Нивелирование влияния биологической матрицы при определении лекарственных препаратов в плазме крови методом хроматомассспектрометрии
 Скачать 2.29 Mb.
|
|
Санкт-Петербургский государственный университет На правах рукописи ЯРОШЕНКО ДМИТРИЙ ВАДИМОВИЧ НИВЕЛИРОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ БИОЛОГИЧЕСКОЙ МАТРИЦЫ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ МЕТОДОМ ХРОМАТО-МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ Специальность 02.00.02 – АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата химических наук Научный руководитель – Доктор химических наук, профессор Карцова Людмила Алексеевна Санкт-Петербург 2014 2 ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ ............................................................................................................. 6 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ ......................................... 10 I.1. Требования к физико-химическим методам анализа при определении лекарственных препаратов в биологических жидкостях для клинических исследований .................................................................... 10 I.2. Масс-спектрометрические методы, применяемые при определении лекарственных препаратов в плазме крови .............................................. 13 I.2.1. Методы ионизации в ВЭЖХ-МС ........................................................ 14 I.2.1.1. Химическая ионизация при атмосферном давлении ................... 14 I.2.1.2. Электроспрей ионизация ............................................................... 16 I.2.2. Виды масс-анализаторов, используемых в ВЭЖХ-МС .................... 18 I.2.2.1. Квадрупольный масс-анализатор ................................................. 18 I.2.2.2. Ионная ловушка .............................................................................. 19 I.2.2.3. Времяпролетный масс-анализатор .............................................. 20 I.2.3. Тандемная масс-спектрометрия (MC) n ............................................... 21 I.3. Матричный эффект в масс-спектрометрии и способы его устранения ......................................................................................................... 25 I.3.1. Оценка матричного эффекта ................................................................ 28 I.3.2. Способы снижения и устранения матричного эффекта .................... 30 I.3.2.1. Выбор способа пробоподготовки биообъектов к анализу ......... 30 I.3.2.2. Выбор масс-спектрометрических условий .................................. 34 I.3.3.3. Использование внутреннего стандарта для устранения матричного эффекта ................................................................................. 36 I.4. Пробоподготовка плазмы крови к ВЭЖХ-МС анализу при определении лекарственных препаратов ................................................... 38 3 I.4.1. Осаждение белков ................................................................................. 40 I.4.2. Жидкостно-жидкостная экстракция .................................................... 42 I.4.3. Сорбционное концентрирование (твердофазная экстракция) .......... 44 I.4.3.1. Общие сведения о сорбционном концентрировании ................... 44 I.4.3.2. Использование сверхсшитого полистирола при сорбционном концентрировании ...................................................................................... 47 I.4.4. Последние достижения в области пробоподготовки плазмы крови к анализу при определении лекарственных препаратов ............................... 48 I.5. Валидация методик определения лекарственных препаратов в плазме крови ..................................................................................................... 52 I.5.1. Понятие валидации ............................................................................... 52 I.5.2. Валидационные критерии, предъявляемые к методикам определения лекарственных препаратов в плазме крови .......................... 53 I.5.2.1. Селективность определения ......................................................... 54 I.5.2.2. Нижний предел количественного определения ........................... 54 I.5.2.3. Линейный диапазон ........................................................................ 55 I.5.2.4. Правильность.................................................................................. 56 I.5.2.5. Повторяемость .............................................................................. 57 I.5.2.6. Матричный эффект ...................................................................... 58 I.5.2.7. Стабильность аналитов ............................................................... 58 ГЛАВА II. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ .............................................................................................. 61 II.1. Аппаратура ............................................................................................... 61 II.2. Реагенты .................................................................................................... 63 II.3. Приготовление стандартных растворов аналитов ........................... 64 II.4. Приготовление вспомогательных растворов .................................... 66 4 II.5. Характеристика анализируемого объекта ......................................... 68 II.6. Пробоподготовка плазмы крови к анализу ....................................... 69 II.6.1. Пробоподготовка плазмы крови при определении цисплатина ..... 69 II.6.2. Пробоподготовка плазмы крови при определении силденафила ... 69 II.6.3. Пробоподготовка плазмы крови при определении циклосерина ... 70 II.6.4. Пробоподготовка плазмы крови при определении ропинирола..... 70 II.6.5. Пробоподготовка плазмы крови при определении капецитабина и 5-фторурацила................................................................................................. 