Для увеличения степени извлечения образующегося комплекса из плазмы крови было принято решение применить сорбционное концентрирование в качестве процедуры пробоподготовки.
Как и в случае ЖЖЭ, после образования комплекса проводили осаждение белков. Для этого к реакционной смеси (550 мкл), содержащей плазму крови с добавкой цисплатина и раствор ДДТК, добавляли 2 млCH
3
CN, перемешивали для более полного осаждения белков и центрифугировали. После этого надосадочную жидкость отбирали и выпаривали под током азота. К остатку добавляли 1 мл воды, и эту пробу подвергали сорбционному концентрированию на картриджах с гидрофильно-липофильным сорбентом Waters Oasis HLB. Опробованы различные варианты элюирующих систем: CH
3
CN, CH
3
OH, 2% H
3
CCOOH и CНCl
3
(с последующим выпариванием и перерастворением в ацетонитриле).
Лучшие результаты по извлечению получены при промывке сорбента
50%-ым раствором CH
3
OH и последующем элюировании раствором ацетонитрила с добавкой 2%-ого раствора уксусной кислоты. Степень извлечения двухлигандного комплекса при этом составила 81±6%.
Для оценки матричного эффекта проведена пробоподготовка шести образцов плазмы крови различных доноров с добавкой цисплатина по описанной выше схеме. Анализ этих образцов обнаружил присутствие значительного матричного эффекта, что проявилось в высоких значениях коэффициента вариации при оценке матричных факторов для шести проанализированных образцов (табл. 13).
91
Таблица 13. Значения матричных факторов для 6 образцов плазмы крови различных доноров при определении цисплатина в форме комплекса Pt(DDTC)
2
№ образца MF MF (среднее) CV, % Образец 1 0.52 0.69±0.26 38
Образец 2 0.90
Образец 3 0.44
Образец 4 0.41
Образец 5 0.98
Образец 6 0.89
Для решения данной проблемы необходимо было усовершенствовать процедуру получения комплекса. При анализе реакционной смеси после проведения дериватизации на водных растворах в масс-спектре в режиме сканирования
m/z 295 – 650 был обнаружен сигнал
m/z 639,2, который потенциально мог соответствовать трехлигандному комплексу платины и диэтилдитиокарбамата состава Pt(DDTC)
3
+
. Анализ литературных данных показал, что в [129] есть упоминание о получении комплекса такого состава.
Подтверждение состава комплекса проведено с использованием тандемного масс-спектрометрического анализа на хромато-масс-спектрометре Shimadzu IT-
TOF. Показано, что изотопное распределение для полученного нами комплекса совпадает с литературным (рис. 38). Кроме того,
состав комплекса подтвердился сигналами, наблюдаемыми в масс-спектрах второго и третьего порядков.
92
Так, в масс-спектре первого порядка детектируется ион m/z 638,9
(Pt(DDTC)
3
+
), который в МС/МС режиме фрагментируется с образованием осколка m/z 490,9, соответствующего фрагменту Pt(DDTC)
2
(Рис.39, А).
Спектр на рис. 39, Б дает информацию о более глубокой – МС/МС/МС – фрагментации иона m/z 490,9
В нём сигнал m/z 343,9 соответствует протонированному остатку после отрыва ещё одного лиганда ДДТК, т.е.
