Практикум по бх. Практикум по биологической химии Для студентов лечебного и педиатрического

• Название: Практикум по биологической химии Для студентов лечебного и педиатрического
• Анкор: Практикум по бх.doc
• Дата: 28.01.2017
• Размер: 5.3 Mb.
• Имя файла: Практикум по бх.doc
• Тип: Практикум; #885
• страница: 16 из 38

Тема 8.2.
Окисление глюкозы в анаэробных условиях.
Глюконеогенез

Актуальность

Гликолиз – центральный путь катаболизма глюкозы. В анаэробных условиях гликолиз – единственный процесс в организме, поставляющий энергию. Именно благодаря гликолизу организм может существовать в условиях гипоксии. В эритроцитах анаэробное превращение углеводов является единственным процессом, продуцирующим АТФ и поддерживающим их целостность и функции. В аэробных условиях гликолиз представляет собой начальную стадию расщепления глюкозы, завершающуюся аэробным окислением образовавшихся промежуточных продуктов.

Поддержание стабильного уровня глюкозы при физической работе или голодании обеспечивается реакциями глюконеогенеза. Это вносит вклад в снижение ацидоза при данных состояниях и обеспечивает глюкозой нервную ткань и эритроциты.

Цель

Изучение процессов гликолиза, спиртового брожения, глюконеогенеза, регуляции процессов распада и синтеза глюкозы.

Приобретение практических навыков по проведению количественного определения глюкозы в моче и сыворотке крови, молочной кислоты в гомогенате мышечной ткани.

Вопросы для самоподготовки

1. 
   Источники и пути превращения глюкозы в клетке. Роль глюкозо-6-фосфата в метаболизме глюкозы.
   
2. 
   Характеристика процесса гликолиза (молочно-кислое брожение) по плану:
   

• 
  локализация и условия протекания процесса,
  
• 
  последовательность реакций и ферменты,
  
• 
  конечные продукты,
  
• 
  участие адениловых нуклеотидов и энергетический эффект,
  
• 
  необратимые реакции гликолиза,
  
• 
  реакции гликолиза, сопряженные с потреблением АТФ,
  
• 
  реакции субстратного фосфорилирования, их сущность и значение,
  
• 
  гликолитическая оксидоредукция НАД⁺ и НАДН, ее сущность и значение.
  

3. 
   Характеристика процесса глюконеогенеза по плану:
   

• 
  локализация и условия протекания реакций,
  
• 
  субстраты (молочная кислота, глицерол, аминокислоты). Откуда поступают эти вещества?
  
• 
  последовательность реакций и ферменты,
  
• 
  реакции глюконеогенеза, сопряженные с потреблением ГТФ и АТФ,
  
• 
  необратимые реакции глюконеогенеза,
  
• 
  значение при голодании и физической работе,
  
• 
  расход энергии для синтеза одной молекулы глюкозы.
  

4. 
   Роль гликолиза и глюконеогенеза в метаболизме плода и новорожденных.
   
5. 
   Гормональная регуляция гликолиза и глюконеогенеза. Роль инсулина, адреналина, кортизола, глюкагона. Ферменты, регулируемые этими гормонами.
   
6. 
   Аллостерическая регуляция гликолиза и глюконеогенеза, роль АТФ, АДФ, АМФ, цитрата, жирных кислот, глюкозо-6-фосфата, фруктозо-6-фосфата, фруктозо-1,6-дифосфата, ацетил-SКоА. Регулируемые ферменты.
   
7. 
   Глюкозо-лактатный цикл (цикл Кори), его значение при физической работе. Источники молочной кислоты в организме.
   
8. 
   Глюкозо-аланиновый цикл, его значение при физической работе и голодании.
   
9. 
   Энергетический эффект окисления глюкозы в анаэробных условиях. Сравние энергетического эффекта анаэробного окисления глюкозы и распада гликогена до лактата.
   
10. 
    Спиртовое брожение: локализация процесса, специфические реакции, условия протекания реакций, последовательность реакций, энергетический эффект, конечные продукты. Сходство и отличие спиртового брожения и гликолиза.
    
11. 
    Метаболизм этилового спирта в печени при участии алкогольдегидрогеназы и ацетальдегиддегидрогеназы, последовательность реакций, конечные продукты. Энергетический эффект окисления одной молекулы этанола.
    
12. 
    Влияние этилового алкоголя на обмен углеводов в организме человека. Каковы причины гиперлактатемии и гипогликемии при алкогольной интоксикации?
    
13. 
    Синтез глюкозы из аланина, аспартата и глутамата. При каких условиях и где протекают реакции? В чем их значение?
    
14. 
    Глюкозооксидазный метод определения содержания глюкозы в сыворотке крови и моче. Принцип метода. Нормальные показатели. Клинико-диагностическое значение.
    
15. 
    Полуколичественный метод Альтгаузена определения содержания глюкозы в моче. Принцип метода. Нормальные показатели. Клинико-диагностическое значение.
    
