Нивелирование влияния биологической матрицы при определении лекарственных препаратов в плазме крови методом хроматомассспектрометрии
 Скачать 2.29 Mb.
|
|
ГЛАВА IV. ВЫЯВЛЕНИЕ И НИВЕЛИРОВАНИЕ МАТРИЧНОГО ВЛИЯНИЯ, ВЫЗЫВАЮЩЕГО НАРУШЕНИЕ ЛИНЕЙНОСТИ ГРАДУИРОВОЧНОЙ ЗАВИСИМОСТИ IV.1. Матричный эффект при определении циклосерина в плазме крови Мешающее влияние матричных компонентов может проявляться не только в неудовлетворительной воспроизводимости результатов. Так, при разработке методики определения противотуберкулезного препарата циклосерина (рис. 51) в плазме крови обнаружен эффект нарушения линейности градуировочной зависимости на высоких концентрационных уровнях. Следует подчеркнуть, что это не было вызвано перегрузкой колонки или другими подобными причинами. Данный эффект проявлялся именно для образцов плазмы крови, в то время как для водных стандартных растворов линейность градуировки не нарушалась. В литературе имеется крайне мало работ, посвященных определению циклосерина в биологических жидкостях [132, 133]. Это, в первую очередь, обусловлено высокой полярностью молекулы циклосерина и, как следствие, сложностью применения обращенно-фазовой ВЭЖХ для его определения. При разработке процедуры извлечения циклосерина из плазмы крови опробованы различные варианты пробоподготовки: осаждение белков ацетонитрилом, жидкостно-жидкостная экстракция и сорбционное Структура ниацина Структура циклосерина Рис. 51. Строение циклосерина и ниацина (внутренний стандарт). 112 концентрирование. В серии предварительных экспериментов использованы различные элюирующие системы (метанол, ацетонитрил, их смесь с добавками уксусной кислоты и водного раствора аммиака) и сорбционные материалы. В случаях осаждения белков и жидкостно-жидкостной экстракции основными проблемами явились недостаточная селективность разделения и низкие степени извлечения. По этим же причинам не подошли такие сорбенты как C18 и слабый катионит Oasis WCX. В конечном итоге, предпочтение было отдано процедуре сорбционного концентрирования на катионообменном сорбенте Oasis MCX, который представляет собой полимер со смешанной обращенно-фазовой и катионообменной функциональностью (рис.52). На поверхности полимерного сорбента расположены сильные катионообменные сульфо-группы, которые позволяют ему проявлять избирательность к основным веществам. При разработке процедуры сорбционного концентрирования циклосерина из плазмы крови мы столкнулись с проблемой: не удавалось получить удовлетворительные степени извлечения аналита с этого сорбента. В серии предварительных экспериментов с водными стандартными растворами показано, что это, вероятно, вызвано достаточно сильными взаимодействиями молекул аналита с сорбентом. Элюировать аналит не удавалось ни одной из опробованных элюирующих систем (5%, 8%, 15% раствор аммиака в метаноле и в ацетонитриле, табл.18). Рис.52. Строение сорбента Oasis MCX. 113 Для решения проблемы применен прием дезактивации функциональных групп [134]. При загрузке образца при pH<3 молекулы циклосерина взаимодействуют с катионообменным сорбентом за счёт наличия в молекуле катионных центров (pK a циклосерина и ниацина составляет 4.2 и 4.8 соответственно). При элюировании с сорбента смывается лишь незначительная часть молекул аналита, либо не смывается вовсе ничего из-за большого количества свободных функциональных SO 3 ¯ -групп. Как следствие – невысокие степени извлечения (Рис.53, а). Если перед загрузкой образца пропустить через сорбент аммонийно- формиатный буфер, ионы аммония NH 4 + будут причиной частичного перевода сорбента в аммонийную форму (Рис.53, б). При последующей загрузке образца молекулы циклосерина взаимодействуют лишь с остаточными SO 3 ¯ - группами, не перешедшими в аммонийную форму. При элюировании раствором аммиака в метаноле молекулы аналита не удерживаются на сорбенте и вытесняются ионами аммония. Таким образом удаётся значительно повысить степень извлечения. Подобный прием эффективен и прост в случае, когда не удается элюировать аналит из-за его прочного связывания с сорбентом. Таблица 18. Степени извлечения при использовании различных элюирующих систем Элюирующая система Степень извлечения, % CH 