637.0 638.0 639.0 640.0 641.0 642.0
m/z
0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 3.00 3.25
Inten. (x1,000,000)
639.9(1)
638.9(1)
637.9(1)
640.9(1)
641.9(1)
642.9 636.9(3)
640.4(7)
640.3(1)
639.3(1)
639.4(4)
639.4(8)
640.1(2)
639.7(8)
638.6(4)
639.6(4)
638.1(4)
638.4(4)
639.1(4)
640.7(7)
641.4(5)
638.3(1)
640.7(2)
638.7(10)
640.6(2)
642.4 641.3(1)
638.8(10)
641.1(2)
642.7(8)
641.7 639.7(2)
642 4(8)
641 6(5)
641 8(5)
642 1(2)
642 3(1)
641 7(2)
642 6(8)
641 4 642 8 641 2(5)
640 4 642 6(2)
636 2(3)
640 2(2)
640 5(7)
636 8(7) 637 3(3)
639 6(8)
637 7(10)
637 7(10)
636 8 638 6(10)
637 2 642 5 636 7(7)
637 6(3)
637 5(10)
639 5 636 4(7)
641 5 637 5(10)
636 6(3)
637 1 642 0 636 5(7)
(а)
(б)
Рис.38. Вид литературного [129] (а) и экспериментального (б) изотопного распределения в комплексе Pt(DDTC)
3
+
93
[Pt(DDTC)+H]
+
, а сигнал m/z 419,8 характеризует протонированный осколок после потери фрагмента N(C
2
H
5
)
2
Таким образом, используя данные тандемной масс-спектрометрии, удалось предположить строение комплекса Pt(DDTC)
3
+
(рис.40). Атом платины (IV) окружен тремя лигандами ДДТК таким образом, что атомы серы составляют непосредственное окружение платины. Причем три из шести связей платина-сера
– ковалентные, а три другие – координационные.
Б (МС)
3
A (МС)
2
490,9
343,9
419,9
Рис.39. МС/МС-спектры ионов m/z 638,9 (А) и m/z 490,9 (Б).
94
Предположительно образование трехлигандного комплекса протекает по следующей схеме:
2PtCl
2
(NH
3
)
2
+ 6Na(DDTC) + 2H
2
O + O
2 2Pt(DDTC)
3
+
OH
-
+ 2NaOH + 4NH
3
+ 4NaCl
Основываясь на полученных ранее данных по определению двухлигандного комплекса, осуществили поиск наиболее подходящих хроматографических и масс-спектрометрических условий (табл. 14.) определения цисплатина в виде комплекса Pt(DDTC)
3
+
Рис.40. Предполагаемая пространственная структура комплекса
Pt(DDTC)
3
+
95
Таблица 14.
Найденные значения параметров ионизации при определении цисплатина в форме комплекса Pt(DDTC)
3
+
Параметр
Значение
Фрагментор, В
100
Напряжение на капилляре, В
2200
Температура осушающего газа, ºС
300
Режим SIM
639,2
При подборе состава подвижной фазы для определения комплекса
Pt(DDTC)
3
+
установлено:
- использование ацетонитрила в качестве органического компонента подвижной фазы более предпочтительно, чем метанола, поскольку для последнего в масс-спектре наблюдается высокий уровень шума и мешающие сигналы в требуемом диапазоне масс;
- увеличение концентрации уксусной кислоты в подвижной фазе приводит к увеличению площади хроматографического пика аналита и достигает стабильного значения при содержании 0,5% (Рис.41);
Рис.41. Зависимость площади хроматографического пика комплекса
Pt(DDTC)
3
+
от содержания уксусной кислоты в составе подвижной фазы.
96
- увеличение концентрации ацетата аммония в составе подвижной фазы
(80% CH
3
CN, 0,2% HCOOH) в диапазоне 2 – 15 мМ приводит к увеличению площади хроматографического пика; при этом время удерживания не меняется и составляет 5,7 мин (рис.42).
Изучено влияние на хроматографические характеристики пика аналита подвижной фазы с добавкой аммонийно-ацетатного буфера в концентрации
15 мМ при различных значениях рН (3 – 5). Установлено, что при значении рН 4.0 интенсивность сигнала сохраняется, а отклик от примесей минимален.
Попытки увеличить селективность разделения примесных компонентов и комплекса платины с ДДТК за счет снижения процентного содержания органического компонента (CH
3
CN) в составе подвижной фазы до 75% привели к изменению времен удерживания только примесей. В связи с этим было принято решение, напротив, увеличить содержание ацетонитрила в элюирующей системе до 85%; примесные компоненты элюируются до 4 мин, а время удерживания комплекса цисплатина остается 5,7 мин.
