I.4. Пробоподготовка плазмы крови к ВЭЖХ-МС анализу при
определении лекарственных препаратов
Большинство аналитических приборов, и системы ВЭЖХ-МС, в частности, не имеют технической возможности определять малые количества лекарственных препаратов непосредственно при инжектировании образца.
Матрицы биологических объектов часто очень сложны. Отделить аналит от компонентов биологической матрицы (плазмы крови) и подготовить его к вводу в прибор – основные задачи, решаемые с помощью различных подходов пробоподготовки.
Наличие даже самой современной аналитической аппаратуры без грамотного выбора стратегии процедуры пробоподготовки не может гарантировать успеха при разработке методики определения лекарственного препарата в плазме крови. Это связано не только с предельно низкими концентрациями основных активных компонентов лекарственных средств (ЛС) и их метаболитов, но и с биологической активностью определяемых соединений, термолабильностью, многокомпонентностью матрицы образца, наличием оптических изомеров [69]. Именно поэтому правильный выбор процедуры пробоподготовки часто является ключевым моментом при разработке методики определения лекарственного препарата в плазме крови.
При проведении практически любого исследования подготовка пробы к анализу занимает наибольшее количество времени рис. 16. Кроме того, она является источником более 30% ошибок количественного определения аналитов.
39
61%
6%
27%
6%
Подготовка пробы
Отбор пробы
Анализ
Обработка данных
Рис. 16. Примерные затраты времени (%) исследователя при проведении анализа [70].
Таким образом, при выборе схемы подготовки проб к анализу необходимо учитывать не только его надежность и точность, но и такие факторы как простота эксплуатации, время, необходимое для выполнения процедуры.
Современными тенденциями в пробоподготовке являются миниатюризация, автоматизация, он-лайн соединение с аналитическим прибором, уменьшение расхода растворителей и увеличение скорости и безопасности (особенно при использовании потенциально инфекционных образцов биологического материала). Минимизация количества стадий при подготовке образцов необходима для снижения возможных ошибок, что приводит и к повышению точности. Автоматизированные методы пробоподготовки также весьма эффективны в плане экономии времени, улучшения воспроизводимости, но при этом включают и дополнительные расходы [70].
Кроме того, часто требуется количественное определение не одного аналита, а целой группы, что имеет место, например, при анализе в плазме крови действующего лекарственного препарата и его метаболитов [71-74]. Еще одной причиной необходимости определения группы аналитов в плазме крови является оптимизация комплексной терапии, когда пациенту назначают сразу несколько препаратов, концентрация которых контролируется [75-77].
Описаны примеры с одновременным определением 10 аналитов психотерапевтического действия [78], 13 противовоспалительных препаратов
40
[79],
15 противовирусных препаратов [80]. Соответственно, метод пробоподготовки должен учитывать химическую специфику всех аналитов.
Применение
метода внутреннего стандарта для количественного определения лекарственных препаратов в плазме крови уже давно считается стандартным приемом. Существуют общие стратегии выбора внутреннего стандарта: он должен иметь близкую по отношению к определяемым веществам структуру, сопоставимые коэффициенты распределения. Нередко применяют внутренние стандарты, меченые изотопными атомами [74, 77-85]. По сути, это – то же самое анализируемое вещество с массой, отличающейся на один или несколько Да. Их идентичное химическое поведение позволяет повысить воспроизводимость и снизить матричный эффект. Однако стоимость подобных стандартов довольно высока. Авторы [86
] предлагают синтезировать меченые внутренние стандарты непосредственно в лаборатории методом метаболической инкубации. Другой подход предложен в [87
], а именно: методика выбора дериватизирующих агентов, аналогичных определяемому аналиту, которые будут выступать в качестве внутренних стандартов. Метод получил название изотопно- кодовой дериватизации (ИКД) [87]. Применяют реагенты для мечения функциональных групп в аминах, карбоновых кислотах, тиолах, спиртах и др.
Выделяют три основных подхода при подготовке биологической матрицы к анализу: осаждение белков, жидкостно-жидкостная экстракция и сорбционное концентрирование (твердофазная экстракция).
