Практикум по бх. Практикум по биологической химии Для студентов лечебного и педиатрического

• Название: Практикум по биологической химии Для студентов лечебного и педиатрического
• Анкор: Практикум по бх.doc
• Дата: 28.01.2017
• Размер: 5.3 Mb.
• Имя файла: Практикум по бх.doc
• Тип: Практикум; #885
• страница: 24 из 38

Тема 11.2.
Обмен железа. Гемопротеины.
Синтез и распад гема

Актуальность

Широкое разнообразие биологически важных функций гемоглобина и других гемопротеинов (например, цитохромов) вызывает необходимость изучения строения и роли этих белков в метаболизме. Состояния, связанные с нарушением синтеза и распада гема, приводят к развитию заболеваний крови и печени.

Цель

Изучение реакций синтеза и распада гема, метаболизма билирубина.

Освоение методов определения концентрации основных показателей пигментного обмена – гемоглобина в крови, билирубина в сыворотке крови, желчных пигментов в моче.

Вопросы для самоподготовки

1. 
   Обмен железа в организме: потребность, всасывание, транспорт, железо-связывающие белки, запасная форма. Пищевые источники. Симптомы и клинические проявления недостаточности железа. Понятие гемохроматоза.
   
2. 
   Функция указанных эритроцитарных белков – спектрин, гликофорин, белок полосы 3. Особенности окисления глюкозы в эритроците. Как осуществляется обезвреживание активных форм кислорода?
   
3. 
   Строение гема, реакции и основные этапы его синтеза. Регуляция синтеза гема и гемоглобина.
   
4. 
   Причины порфирий, их клинические проявления, основы лечения порфирий.
   
5. 
   Талассемии, их виды и причины.
   
6. 
   Строение наиболее представленных в организме гемсодержащих белков (гемоглобин, миоглобин, цитохромы, каталаза, пероксидаза). Их функция и локализация.
   
7. 
   Патологические и физиологические типы гемоглобина (метгемоглобин, серповидно-клеточный, гликозилированный гемоглобин, карбоксигемоглобин, оксигенированный гемоглобин, карбогемоглобин). Значение определения концентрации гликозилированного гемоглобина, оксигемоглобина и карбогемоглобина.
   
8. 
   Схема реакций, происходящих в эритроците в капиллярах легких и тканей.
   
9. 
   Механизмы транспорта углекислого газа. В каком виде переносится углекислый газ? Как он связывается с гемоглобином? Роль карбоангидразы. Роль эритроцита в изменении концентрации бикарбонат-ионов плазмы.
   
10. 
    Связывание гемоглобина с кислородом. Нормальная степень насыщения гемоглобина кислородом. Механизм транспорта кислорода. Влияние температуры, величины рН, концентрации СО₂ на сродство гемоглобина к кислороду, регуляция процесса. Кооперативность протомеров, эффект Бора, роль 2,3 дифосфоглицерата.
    
11. 
    Кривые насыщения гемоглобина кислородом или диссоциации гемоглобина. Чем объясняется S образный характер кривой диссоциации гемоглобина?
    
12. 
    Реакции распада гемоглобина и гема в ретикулоэндотелиальной системе.
    
13. 
    Непрямой (свободный) билирубин, его строение, реакции образования. Дальнейшая судьба непрямого билирубина.
    
14. 
    Прямой (связанный) билирубин, его строение, реакции образования, его дальнейшая судьба. Роль фермента УДФ-глюкуронил­трансферазы. Как выводятся конечные продукты распада гема?
    
15. 
    Состояния, связанные с избыточным распадом гемоглобина. Причины гемолитической желтухи и ее лабораторные критерии.
    
16. 
    Состояния, связанные с нарушениями оттока желчи. Причины обтурационной желтухи и ее лабораторные критерии.
    
17. 
    Состояния, связанные с недостаточностью функции гепатоцитов. Причины паренхиматозной желтухи и ее лабораторные критерии.
    
