Нивелирование влияния биологической матрицы при определении лекарственных препаратов в плазме крови методом хроматомассспектрометрии
 Скачать 2.29 Mb.
|
|
устранения Статистический анализ показывает, что высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) в сочетании с источником ионизации при атмосферном давлении с масс-спектрометрическим детектированием является оптимальным методом количественного определения аналитов в различных биологических объектах. При этом компоненты биологической матрицы могут коэлюироваться совместно с определяемыми компонентами, влияя на процесс ионизации в масс- спектрометре [33], подавляя или усиливая ионизацию [34, 35]. Данный феномен впервые описан Kebarle и Tang в 1993 г. и получил название «матричный эффект». [36] Матричный эффект является причиной различий в откликах одного и того же определяемого компонента при сравнении подготовленных к анализу образцов в биологическом объекте и чистом растворителе [37, 38]. 26 В принципе, такие ионизационные эффекты могут иметь место как в жидкой, так и в газовой фазе и вызваны главным образом изменениями свойств капель раствора, обусловленными присутствием нелетучих или малолетучих соединений. Они и вызывают изменения в характере формирования и испарения капель, что, в конечном итоге, влияет на количество заряженных ионов, достигающих детектора [38, 39] Существуют различные версии механизма подавления ионизации, большинство из которых характерно для двух наиболее используемых хромато-масс-спектрометрических методов ионизации: электрораспылительной и химической ионизации (ХИ) при атмосферном давлении (АД). В [40] рассмотрены различные пути подавления сигнала. Этот эффект может быть обусловлен ограниченным количеством избыточного заряда, доступного каплям электроспрея, или насыщением поверхности капли молекулами определяемого компонента, что затрудняет выброс ионов, находящихся внутри капли. Эндогенные компоненты матрицы могут конкурировать с молекулами аналита за заряд на поверхности капли. [40] Согласно другой теории наблюдаемый эффект связан с увеличением вязкости и поверхностного натяжения капель, вызванного примесными соединениями, мешающими испарению растворителя. Это препятствует переходу определяемого компонента в газовую фазу [41]. Наконец, нелетучие вещества могут уменьшать эффективность образования самих капель за счет соосаждения определяемого компонента, что препятствует достижению каплями критического радиуса, необходимого ионам для перехода в газовую фазу. В случае химической ионизации при атмосферном давлении зачастую наличие ионной супрессии (подавления сигнала) не наблюдается. В отличие от электрораспылительной ионизации нет конкуренции между аналитами за переход в газовую фазу, поскольку нейтральные компоненты переходят в газовую фазу в результате испарения жидкости в потоке нагретого газа [38]. 27 В [42] показано, что при использовании химической ионизации при атмосферном давлении эффект подавления ионизации наблюдался только для одного из 14 протестированных стандартов, в то время как в режиме электрораспылительной ионизации подавление и усиление аналитического сигнала проявлялось в 12 случаях из 14. Тем не менее, матричный эффект может проявляться несмотря на использование ХИ при атмосферном давлении. В [43] при определении метамфетаминов в меконии при оценке матричного эффекта значения коэффициента вариации (см. раздел I.5.2.5) достигали 50%. Наблюдаемое подавление ионизации в случае ХИ можно объяснить влиянием состава образца на эффективность переноса заряда от коронного разряда иглы к определяемому компоненту. Другие возможные механизмы ионной супрессии при ХИ при атмосферном давлении объясняются образованием твердой фазы самого аналита или соосаждающихся нелетучих компонентов, присутствующих в образце [44]. Эффект подавления или усиления ионизации может быть вызван совместным элюированием компонентов, попадающих в ионный источник вместе с потоком жидкости [45]. Некоторые добавки в подвижные фазы, например, трифторуксусная кислота (ТФУ), влияют на отклик определяемого компонента. Способы снижения ионной супрессии обсуждаются в [39]: использование кислоты в качестве ион-парного агента, постколоночное введение смеси пропионовой кислоты и изопропилового спирта [46], добавка уксусной и пропионовой кислот в подвижную фазу, содержащую ТФУ. Кроме того, матричный эффект может быть вызван антикоагулянтами, а также полимерами, на основе которых сделана пластиковая посуда [47]. Таким образом, оценке и устранению матричного эффекта должно быть уделено особое внимание при разработке биоаналитического метода. В [33] подобный эффект даже определен как «ахиллесова пята» хромато-масс- спектрометрии. 