I.4.1. Осаждение белков Биологические матрицы представляют собой сложные смеси эндогенных компонентов, таких как белки, соли, липиды, которые могут взаимодействовать с аналитами в процессе разделения и хроматографического определения. Белки, в значительных
количествах присутствующие в плазме крови, могут необратимо
41 адсорбироваться на хроматографической колонке, что приведет к ухудшению эффективности и резкому сокращению срока службы колонки.
Наиболее простой и быстрой процедурой удаления белков биологической матрицы является их осаждение различными реагентами [88-90]
Наиболее распространенными осадителями являются такие органические растворители как ацетонитрил [91-93],
метанол [76, 81], их смесь [80],
добавки в органические растворители кислот и щелочей [75].
Осаждение белков проводят и сильными кислотами: муравьиной [94]
и хлорной [95]. Применение такого приема позволяет удалить до 98% белков плазмы крови. Процедура осаждения белков является быстрой, недорогой и простой в исполнении и может быть применена для широкого спектра аналитов [58, 78].
Осаждение белков может также использоваться для образцов плазмы или сыворотки крови как стадия очистки, предваряющая жидкостно-жидкостную экстракцию или сорбционное концентрирование [95], [96]. После осаждения белков проводится центрифугирование и отделение надосадочного слоя, который и подвергается анализу. Экспрессность является одним из основных преимуществ данного подхода.
Однако, если требуются низкие пределы обнаружения аналитов, приходится проводить стадию концентрирования. Для этого растворитель из надосадочной жидкости выпаривают досуха и содержимое перерастворяют в меньшем объеме перед вводом в колонку [97].
Основным недостатком осаждения белков считают недостаточную степень извлечения. Так, в [98] отмечают, что степень извлечения аналита при осаждении белков обычно не превышает 60%, что вызвано соосаждением аналита с белками плазмы крови и сложностью биологической матрицы. Кроме того, эффекты влияния остаточных компонентов после осаждения белков (матричные эффекты) выявлены в ряде масс-спектрометрических исследований с электрораспылительной ионизацией. [99, 100]. В основном, это подавление сигнала аналита, приводящее к недостаточной чувствительности и несоответствию значений повторяемости и правильности экспериментов
42 установленным валидационным требованиям [42, 54, 79]. Именно эти недостатки ограничивают использование процедуры осаждения белков при разработке методик определения лекарственных средств в биологических жидкостях.
I.4.2. Жидкостно-жидкостная экстракция
Жидкостная экстракция (ЖЖЭ) – традиционный тип пробоподготовки, который отличается селективностью извлечения, несложной реализацией и невысокой стоимостью.
Чаще всего при разработке биоаналитической методики применяют наиболее простой – распределительный вариант жидкостно-жидкостной экстракции [101, 102]. Для этого к биологическому образцу, доведенному до необходимого значения pH, добавляют органический растворитель. После перемешивания органический слой отделяют, удаляют растворитель выпариванием и производят растворение в подходящем для анализа растворе.
Следует отметить, что важную роль при выборе экстрагента играют химические свойства аналита. Существует простой способ управления полярностью аналитов- кислот и аналитов-оснований с помощью рН. Ионизованные формы являются гораздо гидрофильнее их нейтральных аналогов. Вследствие этого следует ожидать большее сродство к органической фазе (высокое значение K
D
) в случае, когда аналит находится в нейтральном состоянии, и, соответственно, – слабое
(низкое значение K
D
), когда молекула аналита полностью ионизована (Рис.17).
43
При этом имеется и промежуточный диапазон, в котором сродство к той или иной фазе варьируется с изменением рН для частично ионизованных форм аналита. Описываемая кривая аналогична кривой титрования. Точка перегиба такой кривой находится при значении рН, при котором степень диссоциации составляет 50% - рКа. Кривые зависимостей «коэффициент распределения - рН» для кислот и оснований качественно являются зеркальными отображениями друг друга. В случае кислот следует ожидать увеличения сродства аналита к органической фазе при низких значения рН, а для оснований – при высоких [104].