3 OH 1,8±0,1 CH 3 OH + 5% NH 3 ·H 2 O 9,0±0,1 CH 3 OH + 8% NH 3 ·H 2 O 10,4±0,6 CH 3 OH + 15% NH 3 ·H 2 O 11,8±0,1 CH 3 CN 0,9±0,2 CH 3 CN + 5% NH 3 ·H 2 O 8,0±0,5 CH 3 CN + 8% NH 3 ·H 2 O 8,5±0,1 CH 3 CN + 15% NH 3 ·H 2 O 10,5±0,3 114 Установлено, что на степень извлечения можно влиять путем изменения концентрации буферного раствора (рис.54) или его природы (формиат и ацетат аммония, например). Если концентрация буфера мала (10 мМ раствор), остается много доступных функциональных групп для взаимодействия с молекулами циклосерина. Если же концентрация буфера слишком велика (1М раствор), ионы аммония занимают все SO 3 ¯ - группы, и при загрузке образца молекулы аналита не задержатся на сорбенте. CYC CYC CYC CYC NH 4 + NH 4 + NH 4 + NH 4 + NH 4 + NH 4 + NH 4 + NH 4 + NH 4 + NH 4 + SO 3 ¯ SO 3 ¯ SO 3 ¯ SO 3 ¯ SO 3 ¯ SO 3 ¯ SO 3 ¯ SO 3 ¯ SO 3 ¯ SO 3 ¯ SO 3 ¯ SO 3 ¯ SO 3 ¯ SO 3 ¯ CYC CYC CYC CYC SO 3 ¯ SO 3 ¯ SO 3 ¯ SO 3 ¯ SO 3 ¯ SO 3 ¯ SO 3 ¯ SO 3 ¯ SO 3 ¯ SO 3 ¯ SO 3 ¯ SO 3 ¯ SO 3 ¯ SO 3 ¯ Рис. 53. Схематичное изображение взаимодействие молекул циклосерина с катионообменным сорбентом Oasis MCX без предварительного перевода сорбента в аммонийную форму (а) и с проведением этой процедуры перед загрузкой образца (б). Условные обозначения: – группа SO 3 ¯; – ион аммония NH 4 + ; – молекула циклосерина SO 3 ¯ CYC NH 4 + (а) (б) 115 Наиболее подходящим является промежуточный вариант. В данном случае при определении циклосерина экспериментально было установлено, что применение 100 мМ формиатно-аммонийного буфера и использование 5%-ого раствора аммиака в метаноле в качестве элюирующей системы позволяет в несколько раз увеличить степень извлечения циклосерина (табл.19). Итоговая схема пробоподготовки плазмы крови для определения циклосерина выглядит следующим образом: сорбент Oasis MCX кондиционировали метанолом и формиатно-аммонийным буфером, затем загружали образец плазмы крови, в который добавлен тот же буфер и муравьиная Таблица 19. Сравнение степеней извлечения (%) циклосерина из плазмы крови (n=10) при сорбционном концентрировании на сорбенте Oasis MCX с использованием приема дезактивации функциональных групп и без него Без перевода сорбента в аммонийную форму С предварительным переводом сорбента в аммонийную форму Степень извлечения, % 9,0±0,1 77±2 Рис.54. Влияние концентрации формиатно-аммонийного буфера на степень извлечения циклосерина из плазмы крови. 116 кислота для достижения необходимого значения рН (2.5). После загрузки пробы сорбент промывали водой и раствором соляной кислоты. Элюировали циклосерин и внутренний стандарт раствором аммиака в метаноле. Элюат выпаривали в токе азота, после чего сухой остаток растворяли в смеси метанола и пропанола-2 с добавкой трифторуксусной кислоты. Специальный блок экспериментов посвящен поиску условий хроматографического определения циклосерина. Проведенные предварительно хроматографические эксперименты на обращенно-фазовых и различных модифицированных сорбентах (табл. 20) не привели к удовлетворительным результатам из-за отсутствия взаимодействий аналита с сорбентом вне зависимости от используемых добавок в состав подвижной фазы. Таблица 20. Опробованные хроматографические колонки при определении циклосерина в плазме крови Название колонки Характеристики YMС-Triart C18 100×2.1 mm, 3 μm YMC-Pack ODS-AQ 100×2.0 mm, 3 µm ReproSil-Pur C18-AQ 150×2 mm, 3 µm Atlantis dC18 100×2.1 mm, 3 µm Использование режима HILIC (Hydrophilic interaction liquid chromatography) – с разделением по механизму с полярными взаимодействиями – обеспечило достижение требуемого результата. Суть механизма данного режима изображена на рис. 55. В качестве стационарной фазы используется силикагель. Если подвижная фаза содержит большую долю воды (например, более 40%, объемн.), то взаимодействия полярных молекул с сорбентом ослаблены, поскольку имеет место конкуренция между молекулами воды и аналита за сорбционные центры силикагеля; в случае же, когда вода составляет лишь несколько процентов от состава подвижной фазы, взаимодействия между полярной молекулой аналита и сорбентом усиливаются. Это позволяет управлять хроматографическим 117 поведением, например, такой