Таблица 1. Содержание 18-OH-DOC и 18-OH-B в плазме крови при одновременном определении [9]
Аналит
День 1
День 2-3
День 4-7 нмоль/л ошибка нмоль/л ошибка нмоль/л ошибка
18OH-DOC 2.02±1.17 58%
3.27±1.20 37% 1.35±1.19 88%
18OH-B 14.60±5.98 41% 18.79±10.29 55% 8.74±5.38 62%
Применение микробиологических методов, как правило, ограничивается исследованием средств-антибиотиков. Наличие характеристических особенностей химического строения препаратов, например, присутствие амино- и гидроксигрупп в молекулах антибиотиков и иммунодепрессантов обуславливает возможность образования окрашенных комплексных соединений с солями тяжелых металлов, которые могут быть обнаружены спектральными методами.
Однако они не удовлетворяют условиям экспрессности определения [13].
Для решения задач терапевтического лекарственного мониторинга фармакокинетики и фармакодинамики используются высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) [3, 4], высокоэффективная тонкослойная хроматография (ВЭТСХ) [7], газовая хроматография (ГХ) [14], капиллярный электрофорез (КЭ) (рис.1) [15]
и электрохимические методы анализа (ЭХ)
[16].
12
Среди хроматографических методов наибольшее распространение при определении лекарственных препаратов получила
ОФ
ВЭЖХ со спектрофотометрическим и масс-спектрометрическим детектированием [17-19]
(рис.2).
Метод УФ детектирования в ВЭЖХ хоть и является наиболее распространенным, однако, его основное ограничение – недостаточная чувствительность при определении минорных концентраций лекарственных средств в сложной многокомпонентной матрице [20].
Такие задачи чаще решаются с использованием масс-спектрометрического детектора.
К достоинствам ВЭЖХ-МС можно отнести:
– возможность исследования более 95% всех лекарственных средств, используемых в современной фармакотерапии;
– возможность быстрого перехода от одной методики к другой без сложных предварительных действий;
– малый объем биоматериала, требуемый для анализа.
Рис.1. Электрофореграмма образца плазмы крови пациента после приема 50 мг препарата топирамата (TPR). В образец плазмы добавлено
25 мкг/мл внутреннего стандарта – габапентина (IS) [15].
13
Среди общего числа аналитических методов для определения
лекарственных препаратов в плазме крови доминирует метод ОФ ВЭЖХ с масс-
спектрометрическим детектированием.
I.2. Масс-спектрометрические методы, применяемые при
определении лекарственных препаратов в плазме крови
Масс-спектрометрия является физико-химическим методом анализа, в основе которого лежит перевод компонентов пробы в ионизированную форму с последующим разделением и регистрацией образующихся положительных или отрицательных ионов. Масс-спектр позволяет сделать заключение о молекулярной массе соединения, его составе и структуре. Для получения масс- спектра необходимо ввести образец в источник ионов, затем перевести его
Рис.2. Применение физико-химических методов при определении лекарственных препаратов в плазме крови за последние 10 лет (доли от общего числа работ).
14 молекулы в заряженную форму, разделить ионы по массам и зарегистрировать их массы и количество.
Принципиальная блок-схема масс-спектрометра представлена на рис.3. Для решения более сложных задач схема процесса также может оказаться значительно сложнее (например, использование тандемной масс-спектрометрии).
На сегодняшний день наиболее широко используемой разновидностью органической масс-спектрометрии
является хромато-масс-спектрометрия В этом случае системой ввода служит жидкостный хроматограф. Основной проблемой соединения жидкостного хроматографа и масс-спектрометра является большой объем растворителя, поступающего в ионный источник. Однако существуют различные интерфейсы, позволяющие преодолеть эту техническую сложность
[21].
I.2.1. Методы ионизации в ВЭЖХ-МС I.2.1.1. Химическая ионизация при атмосферном давлении Простейший вариант соединения жидкостного хроматографа с масс- спектрометром возможен, когда источник ионов работает при атмосферном давлении.
Принципиальная схема прибора представлена на рис. 4. Поток из колонки жидкостного хроматографа направляется в распылитель, где он превращается в
Рис.3. Блок-схема масс-спектрометра [21].
15 мелкодисперсный аэрозоль, смешиваясь с большим количеством нагретого газа
(обычно азот или воздух).