28 I.3.1. Оценка матричного эффекта Предложено два пути оценки матричного эффекта: метод пост- колоночного введения [48] и пост-экстракционной добавки [49]. Первый позволяет количественно оценить матричный эффект и обнаружить хроматографическую область наибольшего влияния биологической матрицы. В этом случае насос обеспечивает постоянный поток раствора определяемого компонента на входе в ионный источник масс-спектрометра (рис. 12). Экстракт холостого образца плазмы дозируется в хроматографическую колонку в условиях, выбранных для проведения анализа. Поскольку определяемое соединение вводится в масс-спектрометр постоянным потоком, отклик аналита ВЭЖХ насос Устройство ввода Колонка Шприцевой насос раствор аналита → биологическая матрица после пробоподготовки ↓ Ионный источник МС/МС ↑ → %, интенсивность Время (мин) Рис.12. Схематичное изображение метода пост-колоночного введения биологической матрицы, подготовленной к анализу, для оценки матричного эффекта. Пунктирной линией обозначен сигнал определяемого компонента, сплошная линия показывает место ввода матричного экстракта [51]. 29 регистрируется как функция времени. Эндогенные компоненты биологической матрицы (фосфолипиды, белки и др.) также элюируются из хроматографической колонки и вносят изменения в отклик от вводимого аналита, что проявляется в подавлении или увеличении аналитического сигнала [50]. В таком случае невозможно количественно оценить влияние матричного эффекта. При этом если одним и тем же методом определяются сразу несколько соединений, соответствующие стандарты должны быть независимо введены в масс- спектрометр с целью изучения возможного матричного эффекта для каждого определяемого компонента. В случае варианта пост-экстракционной добавки (рис. 13.) матричный эффект количественно оценивается путем сравнения отклика определяемого соединения в чистом растворителе с соответствующим откликом того же соединения, добавленного в образец биологической матрицы после процедуры ее пробоподготовки [52]. В работе [53] понятие «абсолютный матричный эффект» определено как отношение аналитического сигнала определяемого соединения в образце экстракта биологической матрицы к отклику аналита в чистом растворителе. Однако, зачастую гораздо важнее знание относительного матричного эффекта, который определяется как матричный эффект между различными источниками биологической матрицы [53]. При этом он должен быть изучен на образцах биологической жидкости не менее, чем из шести различных источников. В качестве критерия оценки относительного матричного эффекта обычно используют точность между наклонами градуировочных кривых, полученных при использовании биологической матрицы из пяти различных источников. Принято считать, что метод практически не обременен этим эффектом, если относительное стандартное отклонение не превышает 3-4% [49]. 30 I.3.2. Способы снижения и устранения матричного эффекта I.3.2.1. Выбор способа пробоподготовки биообъектов к анализу Матричный эффект часто непосредственно связан с недостаточной очисткой исследуемого биологического образца. При этом уменьшение объема вводимой пробы или разбавление образца может резко сказаться на чувствительности метода [41, 54]. Таким образом, оптимизация процедуры очистки образца имеет первостепенное значение. ВЭЖХ насос Устройство ввода Колонка добавка аналита МС/МС биологическая матрица после пробоподготовки %, интенсивность Время (мин) Ионный источник Рис.13. Схематичное изображение метода пост-экстракционной добавки, используемого для оценки матричного эффекта. Пунктирной линией обозначен сигнал определяемого компонента в чистом растворителе. Сплошная линия отражает отклик определяемого компонента, добавленного в биологическую матрицу после ее пробоподготовки. Уменьшение площади пика говорит о подавлении ионизации [51]. 31 Наиболее простой и быстрый способ пробоподготовки биологического объекта – осаждение белков. Однако в этом случае полностью освободиться от матричного эффекта не удается. При анализе биологических образцов после процедуры осаждения белков может наблюдаться ионная супрессия, поскольку этот путь не позволяет эффективно удалять эндогенные компоненты биологической матрицы (липиды, фосфолипиды, жирные кислоты и др.). Коэлюирование таких соединений с определяемым компонентом влияет на процесс десольватации капель электроспрея [50, 52]. Элюаты, получаемые с использованием сорбционного концентрирования (ТФЭ), значительно чище. Это продемонстрировано в [54] на примере препарата атазанавира. На рис.14 сравниваются хроматограммы экстрактов при послеколоночном введении, полученные с помощью разных способов пробоподготовки. Видно, что для осаждения белков (А) наблюдается подавление сигнала на времени удерживания аналита (1,36 мин). В случае сорбционного концентрирования (Б) такого подавления нет. В [37] обсуждается влияние способа пробоподготовки и природы биологического объекта на матричный эффект при количественном хромато-масс- спектрометрическом анализе лекарственных препаратов с использованием метода пост-колоночного введения биологической матрицы, подготовленной к анализу, на примере морфина. Три вида биологических жидкостей (моча, слюна и плазма крови) были подвергнуты процедуре осаждения белков и ТФЭ. Установлено, что рассмотренные варианты подготовки пробы к анализу могут приводить как к уменьшению, так и к росту матричного эффекта [37]. В [55] при определении лекарственного препарата пипераквина в плазме крови обнаружено, что матричный эффект, наблюдаемый после проведения ТФЭ, в большей степени отвечает за подавление ионизации, чем фоновый шум плазмы. Остатки солей от буферных систем, используемых в ТФЭ, подавляли сигнал как пипераквина, так и его дейтерированного внутреннего стандарта. Однако это не отразилось на количественном определении пипераквина. 