71 II.7. Условия хроматографического и масс-спектрометрического определения аналитов..................................................................................... 71 II.7.1. ВЭЖХ-МС условия определения цисплатина .................................. 71 II.7.2. ВЭЖХ-МС/МС условия определения силденафила ........................ 73 II.7.3. ВЭЖХ-МС/МС условия определения циклосерина ........................ 74 II.7.4. ВЭЖХ-МС/МС условия определения ропинирола .......................... 76 II.7.5. ВЭЖХ-МС/МС условия определения капецитабина и 5-фторурацила................................................................................................. 77 II.8. Валидационные характеристики методов .......................................... 80 II.9. Клинические исследования, выполненные с применением разработанных методик.................................................................................. 85 ГЛАВА III. ВЫЯВЛЕНИЕ И УСТРАНЕНИЕ МАТРИЧНЫХ ЭФФЕКТОВ, ПРИВОДЯЩИХ К НЕУДОВЛЕТВОРИТЕЛЬНОЙ СХОДИМОСТИ РЕЗУЛЬТАТОВ АНАЛИЗА ............................................... 87 III.1. Матричный эффект при определении цисплатина в плазме крови .............................................................................................................................. 87 III.2. Матричное влияние при определении силденафила в плазме крови ................................................................................................................. 101 5 III.3. Матричные эффекты при определении капецитабина и 5-фторурацила в плазме крови ................................................................... 108 ГЛАВА IV. ВЫЯВЛЕНИЕ И НИВЕЛИРОВАНИЕ МАТРИЧНОГО ВЛИЯНИЯ, ВЫЗЫВАЮЩЕГО НАРУШЕНИЕ ЛИНЕЙНОСТИ ГРАДУИРОВОЧНОЙ ЗАВИСИМОСТИ ..................................................... 111 IV.1. Матричный эффект при определении циклосерина в плазме крови ................................................................................................................. 111 IV.2. Матричное влияние при определении ропинирола в плазме крови ............................................................................................................................ 119 ГЛАВА V. ПРАКТИЧЕСКАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ НАЙДЕННЫХ МЕТОДИЧЕСКИХ РЕШЕНИЙ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ КЛИНИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ ............................................................................................ 123 V.1. Исследование общей токсичности при проведении изолированной перфузии легкого раствором цисплатина ................................................ 123 V.2. Исследования сравнительной фармакокинетики и биоэквивалентности при пероральном приеме ....................................... 124 ЗАКЛЮЧЕНИЕ ................................................................................................. 127 ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ ....................................................................... 129 ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ БИОМЕДИЦИНСКИЕ ТЕРМИНЫ ......................... 131 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ ............................................................................... 132 ПРИЛОЖЕНИЕ ................................................................................................. 150 Клинические исследования фармацевтических препаратов ............... 150 6 ВВЕДЕНИЕ Актуальность При разработке методик определения лекарственных препаратов в плазме крови часто возникают проблемы, связанные с мешающим воздействием биологической матрицы на масс-спектрометрическое определение аналитов. Выявление подобных проблем и поиск путей их устранения весьма актуальны. Это связано, в первую очередь, с бурным развитием фармацевтической промышленности и, соответственно, возросшим интересом научного сообщества к изучению лекарственных веществ в биологических жидкостях. Измерение концентрации лекарственных препаратов в биологических матрицах является важным аспектом получения фармацевтических данных. Они необходимы для регистрации в государственном реестре новых активных субстанций и дженериков. Результаты доклинических и клинических испытаний, включая исследования биоэквивалентности, используются для принятия важных решений, подтверждающих безопасность и эффективность лекарственного вещества. Стремительное развитие фармацевтической отрасли требует разработки комплекса современных высокочувствительных валидированных методик определения как новых лекарственных препаратов, так и дженериков. Высокий уровень требований к подобным методикам строго регламентирован на международном уровне [1]. Однако наличие даже самой современной аналитической аппаратуры не гарантирует успеха без грамотного выбора процедуры пробоподготовки в связи с многокомпонентностью биологических матриц. В современной практике определения лекарственных препаратов в биологических объектах наиболее предпочтительно использование методов ВЭЖХ и хромато-масс-спектрометрии. При этом компоненты биологической матрицы могут коэлюироваться с аналитами и обнаруживаться в виде различных 7 мешающих эффектов: подавление ионизации, усиление аналитического сигнала, плохая сходимость для биообразцов различных доноров и др. Большинство лекарственных веществ имеет высокую степень связывания с белками крови. Поэтому при изучении фармакокинетики определение лекарств рекомендуется проводить именно в плазме крови, которая имеет сложную матрицу, существенно отличающуюся по составу для разных доноров. Согласно международным рекомендациям Европейского Медицинского Агентства (EMA – European Medicines Agency) при использовании масс-спектрометрического детектирования матричный эффект должен быть оценен на образцах биологической матрицы не менее шести различных доноров. В большинстве публикаций, посвященных определению лекарственных