Капельки аэрозоля, окруженные потоком газа, перемещаются в область испарения, где в газовую фазу переходит большая часть молекул растворителя.
Далее на пути потока следует область ионизации. Поскольку в источнике поддерживается атмосферное давление, ионизация осуществляется либо за счет коронного разряда, либо при взаимодействии молекул с электронами, испускаемыми β-излучателями. По причине существенно большего количества молекул растворителя по отношению к молекулам определяемого вещества создаются условия химической ионизации. На выходе из источника ионов, где распологается ряд последовательных сепараторов с узкими входными отверстиями, происходит откачка легких молекул для снижения избыточного давления. В результате в работающий в условиях глубокого вакуума анализатор поступают в основном ионы аналита. Метод хорошо зарекомендовал себя для анализа небольших полярных и неполярных молекул (<1200 Да) [21].
Так в [22] подобный способ ионизации использовался для определения лекарственного препарата флутиказона – кортикостероидного компонента назального спрея.
Рис.4. Принципиальная схема источника ионов, работающего при атмосферном давлении [21].
16
I.2.1.2. Электроспрей ионизация
Электроспрей произвел революцию в масс-спектрометрии, выведя ее в
90-х гг. ХХ в. на новый уровень, сформировав практически не только органическую, но и биоорганическую и даже биологическую масс- спектрометрию. Этот тип ионизации чаще всего используется при определении лекарственных препаратов [23, 24].
Метод ионизации электрораспылением (electrospray ionization), в отличие от других масс-спектральных методов, основан не на предварительной ионизации анализируемых молекул, а на извлечении из растворов уже существующих ионов и заряженных комплексов, образующихся в результате взаимодействия молекул исследуемого вещества с растворителем и находящимися в нем солями или другими ионными соединениями (рис.5).
Электрораспыление включает три основные стадии:
̶ Собственно распыление, которое сопровождается образованием маленьких заряженных капель.
̶ Десорбцию ионов из этих капель в виде продуктов присоединения катионов к анализируемой молекуле или отщепления протона.
̶ Формирование в масс-спектрометре ионного пучка для анализа [25].
При ионизации электрораспылением положительно заряженные ионы образуются вследствие присоединения ионов Н
+
, K
+
, Na
+
или других катионов к
Рис.5. Схема источника ионизации электрораспылением [25].
17 молекуле, а отрицательно заряженные – при отщеплении протона или присоединении аниона.
Так, в [26] антибиотическое средство 3,6,9-триоксадециламид монензина А
(M-AM4) определяли масс-спектрометрически с ионизацией электрораспылением в виде аддуктов с Li
+
, Na
+
, K
+
. Образование таких аддуктов подтверждается наличием в масс-спектре трех сигналов – m/z 823, 839 и 855 (рис.6).
Помимо высочайшей чувствительности и возможности работы с нелетучими и термически нестабильными соединениями электроспрей обеспечивает возможность определять высокомолекулярные соединения за счет присоединения нескольких катионов (или анионов) к исследуемой молекуле. А поскольку анализатор масс-спектрометра делит ионы не по массам, а по отношению массы к заряду, ион с массой 5000 Да и зарядом 5, регистрируется как однозарядный ион с массой 1000.
Следует отметить, что фрагментация ионов, образующихся в условиях электроспрей ионизации, практически отсутствует, а масс-спектр представляет собой набор аналитических сигналов, обусловленных молекулярными ионами.
Рис.6. Масс-спектр смеси перхлоратов LiClO
4
, NaClO
4
и KClO
4
с
M-AM4 в соотношении 1:1:1:3 [26].
18
I.2.2. Виды масс-анализаторов, используемых в ВЭЖХ-МС Образовавшиеся в источнике ионизации ионы далее поступают в масс- анализатор. Существует несколько типов анализаторов; каждый имеет свои преимущества и недостатки.
I.2.2.1. Квадрупольный масс-анализатор Достоинствами этого анализатора масс являются быстрота сканирования, небольшие размеры и относительная дешевизна.
Квадрупольный масс- анализатор, часто называемый квадрупольным фильтром масс, состоит из четырех параллельных стержней круглого или гиперболического сечения (рис.7).