32 С другой стороны, следы триэтиламина, оставшиеся после выпаривания элюата, полученного в условиях ТФЭ, явились источником подавления сигнала для обоих определяемых соединений. Дейтерированный внутренний стандарт, являясь менее липофильным, чем аналит, элюировался раньше. Показано, что использование внутреннего стандарта, меченого стабильным изотопом, не компенсирует матричный эффект, если в образце присутствует триэтиламин, и даже может привести к отклонению от истинной концентрации до 50 %. Интенсивнос ть , % Время, мин Атазанавир (А) (Б) Интенсивнос ть , % Атазанавир Время, мин Рис.14. Хроматограммы экстрактов плазмы крови при пост- колоночном введении, полученных в результате осаждения белков ацетонитрилом (А) и сорбционного концентрирования на сорбенте LiChrosep Sequence (Б) с наложением хроматограммы атазанавира на верхнем уровне концентрации [54]. 33 Следовательно, его необходимо тщательно удалять перед перерастворением образца [55]. В [52] проведено сравнение различных способов пробоподготовки плазмы крови по чистоте получаемого экстракта, величине матричного эффекта и степени извлечения требуемых аналитов. Показано, что ацетонитрил является более предпочтительным органическим растворителем для осаждения белков, чем метанол. Однако процедура осаждения белков приводит к значительному подавлению ионизации для большинства соединений. Использование обращенно- фазовой или катионообменной ТФЭ привело к заметному снижению содержания фосфолипидов – основного источника матричного эффекта [52]. Наиболее эффективным вариантом пробоподготовки явилась катионообменная ТФЭ смешанного типа, сочетающая обращенно-фазовый и ионообменный механизмы удерживания, что позволяет достигать высоких степеней извлечения (>90%) полярных и неполярных соединений при минимальном значении матричного эффекта. Применение жидкостно-жидкостной экстракции (ЖЖЭ) также обеспечило получение экстрактов, практически не содержащих мешающих компонентов, однако в большинстве случаев степень извлечения полярных аналитов невелика. Существуют и другие способы пробоподготовки, например, микродиализ, основанный на принципе диализа через полупроницаемые мембраны. Подобные методики подготовки анализируемых образцов in vivo используются для контроля состава внеклеточной жидкости в различных тканях организма [51] и позволяют извлекать гидрофильные эндо- и экзогенные соединения (нейротрансмиттеры, пептиды, остаточные лекарственные препараты). Несмотря на то, что микродиализат представляет собой безбелковый водный раствор, в нем может содержаться большое количество солей (>150 мМ), вызывающих подавление ионизации определяемых компонентов [56]. Известно, что оптимизация условий хроматографического анализа (выбор условий градиентного элюирования, рН и состава подвижной фазы) позволяет существенно влиять на селективность разделения. 34 В [52] изучена зависимость матричного эффекта от кислотности подвижной фазы при определении фосфолипидов. Показано, что использование быстрого градиентного элюирования способствует повышению влияния матричного эффекта: ухудшается хроматографическое разделение определяемых соединений и эндогенных компонентов биологических сред. Еще один возможный способ устранения матричного эффекта – использование жидкостной хроматографии с участием гидрофильных взаимодействий (HILIC, hydrophilic-interaction liquid chromatography). Подобный режим сочетает использование силикагеля или полярных стационарных фаз с элюентами с высоким содержанием органических растворителей, что делает его весьма востребованным при определении полярных соединений в биологических объектах [57] и способствует устранению матричного эффекта в большей степени, чем применение обращенно-фазового режима [38]. I.3.2.2. Выбор масс-спектрометрических условий Согласно публикациям [45, 49, 58] масс-спектрометрия с химической ионизацией при атмосферном давлении менее восприимчива к матричному эффекту, чем с электрораспылительной ионизацией. Так, в [58] на примере метадона продемонстрировано значительное подавление ионизации при вводе образца плазмы крови после осаждения белков и образца плазмы, разбавленного в 2 раза водой (Рис.15, А). В случае введения тех же образцов в режиме химической ионизации при атмосферном давлении (Рис.15, Б) такого значительного проявления влияния матрицы не наблюдалось. Тем не менее, эта проблема полностью не исключена [37], [59]. В [43] проведена сравнительная оценка обоих видов ионизации при совместном определении десяти соединений ряда амфетаминов в меконии. 