Наиболее распространенными экстрагентами являются трет.бутилметиловый эфир [85, 105-108], этилацетат[74, 82, 109],их смеси с дихлорметаном [77, 110] илигексаном [54, 72]. Для переведения определяемого вещества в форму, необходимую для лучшего извлечения, используют различные подходы. Чтобы получить более щелочную среду применяют растворы гидроксида натрия [73, 106, 110] или аммония [85, 105]. Для подкисления плазмы до необходимого значения рН используют соляную [84] либо муравьиную кислоту [54].Широкое применение для этих целей нашли буферы: ацетатно- аммонийный [72],фосфатный [97].Считается, что именно буферы помогают
Рис.17. Зависимость коэффициента распределения от значения рН среды
[103].
44 нивелировать различие в кислотности плазмы крови различных доноров, что улучшает воспроизводимость при последующем анализе.
При всех преимуществах жидкостно-жидкостной экстракции у нее есть и ряд недостатков. К основным можно отнести трудоемкость, времязатратность и довольно большое количество манипуляций с образцом.
Тем не менее, эта процедура гораздо более селективна в сравнении с осаждением белков и позволяет достигать высоких степеней извлечения [54, 111,
112].
I.4.3. Сорбционное концентрирование (твердофазная экстракция)
I.4.3.1. Общие сведения о сорбционном концентрировании
Метод сорбционного концентрирования (ТФЭ) предложен более 20 лет назад и подобен колоночной хроматографии. Он основан на специфических взаимодействиях выделяемого соединения (или мешающих его определению компонентов матрицы) с сорбентом.
Типичная схема проведения сорбционного концентрирования приведена на рис.18. Перед началом процедуры сорбент в картридже сухой, поэтому требуется его специальная подготовка к работе. Кондиционирование сорбента проводят растворителем, близким по свойствам растворителю пробы.
Так, если проба является водной, то картридж кондиционируют водой. При использовании неполярных С18-сорбентов при проведении сорбционного концентрирования из водных образцов перед кондиционированием водой проводят так называемую «активацию» сорбента небольшим объемом органического растворителя: ацетонитрилом или спиртом.
После кондиционирования через картридж пропускают исследуемый образец. При этом иногда пробе придают определенную кислотность, как в жидкостно-жидкостной экстракции, для перевода аналита в необходимую форму. Чаще всего это подкисление фосфорной кислотой [113-115]или добавка фосфатного буфера с необходимым значением рН [116].
45
Вместе с молекулами аналита на сорбенте удерживаются и многочисленные примеси из биологической матрицы. На стадии промывки применяются растворители (вода, водно-органические смеси, подкисленные/подщелоченные растворы) для элюирования слабо связанных с сорбентом примесей.
Завершающей стадией является элюирование аналита с сорбента.
Элюирование стараются проводить как можно меньшим объемом растворителя, который, тем не менее, должен быть достаточным для извлечения целевых соединений с картриджа. При этом некоторые примесные компоненты могут оставаться на сорбенте. Чаще всего элюирование проводят метанолом [84,104,
116],
ацетонитрилом [114], добавляя к ним гидроксид аммония [117] или муравьиную кислоту [115] в зависимости от аналита. После завершения процедуры извлечения аналита полученный элюат выпаривают досуха и растворяют в подходящем растворителе, при необходимости осуществляя концентрирование. Иногда элюирование проводят подвижной фазой, чтобы сразу подвергнуть элюат анализу в колонке [54, 118].
Рис. 18. Общая схема проведения сорбционного концентрирования
[103].
46
Для достижения требуемых результатов свойства сорбента для сорбционного концентрирования должны отличаться от свойств хроматографической стационарной фазы. Например, сорбент смешанного типа или ионообменный для ТФЭ используется в сочетании с хроматографической колонкой С18. Такая комбинация увеличивает шансы на удаление нежелательных примесей [104].