полярной молекулы как циклосерин. Первоначально в качестве подвижной фазы использовали смесь метанола и воды с добавкой трифторуксусной кислоты, однако время удерживания циклосерина было слишком большим (>10 мин). Использование пропанола-2 в качестве добавки в подвижную фазу позволило сократить время удерживания (4.4 мин для циклосерина и 4.9 мин для внутреннего стандарта), однако, форма пика была неудовлетворительной. Использование подвижной фазы с наилучшим найденным соотношением метанола и пропанола-2 и с pH 2,5, доведенным до этого значения трифторуксусной кислотой, позволило добиться приемлемой формы пика аналита, сохранив при этом время удерживания. Хроматографические условия представлены в табл. 20. Таблица 20. Хроматографические условия определения циклосерина Колонка YMC-Pack SIL-06, 150×4.6 mm; 3µm Подвижная фаза метанол/пропанол-2/0.15% трифторуксусная кислота, 67:28:5 (объемн.) Скорость потока 0.5 мл/мин Объем пробы 10 мкл – полярный компонент Рис.55. Механизм хроматографического режима HILIC. 118 При оценке матричного эффекта проведен анализ 12 образцов плазмы крови различных доноров. Значения коэффициента вариации не превысили 0,8%, что говорит об отсутствии влияния матрицы на определение циклосерина. Однако, несмотря на достигнутое, при построении градуировочной зависимости с использованием образцов плазмы крови наблюдался эффект нарушения линейности на верхних концентрационных уровнях (рис.56). Данный эффект обнаружен исключительно для образцов плазмы крови, в то время как для водных стандартных растворов линейность градуировочной зависимости не нарушалась. Это могло быть вызвано конкурентными процессами при ионизации между молекулами аналита и матричными компонентами. Данный эффект был устранен путем уменьшения объема вводимой пробы до 1 мкл, что позволило вносить меньшее количество матричных компонентов в ионный источник, тем самым положительно влияя на ионизацию молекул самого циклосерина (рис.57). Рис.56. Градуировочная зависимость при проявлении «эффекта нарушения линейности» при определении циклосерина в плазме крови. y = 0,4542 x + 0,213 R 2 = 0,9651 Рис.57. Градуировочная зависимость после устранения «эффекта нарушения линейности» при определении циклосерина в плазме крови. y = 1,0081 x + 0,072 R 2 = 0,9988 119 IV.2. Матричное влияние при определении ропинирола в плазме крови Проблема нарушения линейности, описанная в предыдущем случае, обнаружилась и при определении противопаркинсонического препарата ропинирола в плазме крови (рис.58). На рис. 59 сплошной линией обозначена линия тренда, вычисленная по методу наименьших квадратов. Пунктирная линия соединяет экспериментальные градуировочные точки. Как видно, при увеличении концентрации ропинирола линейность градуировочной зависимости нарушается. Однако, решение этой проблемы подобно предыдущему случаю оказалось неприемлемым ввиду крайне низкого требуемого предела определения ропинирола (10 пг/мл). В итоге, было решено отказаться от разработанной первоначально процедуры жидкостно- жидкостной экстракции в метил-трет-бутиловый эфир для извлечения ропинирола из плазмы крови в пользу сорбционного концентрирования. Предпосылками к этому решению служило предположение о том, что сорбционное концентрирование позволяет получать экстракты, наименее обремененные присутствием матричных компонентов по сравнению с ЖЖЭ. Рис. 58. Строение ропинирола и циталопрама (внутренний стандарт). Структура ропинирола Структура циталопрама 120 Ранее на примере методики определения циклосерина, было установлено, что избыточное содержание матричных компонентов в анализируемой пробе является главным фактором при проявлении «эффекта нарушения линейности градуировочной зависимости». Однако при разработке процедуры сорбционного концентрирования на сорбенте Oasis MCX для извлечения ропинирола из плазмы крови возникли трудности, аналогичные тем, которые мы наблюдали в предыдущем случае – при определении циклосерина: недостаточная степень извлечения аналита, связанная с очень сильными взаимодействиями молекул аналита с сорбентом. Проблема была решена путем применения приема предварительного перевода сорбента в аммонийную форму согласно логике, описанной ранее для циклосерина. Однако, применение формиатно-аммонийного буфера оказалось неприемлемым в данном случае, поскольку при его использовании аналит плохо удерживался на сорбенте на стадии загрузки образца. Вероятно, ионы аммония даже при малых концентрациях взаимодействовали с большинством y = 0,0006 x + 0,1401 R 2 = 0,8989 Рис.59. Градуировочная зависимость при проявлении «эффекта нарушения линейности» при определении ропинирола в плазме крови. 