Поскольку хроматографический пик определяемого комплекса оставался все-таки довольно широким, увеличили скорость потока подвижной фазы со 150 до 300 мкл/мин. Таким образом, удалось сократить время выхода всех
Рис.42. Зависимость площади хроматографического пика комплекса
Pt(DDTC)
3
+ от содержания ацетата аммония в составе подвижной фазы.
97 компонентов пробы (t
R
[Pt(DDTC)
3
+
]=4,4 мин), а также уменьшить ширину хроматографического пика аналита (рис.43).
Найденные хроматографические условия определения цисплатина в форме комплекса платины с ДДТК следующие:
Колонка – REPROSYL-PUR C18-AQ,
П.ф. – 85 % CH
3
CN, 15 мМ H
3
CCOONH
4
(рН 4,0),
Скорость потока – 300 мкл/мин,
Объем пробы – 10 мкл.
При отработке процедуры дериватизации цисплатина варьировали концентрацию раствора реагента ДДТК (5-50%) в 0,2М NaOH; соотношение объемов раствора цисплатина и раствора реагента; температуру (20 – 50ºС) и время (20 – 70 мин) реакции. При выборе соотношения объемов учитывали, что объём плазмы крови образца целевых исследований должен составлять не более
500 мкл.
Лучшим соотношением объемов раствора цисплатина и раствора ДДТК в
0,2 М раствора NaOH, при котором хроматографические характеристики пика min
1 2
3 4
5 6
2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000
MSD1 TIC, MS File (P2414100.D) API-ES, Pos, SIM, Frag: 100
Рис.43. Хроматограмма пробы комплекса Pt(DDTC)
3
+
при выбранных хроматографических условиях определения.
98 аналита максимальны, а влияние примесных компонентов минимально, оказалось соотношение 1 : 1 (объемн.), а концентрация раствора реагента – 25% (рис.44).
Выявлено влияние температуры и времени реакции на площадь хроматографического сигнала (рис.45). Так при проведении реакции при комнатной температуре (25ºС) достигнутые площади пика аналита были существенно ниже, чем при 45ºС. Однако уже при 50ºС через 30 минут начинался процесс разрушения комплекса Pt(DDTC)
3
+
, о чем свидетельствует снижение значений площади пика аналита. Установлено, что наиболее подходящим является сочетание времени и температуры реакции – 45ºС и 50 мин. min
1 2
3 4
5 6
5000 10000 15000 20000 25000 30000 35000
MSD1 TIC, MS File (P2414142.D) API-ES, Pos, SIM, Frag: 100
MSD1 TIC, MS File (P2414144.D) API-ES, Pos, SIM, Frag: 100
MSD1 TIC, MS File (P2414148.D) API-ES, Pos, SIM, Frag: 100
30% DDTC
25% DDTC
20% DDTC
Рис. 44. Влияние концентрации ДДТК в растворе на площадь хроматографического пика образующегося комплекса
Условия: хромато-масс-спектрометр Agilent 1100, колонка REPROSYL-PUR
C18-AQ, п.ф. 85% CH
3
CN, 15мМ аммонийно-ацетатный буфер (рН 4), скорость потока
300 мкл/мин, объем ввода 10 мкл, SIM: 639,2.
99
Для извлечения трехлигандного комплекса из плазмы крови воспользовались разработанной ранее схемой процедуры сорбционного концентрирования. Степень извлечения в данном случае вычисляли по формуле:
%
100
_
_
стандарта
ТФЭ
после
аналита
S
S
R
(4)
Для ТФЭ комплекса Pt(DDTC)
3
+
использовали сорбционные патроны Waters
OASIS HLB.
Осуществлен подбор растворителя для промывки сорбента (H
2
O, 10% и 50%
CH
3
OH) и элюирования аналита (CH
3
CN, CH
3
CN с добавкой 2% H
3
CCOOH,
HCCl
3
).