Рис.7. Квадрупольный масс-анализатор: 1 и 2 — входное и выходное отверстия анализатора; 3 — траектории ионов; 4 — генератор высокочастотного напряжения [27].
19
Противолежащие стержни соединены попарно, и между парами приложены постоянная и переменная высокочастотные разности потенциалов. Пучок ионов вводится в анализатор вдоль оси квадруполя через отверстие 1. При фиксированных значениях частоты и амплитуды переменного напряжения только у ионов с определённым значением m/z амплитуда колебаний в направлении, поперечном оси анализатора, не превышает расстояния между стержнями. Такие ионы за счёт начальной скорости проходят через анализатор и, выходя из него через выходное отверстие 2, регистрируются, попадая на коллектор ионов [27].
Тем не менее, при определении лекарственных веществ в сложных биологических жидкостях неизвестные компоненты матрицы могут иметь те же значения m/z, что и интересующие аналиты. В этом случае на хроматограмме будут регистрироваться дополнительные сигналы. В случае, если такие матричные компоненты будут коэлюироваться с аналитами, возможно возникновение ложноположительных сигналов.
I.2.2.2. Ионная ловушка
Основой ионной ловушки являются три электрода (рис.8): два концевых
(полюсных) гиперболической формы, обычно имеющие нулевой потенциал, и один кольцевой электрод между ними. Ловушка может удерживать ионы достаточно долгое время. Импульсная подача электронов в ловушку вызывает ионизацию молекул образца, а образовавшиеся ионы какое-то время удерживаются полем центрального электрода. Ионы же с заданным значением m/z способны покидать ловушку, попадая на электронный умножитель, в результате чего генерируется масс-спектр [21].
20
Возможность удаления мешающих ионов на разных стадиях ускорения и замедления движения ионов, индуцирование фрагментации ионов при их столкновениях с атомами гелия позволяют успешно использовать ионные ловушки при определении соединений с большой молекулярной массой
[28, 29] в режиме тандемной масс-спектрометрии, причем можно получить информацию о нескольких последовательных поколениях фрагментных ионов. Такая техника часто обозначается в литературе (MС)
n
[27].
I.2.2.3. Времяпролетный масс-анализатор
Этот тип анализатора масс основан на простейшем принципе: скорость разогнанных ионов обратно пропорциональна их массам. Ионы движутся в бесполевом пространстве в полой трубе и достигают места регистрации в порядке
Рис.8. Принципиальная схема ионной ловушки [21].
21 увеличения своей массы. Анализатор такого типа крайне прост, а его диапазон масс практически не лимитирован
На рис. 9 представлена схема линейного варианта времяпролетного анализатора. Ионы, образовавшиеся ионном источнике, ускоряются разностью потенциалов источником и сеткой по направлению к детектору. В области дрейфа происходит разделение ионов по скоростям (следовательно, по массам). Детектор регистрирует сигнал пучков ионов с одинаковым соотношением массы к заряду.
Следует отметить: на детектор поступают все ионы, что существенно улучшает чувствительность метода по сравнению со сканирующими анализаторами, в которых детектора достигает фактически менее одного процента ионов [21].
Однако, это несет в себе и негативный эффект – увеличивается и чувствительность к большому количеству неизвестных матричных компонентов, прошедших через анализатор. В случае, если они имеют такие же значения m/z, как и у аналитов, их присутствие может вызывать усиление аналитического сигнала и приводить к завышению результатов.
Времяпролетный масс-анализатор часто применяется в сочетании с предваряющей его ионной ловушкой, например, для изучения белков и установления аминокислотной последовательности [30].
I.2.3. Тандемная масс-спектрометрия (MC)
n
Мягкие методы ионизации (ХИ, электрораспыление) характеризуются интенсивными пиками молекулярных ионов, однако отсутствие фрагментации
Рис.9. Схема линейного времяпролетного масс-анализатора [27].
22 затрудняет установление структуры соединений. Одним из вариантов решения этой проблемы стало использование тандемной масс-спектрометрии. В настоящее время эта техника применяется со всеми описанными выше анализаторами и используется для анализа самых разных классов соединений.
Современный масс-спектрометр может работать по такому алгоритму: смесь химических соединений сначала разделяется на компоненты, а затем устанавливаются структуры этих компонентов (рис. 10).