18. 
    Физиологические желтухи новорожденных.
    
19. 
    Патологические желтухи новорожденных:
    

• 
  гемолитические желтухи, их причины. Физиологические основы применения фенобарбитала;
  
• 
  наследственные нарушения выведения билирубина – синдромы Жильбера-Мейленграхта, Дубина-Джонсона, Криглера-Найара;
  
• 
  представление о приобретенных нарушениях выведения билирубина – избыток эстрогенов молока, инфекционные и токсические причины;
  
• 
  представление о механических желтухах вследствие муковисцидоза, болезни Нимана-Пика, гипоплазии желчных путей.
  

20. 
    Определение концентрации гемоглобина в крови гемоглобинцианидным методом. Принцип метода, нормальные величины, клинико-диагностическое значение.
    
21. 
    Определение содержания общего билирубина и его фракций в сыворотке крови. Принцип метода, нормальные величины, клинико-диагностическое значение.
    
22. 
    Обнаружение билирубина и желчных пигментов в моче. Принцип методов, нормальные величины, клинико-диагностическое значение.
    

ТЕМЫ ДЛЯ РЕФЕРАТИВНЫХ СООБЩЕНИЙ

1. 
   Железодефицитные состояния, их причины. Диагностика. Последствия. Лечение.
   
2. 
   Врожденные и приобретенные метгемоглобинемии. Причины. Недостаточность НАДН-метгемоглобинредуктазы. Клинические проявления.
   
3. 
   Порфирии. Классификация, причины, патогенез, клинические проявления, основы лечения.
   

Лабораторная работа 1

Определение концентрации гемоглобина в крови
гемоглобинцианидным методом

Принцип

Гемоглобин при взаимодействии с гексацианоферратом калия (красная кровяная соль) окисляется в метгемоглобин, образующий с ацетонциангидрином окрашенный гемоглобинцианид, интенсивность окраски которого пропорциональна количеству гемоглобина.

Реактивы

Трансформирующий реактив (смесь ацетонциангидрина, Na₂CO₃, гексацианоферрата калия K₃[Fe(CN)₆]).

Стандартный раствор гемоглобинцианида, 150 г/л.

Материал исследования

Свежая кровь животных.

Проведение анализа

	Опыт, мл	Стандарт, мл
Кровь Стандартный раствор	0,02 ––	–– 0,02
Трансформирующий раствор	5,0	5,0
	Инкубируют 10 минут и измеряют оптическую плотность опытной и стандартной проб против воды при длине волны 540 нм (зеленый светофильтр)

Расчет

Концентрация гемоглобина, г/л = , где

Е_оп и Е_ст – оптическая плотность опытной и стандартной проб,
С_ст – концентрация гемоглобина в стандартном растворе

Нормальные величины

Свежая кровь	дети	100-140 г/л
	женщины	120-140 г/л
	мужчины	130-160 г/л

Клинико-диагностическое значение

Снижение концентрации гемоглобина наблюдается при анемиях – железодефицитной (до 60 г/л), геморрагической, гипопластической, гемолитической, В₁₂-дефицитной.

Увеличение концентрации гемоглобина наблюдается при миелопролиферативных заболеваниях – эритремии (до 210 г/л), симптоматических эритроцитозах – пролиферации элементов эритропоэза, при обезвоживании.

Лабораторная работа 2

Определение концентрации общего билирубина
и его фракций в сыворотке крови

Принцип

Взаимодействие сульфаниловой кислоты с азотистым натрием дает диазофенилсульфоновую кислоту, которая с билирубином образует окрашенные азопигменты (диазореакция Эрлиха). Связанный (прямой) билирубин реагирует быстро, поэтому о его концентрации судят по первоначальной интенсивности окраски. Несвязанный билирубин вступает в реакцию только после добавления акселератора (кофеин). Последний освобождает билирубин из комплекса с белками и тем самым ускоряет реакцию азосочетания.