16. 
    Как обнаружить молочную кислоту в мышечной ткани с помощью реакции Уффельмана?
    

ТЕМЫ ДЛЯ РЕФЕРАТИВНЫХ СООБЩЕНИЙ

1. 
   Молекулярный механизм развития алкогольной интоксикации. Причины повышенной чувствительности детей к алкоголю. Хронический алкоголизм. Клинико-лабораторная диагностика.
   
2. 
   Алкогольдегидрогеназа, катализируемые реакции, субстраты. Участие в биохимических и физиологических процессах. Изоферменты.
   
3. 
   Глюконеогенез и его значение в метаболизме плода и новорожденного. Гипогликемия новорожденных, критерии, причины возникновения.
   

Лабораторная работа 1

Глюкозооксидазный метод определения концентрации
глюкозы в сыворотке крови и моче

Принцип

Глюкоза с помощью глюкозооксидазы окисляется до глюконовой кислоты с образованием пероксида водорода. Пероксид водорода в присутствии хлорфенола при участии фермента пероксидазы окисляет краситель 4 аминоантипирин, превращая его в хинонимин, окрашенный продукт розово-малинового цвета. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию глюкозы и определяется фотоколориметрически.

Материал исследования

Сыворотка крови. Моча.

Реактивы

1) Рабочий реагент, содержащий фенол, глюкозооксидазу, пероксидазу, 4 аминоантипирин в калиево фосфатном буфере.

Стандартный раствор глюкозы, 5,5 ммоль/л.

Проведение анализа

	Опыт 1, мл	Опыт 2, мл	Стандарт, мл
Сыворотка крови	0,02	––	––
Моча	––	0,02	––
Стандартный раствор глюкозы	––	––	0,02
Рабочий реагент	2,0	2,0	2,0
	Инкубируют в течение 25 минут при 37°С. Измеряют оптическую плотность против воды при длине волны 540 нм (зеленый светофильтр)

Расчет

Концентрация глюкозы, ммоль/л = , где

Е_оп и Е_ст – оптическая плотность опытных и стандартной проб,
С_ст – концентрация стандартного раствора

Нормальные величины

Сыворотка крови	взрослые		3,3-5,8 ммоль/л
Моча		0,06 0,83 ммоль/л

Клинико-диагностическое значение

Сыворотка крови

Увеличение содержания глюкозы в крови наблюдается как при физиологических, так и при патологических состояниях.

Физиологические гипергликемии

К физиологическим гипергликемиям относится алиментарная, возникающая при одномоментном приеме больших количеств легкоусвояемых углеводов – моно- и дисахаридов, и нейрогенная, например, при стрессовых ситуациях в результате выброса в кровь больших количеств катехоламинов. Физиологические гипергликемии носят транзиторный характер и быстро проходят.

Патологические гипергликемии

Патологические гипергликемии, как правило, обусловлены нейроэндокринными расстройствами:

• 
  сахарный диабет, связанный с абсолютной или относительной инсулиновой недостаточностью,
  
• 
  заболевания гипофиза, сопровождающиеся повышенной секрецией в кровь соматотропина и кортикотропина (акромегалия, болезнь Иценко-Кушинга, опухоли гипофиза и др.),
  
• 
  опухоли мозгового слоя надпочечников, когда усилено образование катехоламинов (феохромоцитома),
  
• 
  опухоли коркового слоя надпочечников с усиленной продукцией глюкокортикоидов,
  
• 
  гиперфункция щитовидной железы, некоторые болезни печени (инфекционный гепатит, цирроз печени).
  

Снижение концентрации глюкозы в крови также может быть физиологическое и патологическое.

Физиологические гипогликемии

К физиологической гипогликемии относят избыточную секрецию в кровь инсулина в ответ на алиментарную гипергликемию; гипогликемию после тяжелой и длительной мышечной работы, при полном или частичном голодании. Гипогликемия может возникать у женщин в период лактации в результате усиленного поглощения глюкозы молочной железой. У новорожденных часто наблюдается гипогликемия, обусловленная резким прекращением поступления "материнской" глюкозы, незрелостью структуры печени и повышенной чувствительностью клеток к инсулину.

Патологические гипогликемии

Наблюдаются при гиперинсулинизме при гиперплазии  клеток островков Лангерганса (инсулинома, аденома и рак поджелудочной железы). Самая распространенная причина гипогликемий – передозировка инсулина. Кроме того гипогликемию вызывает недостаток гормона кортизола при гипофункции коры надпочечников (Аддисонова болезнь, опухоли надпочечников), гипофункции передней доли гипофиза (болезнь Симмондса), гипофункции щитовидной железы. Гипогликемия может возникать при токсических поражениях печени, гликогенозах, при заболеваниях почек вследствие глюкозурии.

Моча

См. ниже.