Часто для заполнения картриджей используются сорбенты на основе силикагеля с иммобилизованными катионными [116] или анионными [104] функциональными группами. Одним из важнейших достоинств таких сорбентов является высокая скорость установления равновесия процессов сорбции и десорбции, позволяющих работать при достаточно быстром пропускания анализируемой пробы. Другим их преимуществом является постоянство объема сорбента при контакте с органическими и водно-солевыми растворами. Сорбенты на основе силикагеля не требуют длительного предварительного набухания и, после проведения кратковременной активации и кондиционирования (либо регенерации) снова готовы к работе.
HLB-картриджи представляет собой модифицированный полистистирол, обладающий одновременно свойствами гидрофильности и липофильности.
Аббревиатура HLB (Hidrophylic-Lipophylic Balance) в названии сорбента отражает два его важных уникальных свойства: способность оставаться увлажненным водой и способность удерживать широкий спектр полярных и неполярных молекул. Это один из наиболее популярных видов сорбентов для сорбционного концентрирования при анализе лекарственных препаратов в плазме крови [113,
114, 118].
В настоящее время техника сорбционного концентрирования может быть реализована как в виде отдельных картриджей, так и в автоматизированном
96-луночном формате [119, 120].
Для ТФЭ характерны более широкие возможности варьирования типов взаимодействий образца с сорбентом и элюентом, чем для жидкостной экстракции, вследствие чего появляются возможности более селективного и
47 количественного концентрирования и/или извлечения аналитов с участием специфических взаимодействий (ионообменные механизмы, сродство к органической фазе).
Кроме того, следует отметить, что при валидации биоаналитической методики применение сорбционного концентрирования практически полностью обеспечивает соответствие необходимым требованиям по повторяемости и правильности [54, 97]. Тем не менее, у этой процедуры есть и ряд недостатков, основными из которых являются трудоемкость и относительная дороговизна.
I.4.3.2. Использование сверхсшитого полистирола при сорбционном
концентрировании
Сверхсшитые полистиролы – уникальный нанопористый сорбционный материал. В основе получения сверхсшитых полистиролов лежит интенсивное связывание цепей полистирола жесткими мостиками. Три фундаментальных принципа образуют концепцию формирования сверхсшитых полимерных сетей
[121]. Прежде всего, связывание цепей полистирола должно быть статистически гомогенным, то есть сшивающие мостики должны распределяться случайным образом в конечной сети. Это достигается за счет однородности исходной системы, содержащей длинные полимерные цепи и сшивающий агент.
Согласно второму принципу полимер должен оставаться в сольватированном состоянии на протяжении всей реакции. Это значит, что используемый растворитель должен быть термодинамически «хорошим» (энергия взаимодействия растворителя с полимерными цепями превосходит энергию взаимодействия цепей между собой) как для исходных цепей, так и для конечной полимерной сетки. Для выполнения этого условия необходимо, чтобы сшивающий агент не изменял химической природы полимера, то есть имел близкие к нему состав и полярность. И, наконец, образующаяся структура полимера должна быть конформационно жесткой. Это достигается путем
48 интенсивного связывания довольно подвижных цепей полистирола при помощи негибких сшивающих агентов.
Отличительная способность сверхсшитых полистиролов набухать под действием любых органических жидкостей является следствием основного принципа формирования сети. Полимер получают за счет фиксации конформаций сильно сольватированных цепей полистирола при введении большого числа негибких связей между ними. Таким образом, в образующейся сети практически отсутствует внутреннее напряжение. При высушивании полимера происходит его сжатие, что вызывает сильное внутреннее напряжение. Поглощение любой органической жидкости приводит к расширению сети и возвращению ее в термодинамически выгодное состояние [121].
Из-за своей структуры
сверхсшитые полистиролы имеют развитую поверхность, в то же время способны выдерживать механическое воздействие и взаимодействовать с любой органической жидкостью независимо от ее природы и термодинамических характеристик. Основное преимущество такого типа сорбентов заключается в том, что его поры доступны для низкомолекулярных соединений и при этом недоступны даже для низкомолекулярных белков. По этой причине не требуется никой дополнительной пробоподготовки: плазма, сыворотка крови или моча могут быть нанесены на картридж непосредственно.
Благодаря этому сверхсшитые полистиролы обеспечивают высокую эффективность при анализе различных объектов, включая биологические.