В результате остановились на следующей схеме экстракции:
Кондиционирование сорбента 1 мл CH
3
OH/1 мл H
2
O
Загрузка пробы
Промывка 2 мл H
2
O
Элюирование 2 мл CH
3
OH
Выпаривание метанола в токе азота
Рис.45. Зависимость площади хроматографического сигнала комплекса Pt(DDTC)
3
+
от времени реакции при различных температурах.
100
Перерастворение сухого остатка в 500 мкл CH
3
CN с добавкой
2% H
3
CCOOH.
Степень извлечения комплекса составила 92±3 %. Достигнутый предел определения при конечном варианте пробоподготовки составил 10 нг/мл (Рис. 46)
[130].
Для оценки матричного эффекта при определении цисплатина в форме трехлигандного комплекса подготовлено 12 образцов плазмы крови различных доноров с добавкой цисплатина. Для каждого образца проведена оценка матричного фактора и вычислено среднее его значение для всех образцов.
Сопоставление коэффициентов вариации для двух- и трехлигандного комплекса платины и ДДТК показало, что втором случае влияние биологической матрицы на определение аналита не проявляется (табл.15).
Рис.46. Хроматограмма образца плазмы крови с добавкой цисплатина - CYC (10 нг/мл) после дериватизации и пробоподготовки.
Условия анализа (см. рис.44). min
1 2
3 4
5 6
2500 5000 7500 10000 12500 15000 17500 20000 22500
MSD1 TIC, MS File (P2414544.D) API-ES, Pos, SIM, Frag: 100
Ar ea:
3 64604 4.
56 7
CYC
101
Таблица 15. Сопоставление матричных факторов для двух аналитических форм цисплатина
Аналитическая форма
MF (среднее)
n=12
Коэффициент
вариации, %
Pt(DDTC)
2 0.67±0.23 34
Pt(DDTC)
3
+
0.93±0.05 5
Таким образом, в результате применения описанного подхода усовершенствования процедуры дериватизации описанный выше матричный эффект устранен. Это независимо подтверждено проверкой на образцах плазмы крови 12-ти различных доноров. Коэффициент вариации снизился с 34% для двухлигандного комплекса до 5% в случае комплекса трехлигандного.
Параметры разработанной методики валидированы согласно установленным международным критериям EMA.
III.2. Матричное влияние при определении силденафила в плазме
крови
Подобного типа проблема продемонстрирована и на примере ВЭЖХ-МС/МС определения препарата силденафила (рис.47) при использовании сорбционного концентрирования в качестве процедуры пробоподготовки. Однако в данном случае прием для устранения мешающего эффекта матрицы принципиально отличался.
102
При разработке процедуры извлечения силденафила из плазмы крови опробованы различные типы сорбентов (гидрофобный Sep-Pak®Vac tC18,
катионообменный Oasis MCX, смешанного типа гидрофильно-липофильный Oasis
HLB); варьировались условия промывки сорбента и элюирования аналита.
Подобраны различные условия проведения процедуры сорбционного концентрирования (табл. 16) с высокими степенями извлечения силденафила (90 –
100%), но различной чистотой конечного экстракта (рис. 48).
Экстракт плазмы крови после извлечения катионнообменным сорбентом MCX содержит большое количество эндогенных компонентов, которым соответствует на хроматограмме широкий интенсивный пик (1–2 мин) (рис. 48). При серийных анализах это может приводить к изменению хроматографических характеристик колонки и снижению общего срока её службы, поэтому методика становится малоприменимой для клинических исследований. Пробы, полученные из плазмы крови, с применением сорбентов HLB и Sep-Pak®Vac tC18, оказались значительно чище, однако в первом случае имеются интерференции в интересующем временном диапазоне
(рис. 48).
