Практикум по бх. Практикум по биологической химии Для студентов лечебного и педиатрического

• Название: Практикум по биологической химии Для студентов лечебного и педиатрического
• Анкор: Практикум по бх.doc
• Дата: 28.01.2017
• Размер: 5.3 Mb.
• Имя файла: Практикум по бх.doc
• Тип: Практикум; #885
• страница: 19 из 38

Тема 9.2.
Внутриклеточный обмен жирных кислот
и триацилглицеролов

Актуальность

Триацилглицеролы (нейтральные жиры) – сложные эфиры глицерола и высших жирных кислот. Знание особенностей обмена нейтральных жиров необходимо для понимания метаболических сдвигов при голодании и мышечной работе, для изучения патогенеза таких заболеваний, как ожирение, сахарный диабет, атеросклероз.

Знакомство с методом определения в крови содержания триацилглицеролов позволяет использовать эти сведения для диагностики заболеваний, связанных с нарушением липидного обмена.

Цель

Изучение метаболизма триацилглицеролов и его регуляции. Транспортные формы триацилглицеролов.

Приобретение практических навыков определения качества пищевого жира, концентрации триацилглицеролов в крови и кетоновых тел в моче.

Вопросы для самоподготовки

1. 
   Реакции цикла трикарбоновых кислот, их связь с дыхательной цепью и выход энергии. Процесс окислительного фосфорилирования. Понятие дыхательного контроля.
   
2. 
   Характеристика синтеза жирных кислот из глюкозы по плану:
   

• 
  локализация и условия протекания процесса,
  
• 
  реакции образования ацетил SКоА из глюкозы,
  
• 
  роль цитрата в переносе ацетильной группы в цитозоль, его дальнейшие превращения,
  
• 
  реакция синтеза малонил-SКоА,
  
• 
  строение мультиферментного синтазного комплекса, химизм реакций, происходящих в комплексе,
  
• 
  конечный продукт синтеза,
  
• 
  участие витаминов и коферментов, источники НАДФН, роль "малик"-фермента,
  
• 
  регуляция процесса при участии гормонов инсулина, адреналина, глюкагона,
  
• 
  влияние АТФ, ацил-SКоА, малонил-SКоА, цитрата на реакции синтеза жирных кислот.
  

3. 
   Реакции синтеза глицерол-3-фосфата из глюкозы. Локализация и роль процесса.
   
4. 
   Реакции синтеза фосфатидной кислоты из жирных кислот и глицерол-3-фосфата по плану:
   

• 
  локализация в клетке,
  
• 
  источники глицерол-3-фосфата, жирных кислот и энергии,
  
• 
  последовательность реакций,
  
• 
  связь с обменом углеводов,
  
• 
  дальнейшие пути использования фосфатидной кислоты.
  

5. 
   Строение триацилглицеролов, их жирно-кислотный состав. Реакции синтеза триацилглицеролов (липогенез). Условия протекания липогенеза в печени и жировой ткани. Связь синтеза триацилглицеролов с обменом углеводов.
   
6. 
   Источники ТАГ в печени. Характеристика липопротеинов очень низкой плотности: их состав, апобелки, функция. Схема строения ЛПОНП. Условия, при которых образуются эти липопротеины. Утилизация ЛПОНП в тканях. Роль липопротеинлипазы.
   
7. 
   Сходство и отличие биосинтеза триацилглицеролов в жировой ткани и печени.
   
8. 
   Характеристика реакций липолиза по плану:
   

• 
  локализация и условия протекания процесса,
  
• 
  последовательность реакций и ферменты,
  
• 
  конечные продукты,
  
• 
  гормональная регуляция процесса,
  
• 
  транспорт и использование свободных жирных кислот, образующихся при липолизе.
  

9. 
   Гормоночувствительная липаза, роль аденилатциклазной системы в регуляции ее активности. Регуляция липазы гормонами адреналином, глюкагоном, кортизолом и инсулином. Аллостерическая регуляция активности ферментов липолиза и липогенеза.
   
10. 
    Реакции окисления глицерола до пирувата. Возможные пути метаболизма пирувата. Энергетический выход окисления пирувата в аэробных и анаэробных условиях.
    
11. 
    Реакции окисления жирных кислот до углекислого газа и воды:
    

• 
  роль карнитина в окислении жирных кислот,
  
• 
  локализация и условия протекания  окисления,
  
• 
  последовательность реакций  окисления и ферменты,
  
• 
  участие витаминов и коферментов,
  
• 
  конечные продукты,
  
• 
  связь с ЦТК и дыхательной цепью,
  
• 
  энергетический выход процесса,
  
• 
  расчет энергетической ценности -окисления пальмитиновой кислоты.
  