веществ в плазме крови, проблема влияния матрицы не нашла должного освещения. Цель работы: установление влияния матричных эффектов на результаты хромато-масс-спектрометрического определения лекарственных препаратов (цисплатина, силденафила, циклосерина, ропинирола, капецитабина и 5-фторурацила) в плазме крови и поиск путей его устранения. В данной работе в качестве аналитов представлены следующие фармацевтические средства: цисплатин и капецитабин – противоопухолевые препараты; силденафил – применяется при лечении эректильной дисфункции; циклосерин – антибиотик, включаемый в лекарственную терапию при лечении туберкулеза, ропинирол – средство против болезни Паркинсона. Их выбор обусловлен высокой терапевтической важностью и недостаточной изученностью. Для реализации цели необходимо было: 1. Провести градацию матричных эффектов при хромато-масс- спектрометрическом определении лекарственных веществ в плазме крови. 2. Выявить характер матричного влияния при ВЭЖХ-МС определении цисплатина, силденафила, циклосерина, ропинирола, капецитабина и 5 фторурацила в плазме крови. 3. Нивелировать матричные эффекты при определении всех упомянутых 8 лекарственных веществ. Научная новизна Предложен вариант устранения матричного эффекта, выражающегося в неудовлетворительной сходимости результатов для образцов плазмы крови различных доноров, при определении цисплатина в форме трехлигандного комплекса платины и диэтилдитиокарбамата (DDTC) – Pt(DDTC)3+; для обнаружения цисплатина в биологических жидкостях указанные аналитические формы применены впервые. Предложен способ устранения эффекта усиления аналитического сигнала при тандемном хромато-масс-спектрометрическом определении силденафила, основанный на выборе приемлемого осколочного иона (MRM-переход 475→58). Выявлена проблема нарушения линейности градуировочной зависимости, связанная с влиянием компонентов биологической матрицы на ионизацию в масс- спектрометрии, и предложены способы устранения указанного эффекта за счет снижения объема вводимой пробы при определения циклосерина и выбора сорбционного концентрирования катионообменном сорбенте Waters Oasis MCX для пробоподготовки плазмы крови при определении ропинирола. Применен прием перевода сорбента в аммонийную форму при сорбционном концентрировании циклосерина и ропинирола из плазмы крови на катионообменном сорбенте Waters Oasis MCX. В предложенном приеме ионы аммония используются в качестве конкурирующего агента, который снижает потенциальную возможность взаимодействия молекул аналита с сорбентом, что облегчает элюирование и позволяет увеличить степень извлечения аналитов. Установлено, что использование сверхсшитого полистирола PuroSep 200 при сорбционном концентрировании позволяет устранить матричный эффект подавления ионизации при одновременном определении капецитабина и 5 фторурацила в плазме крови, а также обеспечить высокие степени извлечения аналитов (98±2% – для капецитабина и 84±1% – для 5-фторурацила). 9 Практическая значимость работы Разработана и валидирована в соответствии с международными требованиями методика количественного хромато-масс-спектрометрического определения цисплатина в плазме крови. Предложенная методика применена при изучении общей токсичности при проведении изолированной перфузии легкого цисплатином (совместно с НИИ Онкологии им. Петрова). Разработаны и валидированы в соответствии с международными критериями методики определения силденафила, циклосерина, ропинирола, капецитабина и 5- фторурацила в плазме крови методом хромато-масс-спектрометрии. Все методики применены при проведении клинических исследований биоэквивалентности в биоаналитическом центре «ЦКП «Аналитическая Спектрометрия». Положения, выносимые на защиту 1. Способы устранения матричных влияний при хромато-масс- спектрометрическом определении цисплатина, силденафила, циклосерина, ропинирола, капецитабина, 5 фторурацила в плазме крови; 2. Перевод сорбента Waters Oasis MCX в аммонийную форму при сорбционном концентрировании как способ решения проблемы сильного связывания аналита с сорбентом при определении циклосерина и ропинирола. 3. Реализация найденных методических решений в фармакокинетических исследованиях лекарственных препаратов. 10 ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ I.1. Требования к физико-химическим методам анализа при определении лекарственных препаратов в биологических жидкостях для клинических исследований В научной литературе обсуждаются различные подходы и методы определения концентраций лекарственных средств в биологических жидкостях: xроматографические [2, 3, 4], спектрофотометрические [5], полярографические [6, 7], иммунологические (радиоиммунные, иммуноэнзимные) [8, 9] и др. Существует перечень обязательных требований, предъявляемых к методу анализа при проведении клинических исследований: чувствительность, экспрессность, точность, селективность, возможность работы с малым объемом биоматериала, стоимость анализа [10]. До недавнего времени для количественного определения фармпрепаратов в основном применяли такие высокоспецифичные и чувствительные методы анализа как радиоиммунный (РИА) [8] и иммуноферментный (ИФА) [9], обеспечивающие определение аналитов на уровне пикограмм. Долгое время они являлись практически единственными источниками информации о содержании препаратов в биологических жидкостях. В основе их лежит специфическая реакция антиген-антитело с реализацией принципа молекулярного распознавания [11, 12]. При этом селективность реакции антитела с конкретным лекарственным веществом не абсолютна: в присутствии соединений, имеющих близкое строение, антитело может вступать с ними в перекрестные реакции, что приводит к завышению результатов. Так, в [9] при определении 18-гидрокси-11-дезоксикортикостерона (18OH-DOC) и 18-гидроксикортикостерона (18OH-B) радиоиммунным методом в плазме крови наблюдались очень высокие значения относительных ошибок – до 88% (табл. 1). 11 |