Оформление работы

Указывают принцип метода, ход работы, нормальные величины и результаты исследования, отмечают клинико-диагностическое значение показателя и делают выводы о возможной патологии.

Лабораторная работа 2

Полуколичественное определение концентрации глюкозы
в моче по Альтгаузену

Реактивы

1) 0,5%, 1%, 2%, 3% р-ры глюкозы, 2) 10% р-р NaOH.

Принцип

Глюкоза при кипячении в щелочной среде превращается в окрашенные продукты окисления (от желтого до темно-коричневого цвета). Интенсивность окраски прямо пропорциональна содержанию глюкозы.

Материал исследования

Моча нормальная и моча с глюкозой.

Проведение анализа

	Контроль, мл	Опыт 1, мл	Опыт 2, мл
Дистил. вода Моча нормальная Моча с глюкозой 10% р-р NaOH	4,0 –– –– 1,0	–– 4,0 –– 1,0	–– –– 4,0 1,0
	Помещают в кипящую водяную баню одновременно с калибровочными пробами (см. ниже) и прогревают до появления желтого или бурого окрашивания

Получение калибровочных проб

	Проба 1, мл	Проба 2, мл	Проба 3, мл	Проба 4, мл
0,5% р-р глюкозы 1% р-р глюкозы 2% р-р глюкозы 3% р-р глюкозы 10% р-р NaOH	4,0 –– –– –– 1,0	–– 4,0 –– –– 1,0	–– –– 4,0 –– 1,0	–– –– –– 4,0 1,0
	Прогревают все пробы (одновременно с опытными пробами) на кипящей водяной бане до появления интенсивного бурого окрашивания в пробе 4

Сравнивают окраску опытных пробирок и окраску калибровочных пробирок. Визуально определяют содержание глюкозы в моче (в %) по наиболее совпадающему цвету растворов.

Нормальные величины

Моча до 0,5%

Клинико-диагностическое значение

Моча

При нормогликемии глюкозурия может выявляться при повреждениях почечных канальцев – пиело- и гломерулонефриты, токсические поражения, почечный диабет (семейная почечная глюкозурия), нефропатии.

Однако чаще глюкозурия сопровождает гипергликемию, когда содержание глюкозы в крови превышает величину почечного порога (9,0-10,0 ммоль/л).

Глюкозурии могут быть физиологическими и патологическими.

Физиологические глюкозурии

К физиологическим относятся алиментарная глюкозурия, глюкозурия беременных и нейрогенная глюкозурия стрессовых состояний.

Патологические глюкозурии

Возникают чаще всего в результате нарушений обмена углеводов при патологических изменениях в поджелудочной железе (острый панкреатит, сахарный диабет), надпочечниках ("бронзовый" или стероидный диабет), также при тиреотоксикозе, акромегалии, инфаркте миокарда, кровоизлияниях во внутренние органы, отравлениях морфином, фосфором, при острых инфекциях и нервных заболеваниях.

Оформление работы

Указывают принцип метода, ход работы, нормальные величины и результаты исследования, отмечают клинико-диагностическое значение показателя и делают выводы о возможной патологии.

Лабораторная работа 3

Обнаружение молочной кислоты в мышечной ткани
с помощью реакции Уффельмана

Принцип

Метод основан на взаимодействии комплексного соединения фенолята железа фиолетового цвета с молочной кислотой с образованием лактата железа желто-зеленого цвета.

Материал исследования

Мышечная ткань.

Реактивы

1) Фосфатный буфер, рН 7,2; 2) 1% р-р фенола; 3) 1% р-р FeCl₃.

Проведение анализа

1. Приготовление экстракта мышечной ткани.

Кусочек мышечной ткани тщательно растирают в ступке с 5,0 мл фосфатного буферного раствора, перемешивают. Полученную мышечную кашицу фильтруют через 2 слоя марли или центрифугируют при 1500 об/мин.

2. Цветная реакция на молочную кислоту.

В пробирке к 10 каплям 1% раствора фенола добавляют 1% раствор FeCl₃ до появления фиолетовой окраски. Затем к содержимому пробирки добавляют 3 капли экстракта мышц и наблюдают за изменением окраски. В присутствии молочной кислоты фиолетовая окраска раствора переходит в желто-зеленую вследствие образования лактата железа.

Практическое значение

Молочная кислота является конечным продуктом катаболизма глюкозы в анаэробных условиях, небольшое количество лактата в мышце образуется и при аэробных условиях. Наработка лактата активируется при мышечной нагрузке как физиологического (физическая работа), так и патологического характера (нарушение кровообращения и гипоксия мышцы, приступ эпилепсии, столбняк, тетания).

При гипоксических состояниях, связанных с сердечной и легочной недостаточностью, при анемиях и нарушениях реологии крови производство молочной кислоты активируется в большинстве тканей.

Оформление работы

Указывают принцип метода, ход работы и результаты исследования, отмечают практическое значение показателя и делают выводы о возможной патологии.