I.4.4. Последние достижения в области пробоподготовки плазмы крови к анализу при определении лекарственных препаратов При анализе литературных источников, посвященных различным методам пробоподготовки плазмы крови, выделяя их преимущества и недостатки, можно составить обобщенную схему вариантов пробоподготовки (Рис. 19).
49
Рис. 19. Обобщенная схема вариантов пробоподготовки плазмы крови при анализе лекарственных препаратов [97].
Выбор стратегии пробоподготовки зависит как от химических свойств аналита, так и от умения исследователя оптимизировать процесс.
Одними из современных тенденций в пробоподготовке являются миниатюризация, автоматизация, он-лайн пробоподготовка.
Миниатюризация реализована в установках для микротвердофазной экстракции (МТФЭ). Она обычно выполняется с помощью волокон и капиллярных трубок с покрытием соответствующей неподвижной фазой.
Экстракции или адсорбция аналитов происходит на внешней поверхности волокна. В другом варианте картридж для МТФЭ представляет собой сменную иглу, которая изнутри заполнена определенным адсорбентом. Адсорбент находится в микрокартридже в верхней части иглы (Рис. 20).
50
Рис. 20. Примеры реализации МТФЭ [122].
Важным преимуществом МТФЭ является минимальная времязатратность. В распространенных методах экстракции – жидкостно-жидкостной экстракции и при сорбционном концентрировании – процедура извлечения аналитов продолжается, по крайней мере, 15-20 мин. В отличие от них, в методе МТФЭ экстракция занимает на порядок меньшее время, 1-2 мин. Для анализа биологических образцов, где объем пробы часто ограничен, МТФЭ подходит идеально: большое количество образца не требуется.
Автоматизация пробоподготовки реализуется как для осаждения белков, так и для экстракций обоих видов [123]. Автоматизация позволяет избежать грубых ошибок, увеличить производительность и надежность анализа, уменьшает влияние аналитика на результаты.
Одним из решений является он-лайн пробоподготовка. Она реализована как для ЖЖЭ с использованием мембран, так и для ТФЭ [122]. Методы он-лайн жидкостно-жидкостной экстракции основаны на диффузии аналитов из жидкой матрицы (фаза донора) к жидкой фазе акцептора. Мембрана обычно используется в качестве фазового разделителя или физического барьера. Подвижная фаза проходит через образец, аналиты поступают сразу в колонку. В качестве мембран выступают полые волокна, обеспечивающие низкое сопротивление потоку.
51
Он-лайн вариант ТФЭ в настоящее время достаточно распространен. Для ввода плазмы крови с определяемым веществом в систему необходимо предварительно провести процедуру осаждения белков [83, 97, 124
]. Общая схема проведения
он-лайн ТФЭ приведена на рис. 21. Сначала проба попадает в колонку для экстракции, затем подвижная фаза извлекает компоненты пробы и транспортирует их в хроматографическую колонку.
Рис. 21. Общая схема процедуры
он-лайн ТФЭ. (AS – автосамплер, DIL – разбавляющий насос, MS – масс-спектрометр). А – процедура ТФЭ, Б – элюирование [83].
Таким образом, миниатюризация, автоматизация,
он-лайн пробоподготовка позволяют снизить время анализа
лекарственного препарата в плазме крови, что
52 особенно актуально, когда в клиническом исследовании задействовано 500-2000 образцов.
Современная процедура пробоподготовки плазмы крови при определении
лекарственных препаратов должна быть не только простой в исполнении,
воспроизводимой и относительно недорогой, но и отвечать международным
требованиям, предъявляемым к биоаналитическим методикам, которые
применяются при проведении клинических исследований.
I.5. Валидация методик определения лекарственных препаратов в
плазме крови
I.5.1. Понятие валидации
Измерение концентрации лекарственных средств в биологических матрицах
(сыворотка, плазма, кровь, моча и слюна) является важным аспектом разработки фармацевтических препаратов. Эти данные необходимы для регистрации в государственном реестре новых активных субстанций и дженериков. Результаты доклинических и клинических испытаний, в том числе исследований биоэквивалентности, используются для принятия решений, подтверждающих безопасность и эффективность лекарственного вещества. Именно поэтому к разрабатываемым методикам определения лекарственных препаратов в биологических объектах предъявляются высокие требования, строго регламентированные на международном уровне. От этого зависит надежность получаемых результатов.