Компоненты смеси ионизуются мягким методом. Образовавшиеся молекулярные ионы последовательно проходят через первый анализатор. В бесполевом пространстве их внутреннюю энергию повышают определенным образом, что вызывает фрагментацию. Второй анализатор позволяет получить масс-спектр индивидуального соединения.
Одним из самых распространенных вариантов активации является активация соударением или диссоциация, вызванная столкновениями. Она основана на высокой кинетической энергии ионов, разогнанных ускоряющим напряжением. В результате их столкновений с атомами инертного газа в
Рис.10. Принципиальная схема метода тандемной масс-спектрометрии [21].
23 бесполевом пространстве в камере соударений небольшая часть кинетической энергии переходит во внутреннюю. Приобретенной ионом внутренней энергии может оказаться достаточно для его распада по одному или нескольким направлениям.
Число возможных процессов, инициируемых соударениями, весьма велико [21].
Ниже представлено несколько наиболее вероятных из них:
, где m
+
– положительно заряженный ион, m
-
– отрицательно заряженный ион, m
0
– нейтральная частица.
Вероятность протекания того или иного процесса зависит от многих параметров, в том числе от кинетической энергии ионов
m+
, природы газа и давления в камере. Все многообразие возможных фрагментационных процессов характерно и для неизвестных компонентов биологической матрицы. Поскольку их количество в конечной пробе велико, а природа и свойства могут значительно варьироваться между образцами матрицы разных доноров, высока вероятность того, что некоторые неизвестные компоненты будут иметь такую же картину фрагментации, что и молекулы интересующих аналитов. В этом случае матричные компоненты могут вносить существенный вклад в величину аналитического сигнала, что будет проявляться в завышенных или ложноположительных результатах.
Наглядно продемонстрировать возможности МС/МС можно на примере прибора с системой трех квадруполей [31, 32]. Принципиальная схема такого масс-спектрометра представлена на рис.11 (а), а варианты работы на нем – на рис.11 (б, в).
В результате ионизации мягким методом (например, электроспрей) образуются устойчивые молекулярные ионы МН
+
. Если сканировать напряжение на одном из квадруполей, а другие использовать в режиме пропускания всех
24 ионов, получится классический масс-спектр, в котором присутствуют только пики молекулярных ионов. Для получения МС/МС спектра необходимо, чтобы тройной квадруполь работал следующим образом.
Первый квадруполь – в режиме пропускания молекулярных ионов МН
+
(при этом все ионы с другими массами погибнут на его стенках).
Второй квадруполь должен использоваться в качестве камеры соударений.
Через него проходят все ионы, а
также подается инертный газ, чаще всего гелий или аргон, для создания давления 10
-2
мм.рт.ст. Ионы МН
+
,
прошедшие через первый квадруполь, сталкиваются во втором квадруполе с молекулами газа. Эти столкновения направлены на инициирование процесса фрагментации, в результате чего на выходе из второго квадруполя формируются осколочные ионы, образовавшиеся при распаде части ионов МН
+
С помощью третьего квадруполя проводится сканирование, которое позволяет получить спектр соединения, содержащий информацию о массе основных структурных фрагментов [21].
Стоит отметить, что спектры дочерних ионов широко используются в структурных исследованиях. Дело в том, что совпадение таких спектров для
(а) (б) (в) Рис.11. а – принципиальная схема тройного квадрупольного масс- спектрометра, б – схема эксперимента для получения спектра дочерних ионов, в – схема эксперимента для получения спектра родительских ионов [21].
25 исследуемого иона и иона известной структуры является наиболее убедительным, доказательством идентичности структур этих ионов.
В современной аналитической химии наиболее часто для решения задач, связанных с определением лекарственных препаратов в сложных биологических матрицах (например, плазме крови) используют метод тандемной масс-спектрометрии. Он характеризуется наиболее высокой селективностью определения аналита и достаточно низкими пределами обнаружения для решения большинства задач биоаналитической химии. Тем не менее, сложность биологической матрицы может вызывать ряд проблем при определении лекарственных препаратов, а именно, подавление ионизации, усиление аналитического сигнала, плохая сходимость результатов для образцов матрицы различных доноров и др. I.3. Матричный эффект в масс-спектрометрии и способы его 
Скачать 2.29 Mb.