12. 
    Особенности обмена триацилглицеролов при некоторых физиологических состояниях (потребление пищи, голодание, мышечная активность). В чем особенность бурой жировой ткани?
    
13. 
    Причины нарушений обмена триацилглицеролов – ожирение, гиперлипопротеинемия I типа (гиперхиломикронемия) и V типа.
    
14. 
    Реакции синтеза кетоновых тел. Условия, локализация и роль процесса. Реакции утилизации кетоновых тел в тканях. Причины кетоацидоза при голодании и сахарном диабете. Роль дефицита оксалоацетата для активации кетогенеза.
    
15. 
    Определение кислотного числа жира. Принцип метода, его практическое значение и нормальные показатели.
    
16. 
    Исследование концентрации триацилглицеролов в сыворотке крови. Клинико-диагностическое значение и нормальные показатели.
    
17. 
    Обнаружение кетоновых тел в моче. Изучение концентрации кетоновых тел в моче. Принцип методов. Клинико-диагностическое значение и нормальные показатели.
    

ТЕМЫ ДЛЯ РЕФЕРАТИВНЫХ СООБЩЕНИЙ

1. 
   Белая и бурая жировая ткань. Распределение в организме и метаболические особенности. Роль в организме.
   
2. 
   Первичные и вторичные ацетонемические состояния у детей.
   
3. 
   Современные представления о роли L-карнитина в организме. Участие карнитина в пре- и постнатальном развитии ребенка. Предполагаемая роль карнитина в патогенезе синдрома "смерти в колыбели".
   

Лабораторная работа 1

Определение кислотного числа пищевого жира

Принцип

Кислотное число обозначает количество КОН (мг), необходимое для нейтрализации свободных жирных кислот, содержащихся в 1 г жира.

Материал исследования

Свежее и старое растительное масло.

Реактивы

1) 0,1 М р-р КОН, 2) 1,0% р-р фенолфталеина, 3) бутанол.

Проведение анализа

	Опыт 1,  мл	Опыт 2, мл
Свежее растительное масло Старое растительное масло Бутанол 1,0% раствор фенолфталеина	0,5 –– 0,5 1-2 капли	–– 0,5 0,5 1-2 капли
0,1 М раствор КОН	Титруют до светло-розового окрашивания, не исчезающего в течение минуты

Расчет

Кислотное число = , где

а – количество раствора щелочи (мл), израсходованное на титрование; 0,00561 – титр 0,1 М раствора КОН; б – объем жира (мл);
0,9 – плотность жира (г/мл); 1000 – коэффициент перевода мг в г.

Нормальные величины

Свежее растительное масло 1-3 ед

Практическое значение

Кислотное число жира отражает количество жирных кислот в пищевом продукте и используется для определения качества пищевого жира.

Изменение количества и состава пищевого жира при хранении носит название прогоркания жиров. Прогоркание жира обусловлено появлением в его составе летучих альдегидов, кетонов, жирных кислот невысокой молекулярной массы и нелетучих веществ перекисного характера.

Причиной прогоркания служат два вида факторов: биологические и химические. К группе биологических факторов относят микроорганизмы, осуществляющие превращение и гидролиз жирных кислот. Химическое прогорание (перекисное окисление липидов) связано с ультрафиолетовым облучением, тепловыми процессами, с окислением кислородом воздуха двойных связей жирных кислот, находящихся в составе триацилглицеролов и фосфолипидов.

Оформление работы

Записывают принцип метода, ход работы. Отмечают результаты для свежего и прогорклого растительного масла. Делают вывод об особенностях состава жирных кислот.

Лабораторная работа 2

Определение концентрации триацилглицеролов
в сыворотке крови

Принцип

Метод основан на использовании сопряженных ферментативных реакций, осуществляемых: 1) липазой, катализирующей гидролиз триацилглицеролов до спирта глицерола и жирных кислот; 2) глицеролкиназой, катализирующей фосфорилирование глицерола; 3) глицеролфосфат­оксидазой, окисляющей глицерол-3-фосфат в присутствии О₂ до диоксиацетонфосфата с образованием Н₂О₂; 4) пероксидазой, катализирующей в присутствии хлорфенола окисление перекисью водорода 4-аминоантипирина с образованием хинонимина, окрашенного продукта розового-малинового цвета.