Валидация биоаналитических методик и анализ исследуемых образцов для клинических испытаний на людях должны проводиться в соответствии с требованиями надлежащей клинической практики (GCP, Good Clinical Practice).
Представленные ниже валидационные критерии полностью соответствуют
53 действующим рекомендациям Европейского Союза и международным правилам
[1].
Основная цель валидации методик – продемонстрировать ее надежность при определении концентрации аналита в биологической матрице (кровь, плазма, сыворотка, моча или слюна). Кроме того, если в исследуемых образцах плазмы крови используется антикоагулянт, валидация также должна быть выполнена с применением этого антикоагулянт.
Полная валидация должна быть проведена для каждого вида биологической матрицы в случае, если осуществляется параллельное определение лекарственного препарата сразу в нескольких биологических объектах.
I.5.2. Валидационные критерии, предъявляемые к методикам определения
лекарственных препаратов в плазме крови
Основными характеристиками биоаналитической методики являются: селективность, нижний предел количественного определения, линейный диапазон, повторяемость, правильность, матричный эффект, стабильность аналита (и внутреннего стандарта) в биологической матрице, в рабочих растворах и растворах хранения на протяжении всего периода исследования. Обычно требуется проводить определение одного аналита – лекарственного препарата. Но в случае, если исследование подразумевает определение двух веществ (например, аналит и его метаболит или изомер), принципы валидации применяются для каждого из аналитов.
При валидации методики и анализе клинических образцов, пробы биологической матрицы с добавками эталонных растворов интересующего аналита или внутреннего стандарта используются для получения градуировочных стандартов, образцов контроля качества (quality control, QC) и образцов для изучения стабильности.
54
I.5.2.1. Селективность определения
Выбранный аналитический метод должен позволять различать аналиты, внутренний стандарт, мешающие эндогенные компоненты матрицы или другие компоненты образца. Селективность определения должна быть подтверждена с использованием образцов матрицы не менее, чем из 6 различных источников, которые должны быть проанализированы индивидуально и оценены на предмет присутствия мешающих компонентов. Использование меньшего числа источников допустимо в случае труднодоступной биологической матрицы
(например, спинномозговая жидкость). Методика признается селективной, если отклик сигнала мешающих компонентов составляет менее 20% сигнала нижнего предела количественного определения и 5% – для внутреннего стандарта.
I.5.2.2. Нижний предел количественного определения
Нижний предел количественного определения (Lower Limit Of
Quantification, LLOQ) представляет собой наименьшую концентрацию определяемого вещества в образце, которая может быть количественно определена с приемлемой повторяемостью и правильностью. LLOQ считается градуировочным стандартом с самой низкой концентрацией. Кроме того, сигнал анализируемого образца LLOQ должен быть, по крайней мере, в 5 раз больше сигнала холостого образца и при этом адекватно соотноситься с ожидаемым нижним уровнем концентраций лекарственного препарата в реальных образцах клинического исследования.
При исследовании биоэквивалентности LLOQ должен быть не выше, чем
5% от максимальной концентрации (C
max
).
55
I.5.2.3. Линейный диапазон
Отклик прибора на концентрацию определяемого вещества должен быть известен и оценен в определенном концентрационном диапазоне.
Градуировочные стандарты следует готовить в той же матрице, что и образцы клинического исследования путем добавки эталонных растворов с известной концентрацией аналита.
В идеальном случае перед выполнением валидации аналитической методики должен быть известен ожидаемый диапазон концентраций. Этот диапазон должна полностью включать градуировочная кривая, определяемая LLOQ – самым низким по концентрации градуировочным стандартом, и верхним пределом количественного определения (Upper Limit Of
Quantification, ULOQ), являющимся градуировочным стандартом с самой высокой концентрацией. Концентрационный диапазон должен быть создан таким образом, чтобы обеспечить адекватное описание фармакокинетики определяемого вещества. При построении градуировочной кривой должны использоваться как минимум 6 уровней концентрации, холостой образец (матрица без добавки аналита и внутреннего стандарта) и образец матрицы с добавкой внутреннего стандарта). Для каждого градуировочного уровня повторно проанализируют не менее 3 образцов.