Материал исследования

Сыворотка крови.

Реактивы

1) Сульфаниловая кислота в HCl (реагент 1), 2) натрий азотисто-кислый NaNO₂ (реагент 2), 3) кофеиновый реактив (реагент 3), 4) буферный раствор (реагент 4), 5) 0,9% р-р NaCl, 6) раствор альбумина, 20 г/л.

Стандартный раствор билирубина, 5 мкмоль/л.

Проведение анализа

	Общий билирубин, мл	Прямой билирубин, мл	Стандарт, мл	Контроль, мл
Сульфаниловая кислота (реагент 1)	0,2	0,2	0,2	––
NaNO2 (реагент 2)	1 капля	1 капля	1 капля	––
Кофеиновый реактив (реагент 3)	1,0	––	1,0	1,0
NaCl	––	1,0	––	0,2
Сыворотка крови	0,2	0,2	––	0,2
Стандартный р-р билирубина	––	––	0,2	––
	Перемешивают и оставляют на 10 минут
Буферный раствор (реагент 4)	1,0	1,0	1,0	1,0
	Измеряют оптическую плотность пробы на прямой билирубин против контроля при длине волны 540 нм (зеленый светофильтр). Еще через 10 минут измеряют оптическую плотность пробы на общий билирубин против контроля при длине волны 540 нм (зеленый светофильтр).

Расчет

По формуле рассчитывают концентрацию общего и прямого билирубина, концентрацию непрямого билирубина находят как разность между концентрацией общего и прямого билирубина_.

Концентрация билирубина, мкмоль/л = , где

Е_оп и Е_ст – оптическая плотность опытной и стандартной проб,
С_ст – концентрация стандартного раствора.

Нормальные величины

Сыворотка крови

Общий билирубин

Дети	3,4 17,1 мкмоль/л
Взрослые	8,5 20,5 мкмоль/л

Прямой билирубин

Дети	отсутствие
Взрослые	2,2 5,1 мкмоль/л

Клинико-диагностическое значение

В таблице отражены сдвиги содержания основных пигментов в сыворотке крови, моче и кале здоровых людей и при различных типах желтух (   увели­чение,    снижение, N – нормальные значения):

	Типы желтух
	Паренхиматозная__Обтурационная'>Гемолитическая	Паренхиматозная	Обтурационная
Билирубин крови
Общий			
Непрямой			N или 
Прямой	N или 		
Билирубин мочи	N	N или 	
Уробилин мочи			
Стеркобилин кала		N или 	Отсутствует

Сыворотка крови:

Накопление билирубина в крови свыше 43 мкмоль/л ведет к связыванию его эластическими волокнами кожи и конъюнктивы, что проявляется в виде желтухи. Для дифференциальной диагностики желтух необходимо определить, за счет какой фракции возникает билирубинемия:

1. Гемолитическая (надпеченочная) желтуха – ускоренное образование билирубина в результате гемолиза. Гипербилирубинемия развивается за счет фракции непрямого билирубина. В моче резко возрастает содержание уробилина, билирубин отсутствует. В кале увеличено содержание стеркобилина.

Данный тип желтух может развиваться при В₁₂ дефицитной анемии, гемолитических анемиях различного происхождения (порфирии, лекарства, несовместимость крови, дефект глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы).

2. Паренхиматозная (печеночно клеточная) желтуха – нарушено извлечение билирубина печеночными клетками, его конъюгирование и выведение. Гипербилирубинемия развивается за счет обеих фракций: количество непрямого билирубина возрастает за счет функциональной недостаточности гепатоцитов или снижения их количества, а прямого – за счет цитолиза гепатоцитов. В моче определяется билирубин, умеренно увеличена концентрация уробилина, уровень стеркобилина кала в норме или снижен.

Наблюдается при вирусных и других формах гепатитов, циррозе и опухолях печени, жировой дистрофии, при других состояниях.