35 Выбран метод химической ионизации при атмосферном давлении. Но даже при использовании этого варианта ионного источника матричный эффект наблюдался для большинства аналитов и внутренних стандартов на всех протестированных концентрационных уровнях, при этом его значения правильности варьировались от 85,2 до 149,4%. В [51] показано, что в случае капилляров или колонок с очень малым внутренним диаметром (<0,5 мм) методы электрораспылительной ионизации оказываются менее восприимчивы к присутствию в пробе мешающих компонентов биологической матрицы. Матричный эффект в диализате был оценен на различных концентрационных уровнях окскарбазепина и его главного метаболита с использованием микроколоночной, капиллярной и нано-ВЭЖХ-МС/МС систем [51, 60]. Отмечено, что при низкой скорости потока уменьшается размер заряженных капель и снижается объем растворителя, который необходимо испарить для перехода ионов в газовую фазу. Это приводит к уменьшению концентрации примесей [60, 61]. В [62] наблюдалось подавление ионизации, вызванное матричным эффектом, при введении плазмы крови и мочи в условиях традиционной ВЭЖХ. Рис.15. Сравнение электрораспылительной ионизации (А) и химической ионизации при атмосферном давлении (Б) в пост-колоночном режиме [58]. 36 Напротив, при определении пяти препаратов класса антидепрессантов в тех же биологических объектах методом капиллярной ВЭЖХ матричный эффект не был выявлен [63]. I.3.3.3. Использование внутреннего стандарта для устранения матричного эффекта В качестве внутреннего стандарта можно использовать либо вещество, близкое по структуре к определяемому компоненту, либо стандарт, меченый стабильным изотопом. Однако биологическая матрица может по-разному влиять на внутренний стандарт-аналог и само определяемое соединение. Возможное решение данной проблемы – использование изотопно-меченого внутреннего стандарта, который коэлюируется с определяемым компонентом. Матричный эффект не должен влиять на относительную эффективность ионизации аналита и его меченого внутреннего стандарта. Изотопно-меченый внутренний стандарт – это соединение, имеющее такую же, как у определяемого компонента, структуру, где некоторые атомы в их молекулах заменены на стабильные изотопы: 2 H (D), 13 C, 15 N или 17 O. Важно, чтобы разница в массе определяемого соединения и меченого внутреннего стандарта была не менее 3 Да [64] во избежание вклада содержания природных изотопов в сигнал внутреннего стандарта. В [60] отмечено, что использование внутреннего стандарта, меченого стабильными изотопами ( 13 С 6 , 15 N), необходимо при количественном определении ангиотензина в образцах микродиализата мышиного мозга, поскольку при использовании структурного аналога норлейцина в качестве внутреннего стандарта необходимые значения точности и достоверности метода получить не удавалось. В то же время в [65] показано, что использование меченого внутреннего стандарта не всегда гарантирует постоянство соотношения площадей определяемый компонент/внутренний стандарт. При разработке метода определения мевалоновой кислоты в моче наблюдался очень большой матричный 37 эффект, зависящий от источника мочи и объема образца, взятого для экстракции. Кроме того, отношение откликов определяемого соединения и внутреннего стандарта изменялось относительно ожидаемого значения, указывая на то, что матричный эффект в разной степени влиял на аналит и на внутренний стандарт. В [66] установлено, что дейтерированный внутренний стандарт не всегда применим для компенсации наблюдаемого матричного эффекта. Замена углеродно-водородной связи на связь с дейтерием немного меняет липофильность молекулы и, следовательно, при использовании обращенно-фазовой ВЭЖХ может повлиять на разделение определяемого компонента и его дейтерированного внутреннего стандарта. Если при элюировании аналита и внутреннего стандарта наблюдается проявление сильного подавления ионизации в узком временном интервале, то небольшое различие в удерживании может вызвать проявление матричного эффекта [64]. 13 C-, 15 N- или 17 O-меченые внутренние стандарты могут оказаться более подходящими, чем дейтерированные, поскольку водород и дейтерий различаются по физическим свойствам гораздо сильнее, чем, например, 12 C и 13 C [67, 68]. При этом, даже если используется меченый внутренний стандарт, матричный эффект необходимо контролировать. Если гашение ионизации существенно уменьшит сигнал определяемого компонента и/или внутреннего стандарта, отношение сигнал/шум может достичь такого значения, когда точность и достоверность не попадут в допустимые пределы [39]. Дополнительные проблемы возникают, когда в биоаналитическом методе необходимо определение сразу нескольких компонентов. В этом случае требуется столько меченых внутренних стандартов, сколько компонентов определяется. Воздействие компонентов биологической матрицы при определении лекарственных препаратов значительно осложняет разработку методик и может существенно сказываться на достоверности получаемых результатов, что недопустимо при проведении клинических исследований. Несмотря на актуальность проблемы матричного эффекта, ей уделяется незаслуженно малое |