Предпочтение было отдано сорбенту Sep-Pak®Vac tC18, при котором селективность извлечения максимальна, а получаемый экстракт содержит минимальное количество матричных компонентов. Показано, что использование последовательной промывки сорбента водой и 30%-ным раствором метанола позволяет практически полностью избавиться от мешающих компонентов
Структура силденафила (pK
a
8.7)
Структура тразодона (pK
a
6.7)
Рис.47. Строение силденафила и тразодона (внутренний стандарт).
103 матрицы (рис. 39), а элюирование 100%-ным метанолом обеспечивает полное извлечение аналита с сорбента. Степень извлечения здесь и в дальнейшем вычисляли по формуле:
,
(5) где R –
степень извлечения, S
1
– площадь пика в пробе с добавкой аналита до пробоподготовки,
S
1
– площадь пика в пробе с добавкой аналита после пробоподготовки.
Среднее значение степени извлечения силденафила в данных условиях составило 95±4 % (n = 10), а тразодона 93±4 % (n = 10) [131].
t, мин
1 2 3 Рис. 48. Хроматограммы экстрактов плазмы крови после извлечения и очистки на сорбентах Oasis HLB – гидрофильно-липофильный
(1),Oasis
MCX – катионообменный
(2) и Sep-Pak®Vac tC18 – гидрофобный
(3) (увеличен диапазон времени удерживания силденафила S).
Условия хроматографирования: жидкостный хроматограф Agilent с УФ- детектором, колонка Agilent Eclipse Plus C18, п. ф. 40 об. % CH
3
CN - 60 об. % 40 мМ ацетатно-аммонийного буферного раствора (рН 7), скорость потока 300 мкл/мин, длина волны детектора 290 нм.
2 1
S
S
R
104
Таблица 16. Степень извлечения силденафила из плазмы крови с использованием различных типов сорбентов
Тип сорбента
Условия сорбционного концентрирования
Степень
извлечения
силденафила, %
(n=10)
Oasis HLB
(гидрофильно- липофильный баланс)
1. Кондиционирование сорбента:
1 мл CH
3
OH, 1 мл H
2
O
2. Загрузка образца (Плазма крови, рН 10,0)
3. Промывка сорбента:
1 мл 5 % CH
3
OH, 2 % NH
4
OH
1 мл 20 % CH
3
OH, 2 % NH
4
OH
4. Элюирование 1 мл CH
3
OH
5. Выпаривание и перерастворение в п.ф.
90 ± 6
Sep-Pak®Vac tC18
(гидрофобные взаимодействия)
1. Кондиционирование сорбента:
1 мл CH
3
OH, 1 мл H
2
O
2. Загрузка образца (Плазма крови, рН 10,0)
3. Промывка сорбента:
1 мл H
2
O
1 мл 30 % CH
3
OH
4. Элюирование 1 мл CH
3
OH
5. Выпаривание и перерастворение в п.ф.
95 ± 4
Oasis MCX
(катионообменные взаимодействия)
1. Кондиционирование сорбента:
1 мл CH
3
OH, 1 мл H
2
O
2. Загрузка образца (Плазма крови, рН 4,0)
3. Промывка сорбента:
1 мл 0,1 н HCl
1 мл CH
3
OH
1 мл 20 % CH
3
OH, 2 % NH
4
OH
4. Элюирование 1 мл CH
3
OH, 5 % NH
4
OH
5. Выпаривание и перерастворение в п.ф.
98 ± 6
В методе ВЭЖХ-МС/МС с электроспрей ионизацией подвижная фаза должна содержать летучие компоненты, способствующие улучшению ионизационных характеристик аналита. Поэтому использовали водно- метанольные и водно-ацетонитрильные системы с добавками муравьиной кислоты и формиата аммония. Лучшей оказалась подвижная фаза состава ацетонитрил вода (40 : 60 по объему) с добавкой 5 мМ раствора формиата аммония (pH 6,5). Время удерживания силденафила в этих условиях составило 5,0 мин, а тразодона – 3,9 мин.