3. Механическая (подпеченочная) желтуха развивается вследствие нарушения оттока желчи при закупорке желчного протока. В результате застоя желчи происходит растяжение желчных капилляров, увеличивается их проницаемость. Не имеющий оттока в желчь прямой билирубин поступает в кровь и в результате развивается гипербилирубинемия. В тяжелых случаях, вследствие переполнения гепатоцитов прямым билирубином, конъюгация с глюкуроновой кислотой нарушается и в крови увеличивается количество несвязанного билирубина. В моче резко увеличен уровень билирубина, практически отсутствует стеркобилин кала.

Кроме желчно-каменной болезни, подпеченочные желтухи выявляются при новообразованиях поджелудочной железы и гельминтозах.

Оформление работы

Записывают принцип метода, ход работы и результаты исследования, отмечают клинико-диагностическое значение, делают вывод о возможной патологии.

Лабораторная работа 3

Обнаружение желчных пигментов в моче

Материал исследования

Нормальная моча и моча с желчью.

Реактивы

1) 1% спиртовый р-р йода, 2) конц. HNO₃, 3) конц. H₂SO₄, 4) сухой порошок аммония молибдата.

Проба с молибдатом аммония

Принцип

Метод основан на способности желчных пигментов билирубина и биливердина легко окисляться молибдатом аммония в присутствии серной кислоты с образованием билицианина, имеющего синюю окраску.

Проведение анализа

На предметное стекло отдельно наносят каплю мочи с желчью, соль аммония молибдата и каплю концентрированной серной кислоты. Стеклянной палочкой все хорошо смешивают. В присутствии билирубина развивается синее окрашивание.

Проба Розина

Принцип

Под действием йода билирубин мочи окисляется в биливердин (зеленого цвета).

Проведение анализа

Берут две пробирку, в одну пробирку наливают 2 мл нормальной мочи, в другую – 2 мл патологической мочи (с желчью). В обе пробирки на мочу наслаивают раствор йода. При наличии билирубина на границе между жидкостями образуется зеленое кольцо.

Нормальные величины

Моча	отсутствие

Проба Гмелина

Принцип

Под действием азотной кислоты, содержащей примесь азотистой, билирубин мочи окисляется в биливердин (зеленого цвета), билицианин (сине-фиолетовый), холетелин (желтый).

Проведение анализа

В пробирку с 5-10 каплями концентрированной HNO₃ осторожно, по стенке наслаивают равный объем исследуемой мочи. При наличии в моче желчных пигментов на границе жидкостей появляются цветные кольца. Первым появляется зеленое кольцо биливердина.

Нормальные величины

Моча	отсутствие

Проба Розенбаха

Принцип

Принцип метода аналогичен пробе Гмелина.

Проведение анализа

Фильтруют 1-2 мл исследуемой мочи через небольшой фильтр. Желчные пигменты, если они присутствуют в моче, частично задерживаются на фильтре. Затем в конус фильтра вносят 1 каплю концентрированной азотной HNO₃, содержащей следы азотистой кислоты (HNO₂), и наблюдают на фильтре появление окрашенных колец, как в пробе Гмелина.

Нормальные величины

Моча	отсутствие

Клинико-диагностическое значение

Моча

Билирубинурия характерна для обтурационной и паренхиматозной желтух при повышении уровня прямого билирубина в сыворотке, но отсутствует при гемолитической. При гепатите билирубин может быть обнаружен в моче до появления желтухи.

Оформление работы

Записывают принцип методов, результаты исследования заносят в таблицу, отмечают клинико-диагностическое значение, делают вывод о возможной патологии.

Название метода	Материал исследования		Результаты реакции
Проба с молибдатом аммония	моча	нормальная
		с желчью
Проба Розина	моча	нормальная
		с желчью
Проба Гмелина	моча	нормальная
		с желчью
Проба Розенбаха	моча	нормальная
		с желчью