121 функциональных групп сорбента, что приводило к невозможности полного удерживания аналита при загрузке образца. Чтобы снизить активность взаимодействия ионов аммония с функциональными группами сорбента, в качестве буфера выбрали ацетат аммония вместо формиата на основании предположения о более высокой степени диссоциации формиата аммония по сравнению с ацетатом. Показано, что при использовании 100 мМ раствора ацетата аммония перед загрузкой на сорбент образца плазмы крови аналит удерживается на сорбенте полностью. После загрузки образца осуществляли промывку сорбента водой и метанолом для удаления мешающих компонентов плазмы крови, а затем проводили элюирование аналитов 5%-ым раствором аммиака в метаноле. Степень извлечения ропинирола и внутреннего стандарта составила, соответственно, 89±5% и 88±4% (n=10). Хроматографическое определение ропинирола также, как и в случае циклосерина, осуществляли в режиме HILIC с использованием хроматографической колонки YMC-Pack SIL-06, 100×2.1 mm; S-5µm. Однако подвижная фаза имела более простой состав: CH 3 CN:H 2 O 80:20 (объемн.) с добавкой 10 мМ формиата аммония. Разработанная процедура пробоподготовки плазмы крови для извлечения ропинирола с использованием сорбционного концентрирования на катионообменном сорбенте Oasis MCX применена и для построения градуировочной зависимости. Показано, что при таком варианте пробоподготовки наблюдавшийся ранее «эффект нарушения линейности» не проявляется (рис.60). 122 Еще одной особенностью разработки данной методики оказалось наличие на коммерчески производимых картриджах для сорбционного концентрирования неизвестных компонентов, способных коэлюроваться с ропиниролом и проявляться на хроматограмме в виде мешающего пика. Для доказательства источника этих мешающих компонентов через новый картридж с сорбентом пропускали 1 мл элюирующей смеси, элюат собирали, растворитель удаляли выпариванием в токе азота, сухой остаток растворяли в ацетонитриле и анализировали. Со временем удерживания ропинирола на хроматограмме обнаруживался пик, по площади в несколько раз превышающий пик ропинирола на уровне LLOQ. Для устранения мешающих компонентов перед началом проведения процедуры сорбционного концентрирования через сорбент пропускали 1 мл метанола и 1 мл 0.1M NaOH. После такой предварительной очистки картриджей мешающие пики на хроматограммах не регистрировались. Рис.60. Градуировочная зависимость после устранения «эффекта нарушения линейности градуировочной зависимости» при определении ропинирола в плазме крови. y = 0,0024 x + 0,0616 R 2 = 0,9981 123 ГЛАВА V. ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ НАЙДЕННЫХ МЕТОДИЧЕСКИХ РЕШЕНИЙ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ КЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ Все разработанные методики валидированы в соответствии с международными требованиями и апробированы нами в клинических исследованиях. V.1. Исследование общей токсичности при проведении изолированной перфузии легкого раствором цисплатина С применением разработанной методики определения цисплатина в плазме крови получены сравнительные данные, позволившие сопоставить общую токсичность при внутривенном введении и при перфузии изолированного органа (легкого) раствором цисплатина. На диаграмме (рис.61) представлены фармакокинетические кривые (зависимости концентрации лекарственного вещества в плазме крови от времени) для пациентов, подвергнувшихся перфузии. Пунктирной линией обозначено максимальное содержание цисплатина при внутривенном введении. Видно, что процедура изолированной перфузии позволяет добиться значительно меньших концентраций в плазме крови, а значит и снизить общую токсичность препарата. |