Тразодон в качестве внутреннего стандарта выбран на основании наличия схожих структурных фрагментов в его молекуле и, как следствие, близких ионизационных характеристик и сорбционных свойств.
105
Определение силденафила и тразодона осуществляли по MRM-переходам
m/z 475→282
и m/z 372→147, соответственно. Однако при оценке матричных факторов для образцов плазмы крови 6 различных доноров выяснилось, что коэффициент вариации превысил 40%. Кроме того, среднее значение матричного фактора для всех образцов составило 1,34±0,62, что указывает на усиление аналитического сигнала.
Первоначально было высказано предположение о совместной ионизации молекул аналита и неизвестных компонентов биологической матрицы, которые усиливают величину аналитического сигнала.
Попытки изменить хроматографические условия определения аналита с целью изменения времени его удерживания и отделения от нерегистрируемых матричных компонентов не привело к положительному результату – коэффициент вариации матричных факторов для 12 образцов плазмы крови различных доноров не удовлетворял установленным критериям [1].
Была предпринята попытка определять силденафил по другому
MRM-переходу: m/z 475→58. И в этом случае рассчитанные значения матричных факторов характеризовались удовлетворительным значением коэффициента вариации – 4% при среднем значении матричного фактора 0,89±0,04. Такие не совсем ожидаемые результаты заставили задуматься о природе происхождения данного эффекта.
Поскольку для каждого из MRM-переходов родительский ион один и тот же, говорить о вовлечении компонентов матрицы в процессы ионизации как о причине матричного эффекта для одного из переходов нельзя. Если матричные компоненты влияли бы на ионизацию, это должно было бы проявиться в равной степени для обоих MRM-переходов.
Вероятно, процесс влияния биологической матрицы в данном случае более сложен. После прохождения через первый квадруполь ионы силденафила и неизвестных матричных компонентов с тем же значением m/z подвергаются фрагментации в ячейке соударений – втором квадруполе. Предположительно влияние матричных компонентов проявляется именно на данном этапе, т. е. в
106 случае перехода
m/z 475→282 матричные компоненты имеют схожую с молекулой силденафила картину фрагментации и вносят вклад аналитический сигнал аналита. В то же время другой путь фрагментации –
m/z 475→58 – для матричных компонентов не характерен, и поэтому в конечном итоге влияние матрицы не наблюдается.
На рис. 49 представлены масс-спектры в режиме сканирования первым квадруполем (А), а также спектры, получаемые после фрагментации для каждого из упомянутых MRM-переходов (Б, В). Кроме того, показан основной путь фрагментации в молекуле для каждого из обсуждаемых МRМ-переходов.
Обнаружение подобного матричного эффекта еще раз доказывает, что использование
даже такой мощной аналитической техники, как тандемная масс- спектрометрия, не гарантирует отсутствия проблем, связанных с мешающим влиянием матричных компонентов при определении лекарственных препаратов в биообъектах.
107
Рис. 49. Масс-спектр силденафила в режиме scan 470-480 m/z (А); МС/МС-спектр силденафила (scan 50-60 m/z) (Б);
МС/МС-спектр силденафила (scan 280-290 m/z) (В).
Фрагмент для
количественного
определения
m/z 58
I, отн.ед.
m/z 475 → 58
m/z 475 → 282
[M+H]
+
m/z 475
I, отн.ед.
m/z, Да
Фрагмент для
количественного
определения
m/z 282
I, отн.ед.
m/z, Да
А
Б
В
m/z, Да
108
III.3. Матричные эффекты при определении капецитабина и
5-фторурацила в плазме крови
Разработка методики одновременного определения противоопухолевого препарата капецитабина (рис. 50) и его основного метаболита 5-фторурацила представляло наибольшие трудности с точки зрения матричного влияния, которое проявлялось как в подавлении ионизации, так и в плохой воспроизводимости значений матричных факторов для образцов плазмы крови различных доноров.