Для описания градуировочной кривой применяют зависимость, которая адекватно описывает отклик прибора на концентрации определяемых веществ. При расчете параметров градуировочной кривой холостой образец и образец матрицы с добавкой внутреннего стандарта не должны приниматься во внимание.
Для градуировочной зависимости рассчитывают ее параметры (наклон и свободный член в случае линейной аппроксимации). По уравнению градуировочной зависимости площади пика аналита от его концентрации (или отношения площадей от отношения концентраций для аналита и внутреннего стандарта)
вычисляются расчетные значения концентраций градуировочных стандартов, а также значения повторяемости и правильности для трех параллельных образцов на каждом градуировочном уровне. Расчетные значения
56 концентраций градуировочных стандартов должны быть в пределах ±15% от номинального значения, за исключением
LLOQ, для которого они должны быть в пределах ±20%. По крайней мере, 75% градуировочных стандартов для шести
(минимум) концентрационных уровней должны соответствовать этому критерию.
При повторных анализах необходимо, чтобы заданные критерии повторяемости (в пределах ±15% и ±20% для
LLOQ) выполнялись минимум для 50% протестированных градуировочных стандартов на каждый концентрационный уровень.
I.5.2.4. Правильность Правильностьаналитической методики
описывает близость определенного значения, полученного с ее помощью, к номинальной концентрации определяемого вещества (выраженную в процентах). Правильность оценивается на образцах с добавками известных количеств аналита – образцах контроля качества (QC-образцах,
quality control samples). QC-образцы должны быть получены независимо от градуировочных стандартов с использованием отдельно приготовленных эталонных растворов. QC-образцы анализируют, и рассчитанные по градуировочной кривой концентрации сравнивают с номинальным значением.
Правильность выражается в процентах от номинального значения и оценивается в рамках одной, а также между аналитическими сериями.
Внутри аналитической серии правильность определяют на основе единичных анализов 5 образцов для каждого из четырех концентрационных уровней:
LLOQ, уровень утроенного значения концентрации
LLOQ (нижний
QC), уровень приблизительно в середине градуировочного диапазона (средний
QC) и уровень не ниже 75% от верхней границы линейного диапазона (верхний
QC). Усредненная концентрация должна быть в пределах 15% от номинального значения для QC-образцов за исключением
LLOQ, для которого она должна быть в пределах 20% от номинального значения.
57
Для валидации правильности между аналитическими сериями LLOQ, нижний, средний и высокий QC-образцы анализируют не менее, чем в трех аналитических сериях, по крайней мере в 2 разных дня. Средняя концентрация для каждого уровня QC должна быть в пределах 15% от номинального значения, за исключением LLOQ, для которого она должна быть в пределах 20% от номинального значения.
I.5.2.5. Повторяемость
Повторяемостьаналитической методики описывает степень близости друг к другу результатов измерений для идентичных образцов. Повторяемость выражается в виде коэффициента вариации (coefficient of variation, CV) и должна быть продемонстрирована на LLOQ, нижнем, среднем и верхнем QC-образцах в рамках одной серии, а также между аналитическими сериями (аналогично правильности). Коэффициент вариации рассчитывается по формуле (1):
%
100
X
CV
,
(1) где
n
x
x
x
x
x
x
n
2 2
2 2
1
)
(
)
(
)
(
– среднеквадратическое отклонение.
Для валидации повторяемости внутри аналитической серии должно быть проанализировано не менее пяти проб с концентрациями на уровне LLOQ, нижнего, среднего и верхнего QC-образцов. Значение CV не должно превышать
15% для образцов контроля качества, за исключением LLOQ, где превышение не должно составить 20%.