Материал исследования

Сыворотка крови.

Реактивы

Рабочий реактив: раствор липазы, глицеролкиназы, глицеролфосфатоксидазы, пероксидазы, хлорфенола, 4 аминоантипирина в буферном растворе.

Стандартный раствор триацилглицерола (триолеат), 2,29 ммоль/л.

Проведение анализа

	Опыт, мл	Стандарт, мл
Сыворотка крови	0,03	––
Стандартный р-р триацилглицерола	––	0,03
Рабочий реактив	3,0	3,0
	Инкубируют 20 минут при 20-25°С, измеряют оптическую плотность опытной и стандартной проб против воды при 540 нм (зеленый светофильтр)

Расчет

Концентрация триацилглицеролов, ммоль/л = , где

Е_оп и Е_ст – оптическая плотность опытной и стандартной проб,
С_ст – концентрация стандартного раствора

Нормальные показатели

Сыворотка крови	дети	0,15-1,56 ммоль/л
	взрослые	0,45-1,71 ммоль/л

Клинико-диагностическое значение

Определение концентрации триацилглицеролов наиболее информативно для типирования первичного нарушения их обмена – гиперлипопротеинемий.

Повышение уровня триацилглицеролов наблюдается при ожирении, сахарном диабете, гипертонической болезни, ишемической болезни сердца, панкреатитах, хронической почечной недостаточности и нефротическом синдроме, гипотиреозе, атеросклерозе, алкоголизме.

Снижение концентрации триацилглицеролов отмечается при гипертиреозе, хронических обструктивных заболеваниях легких, терминальных стадиях поражения печени, синдроме мальабсорбции.

Оформление работы

Указывают принцип метода, ход работы, нормальные величины и результаты исследования, отмечают клинико-диагностическое значение показателя и делают выводы о возможной патологии.

Лабораторная работа 3

Обнаружение кетоновых тел в моче

Материал исследования

Нормальная моча и моча с ацетоном.

Реактивы

1) 10% р-р нитропруссида натрия, 2) 10% р-р NaOH, 3) р-р Люголя, 4) 5% р-р FeCl_3, 5) конц. CH₃COOH.

Качественная проба Легаля на ацетон и ацетоуксусную кислоту

Принцип

Метод основан на способности ацетона и ацетоуксусной кислоты в щелочной среде образовывать с нитропруссидом натрия комплексы оранжево-красного цвета, переходящие при подкислении раствора в соединения вишнево-красного цвета.

Проба более чувствительна к ацетоуксусной кислоте, чем к ацетону, с  гидроксимасляной кислотой реакция не идет.

Проведение анализа

	Опыт 1, капли	Опыт 2, капли
Нормальная моча Моча с ацетоном 10% р-р нитропруссида Na 10% раствор NaOH	10 –– 2 4	–– 10 2 4
	Появляется оранжево-красное окрашивание
Конц. CH3COOH	10	10
	При наличии кетоновых тел появляется вишнево-красное окрашивание. Если кетоны отсутствуют, то при подкислении цвет раствора переходит в желтый (происходит реакция на креатинин в моче)

Нормальные величины

Моча	отсутствие

Качественная проба Либена на ацетон

Принцип

Ацетон в щелочной среде в присутствии раствора Люголя (раствор йода в KJ) образует желтый осадок йодоформа, обладающего специфическим запахом.

Проведение анализа

	Опыт 1, капли	Опыт 2, капли
Нормальная моча Моча с ацетоном 10% р-р NaOH	20 –– 2	–– 20 2
Р-р Люголя	Добавляют до слабо-желтой окраски раствора.
	При наличии ацетона жидкость мутнеет вследствие выделения бледно-желтого осадка йодоформа, обладающего характерным запахом

Нормальные величины

Моча	отсутствие

Клинико-диагностическое значение

Кетоновые тела в моче (кетонурия) появляются при кетонемии, которая возникает при голодании, сахарном диабете, при повышении концентрации жиромобилизующих гормонов в крови.

Оформление работы

Записывают принцип методов, отображают получаемую окраску, присутствие (+) или отсутствие (–) кетоновых тел. В выводах указывают состояния, при которых в моче обнаруживаются кетоновые тела.

Название метода	Материал исследования		Результаты реакции	Наличие кетоновых тел
Проба Легаля	Моча	нормальная
		с ацетоном
Проба Либена	Моча	нормальная
		с ацетоном