Первоначально для совместного определения капецитабина и 5-фторурацила использовали в качестве процедуры пробоподготовки осаждение белков.
Опробованы различные агенты для осаждения (метанол, ацетонитрил, трихлоруксусная кислота) и соотношения объемов плазмы и осаждающего агента.
Однако при масс-спектрометрическом анализе образца плазмы крови после
Рис. 50. Структурные формулы капецитабина (1) и 5-фторурацила (2) и их внутренних стандартов – капецитабина-d11 (3) и 5-бромурацила (4).
(1)
(2)
(3)
(4)
109 пробоподготовки с добавкой капецитабина и 5-фторурацила наблюдалось очень сильное подавление ионизации вплоть до полного отсутствия отклика аналита
(MF→0).
Для снижения такого матричного влияния испытаны различные экстрагенты для жидкостно-жидкостной экстракции, а также комбинации процессов ЖЖЭ, осаждения белков, сорбционного концентрирования. Наименьшее подавление ионизации и наибольшие степени извлечения наблюдались при использовании в качестве экстрагента этилацетата с предварительным подкислением образца плазмы крови. Кроме того, следует отметить, что ни один из опробованных сорбентов (гидрофобный, катионообменный, анионообменный, гидрофильно- липофильный) не позволил одновременно полностью удержать и капецитабин, и
5-фторурацил при загрузке образца.
Таким образом, ЖЖЭ в этилацетат становилась единственно возможным вариантом извлечения аналитов из плазмы крови с приемлемыми степенями извлечения: 60±8% для капецитабина и 47±4% для 5-фторурацила.
Эксперименты по использованию сверхсшитого полистирола Purosep 200 при сорбционном концентрировании показали наилучшие результаты: матричное влияние не проявлялось ни гашением ионизации, ни высоким коэффициентом вариаций матричного фактора для образцов плазмы крови различных доноров.
Перед загрузкой на сорбент доводили значение рН образца крови до 6,5 добавлением 1М HCl. Это требовалось для перевода аналитов в незаряженную форму (pK
a для капецитабина и 5-фторурацила составляет 8.2 и 7.7 соответственно). В серии предварительных экспериментов опробованы различные элюирующие системы (метанол, ацетонитрил, эти же растворители с добавкой водного раствора аммиака). Извлечение аналитов из плазмы крови с применением сверхсшитого полистирола Purosep 200 осуществляли по следующей схеме:
110
Достигнутые степени извлечения аналитов оказались более высокими, чем в случае ЖЖЭ: 98±2% для капецитабина и 84±1% для 5-фторурацила. Кроме того, значения коэффициентов вариации для 12 образцов плазмы крови различных доноров оказались гораздо ниже в случае сверхсшитого полистирола (табл.17).
Таблица 17. Сопоставление коэффициентов вариации матричных факторов при жидкостной экстракции и сорбционном концентрировании на сверхсшитом полистироле на примере капецитабина и 5-фторурацила
Аналит
Коэффициент вариации CV, % (n=12)
Жидкостная экстракция (этилацетат)
ТФЭ (ССП)
Капецитабин 13,2 0,9 5-фторурацил 8,4 1,5
Однако применение сверхсшитого полистирола Purosep 200 при проведении исследования биоэквивалентности оказалось невозможным из-за необходимости ручной набивки сорбционных патронов для экстракции. При количестве более
1500 образцов плазмы крови для исследования биоэквивалентности этот недостаток оказывался критичным. Поэтому выбор был сделан в пользу ЖЖЭ этилацетатом.
Кондиционирование
1 мл метанола
1 мл воды
Загрузка пробы
плазма крови (рН 6.5)
1М‐ный раствор HCl
Промывка
1 мл воды
Элюирование
5%‐ный раствор аммиака в
ацетонитриле
Выпаривание
30 мин в токе N
2
, 30°С
Растворение и анализ
500 мкл воды
Скачать 2.29 Mb.