При валидации повторяемости между аналитическими сериями оценка должна быть выполнена для концентраций LLOQ, нижнего, среднего и верхнего
QC-образцов, по крайней мере, в трех аналитических сериях, проанализированных минимум в два разных дня. Значение CV не должно превышать 15% для QC-образцов и 20% для LLOQ.
58
I.5.2.6. Матричный эффект Матричный эффектдолжен быть исследован при масс-спектрометрическом детектировании не менее, чем на 6 образцах биологической матрицы различных доноров. Объединение различных матриц для этой цели недопустимо. Для каждого определяемого соединения и внутреннего стандарта необходимо оценить матричный фактор (MF) для этих 6 матриц. Он вычисляется как отношение площади пика аналита в присутствии матрицы (
матрица после экстракции с добавлением в нее аналита) к площади пика в отсутствии матрицы
(чистый раствор аналита):
2 1
S
S
MF
,
(2) где S
1
– площадь пика для пробы с добавкой аналита в матрицу после её пробоподготовки,
S
2
– площадь пика для стандартного раствора аналита.
Матричный фактор, нормализованный на внутренний стандарт, определяется отношением MF аналита к MF внутреннего стандарта:
100
MF
MF
(%)
MF
д.
внутр.стан аналит норм
(3)
Значение CV нормализованных матричных факторов для 6 различных матриц не должно превышать 15%. Контроль матричного эффекта следует проводить на нижнем и верхнем уровнях концентраций [1].
Если лекарственный препарат содержит добавки (например, такие наполнители, как полиэтиленгликоль или полисорбат), отвечающие за матричные эффекты, последние должны исследоваться на образцах биологической матрицы, содержащей эти добавки.
I.5.2.7. Стабильность аналитов Стабильность аналитов необходимо оценивать во всех
условиях пробоподготовки и анализа проб, а также в условиях хранения.
59
Стабильность аналита в исследуемой матрице оценивается на нижнем и верхнем QC (из 5 параллельных проб для каждого уровня), которые определяются сразу же после приготовления и после хранения в соответствующих условиях.
Полученная концентрация (по градуировочной кривой) сравнивается с номинальной концентрацией. Рассчитанное значение концентрации на каждом уровне должно находиться в пределах ±15% от номинального значения.
Требуется, чтобы условия, используемые в экспериментах по определению стабильности, соответствовали и условиям при анализе образцов клинического исследования.
1)
Стабильность замораживания и размораживания. Образцы QC следует хранить при определенной температуре (-20°С) в морозильной камере в течение не менее 12 ч и разморозить без посторонней помощи при комнатной температуре. После полного размораживания образцы должны быть заново заморожены не менее, чем на 12 ч при тех же условиях. Число циклов замораживания-размораживания должно быть равно или больше, чем таких же циклов для образцов клинического исследования (обычно, 3 цикла)
2)
Краткосрочная температурная стабильность. Образцы QC необходимо разморозить при комнатной температуре, выдержать при этой температуре от 4 до 24 ч (в зависимости от ожидаемой продолжительности нахождения образца при комнатной температуре до исследования) и проанализировать.
3)
Долгосрочная стабильность. Время хранения образцов QC при оценке долгосрочной стабильности должно превышать время между датой получения первого образца и датой анализа последнего образца (обычно 1-2 месяца).
Приемлемым считается определение стабильности при -20°С или -70°С.
4)
Стабильность образцов после пробоподготовки в автодозаторе.
Образцы QC необходимо приготовить и проанализировать, после чего оставить в автодозаторе при определенной температуре (обычно +4°С или комнатной), выдержать от 4 до 24 часов и проанализировать повторно.
60 5)
Стабильность стандартных и рабочих растворов. Стабильность растворов хранения фармацевтических препаратов и внутреннего стандарта следует определять при комнатной температуре или в охлажденном состоянии в течение не менее 6 ч. После завершения требуемого срока хранения должна быть проверена стабильность по отношению к свежеприготовленным растворам путем сравнения откликов аналитического прибора.
Представленная работа направлена на освещение вышеперечисленных
проблем, поиск матричных эффектов и путей их устранения.
Скачать 2.29 Mb.