Государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
"Сибирский государственный медицинский университет"
Министерства здравоохранения и социального развития
Российской Федерации
Лабораторный практикум
по биологической химии
Для студентов лечебного и педиатрического
факультетов
Учебное пособие
Томск
Сибирский государственный медицинский университет
2011
УДК 577.1:615.01(075.8)
ББК Е072Я7 + Р282Я7
Л125
Рецензенты:
Заведующий кафедрой биологической химии ГОУ ВПО Новосибирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, д-р мед.наук, профессор Шарапов В.И.
Заведующий кафедрой биохимии ГОУ ВПО Челябинская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации, д-р биол.наук, профессор Цейликман В.Э.
Авторы
Тимин О.А., Степовая Е.А., Федорова Т.С., Носарева О.Л., Серебров В.Ю.
Лабораторный практикум по биологической химии для студентов лечебного и педиатрического факультетов: Учебное пособие / О.А.Тимин, Е.А.Степовая, Т.С.Федорова, О.Л.Носарева, В.Ю.Серебров – Томск: Сибирский государственный медицинский университет, 2012 – 258 с.
Данное пособие написано в соответствии с программой по биологической химии для студентов медицинских вузов. В каждом разделе приведены лабораторные работы и биохимические методы, выполняемые студентами на практических занятиях. Ряд изучаемых методов используется в клинико-диагностических лабораториях для помощи лечащему врачу в постановке диагноза и для контроля эффективности лечения. По каждому разделу студенту предлагаются вопросы для самоподготовки к практическому занятию, тестовые задания и ситуационные задачи для проверки полученных знаний.
Пособие предназначено для студентов, обучающихся по специальностям 060101 "Лечебное дело" и 060103 "Педиатрия".
Учебное пособие утверждено и рекомендовано к печати: учебно-методической комиссией медико-биологического факультета (протокол № 2 от 22 марта 2011 г) и Центральным методическим советом ГБОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России (протокол № 2 от 19 мая 2011г).
ISBN Сибирский государственный медицинский университет, 2012
Тимин О.А., Степовая Е.А., Федорова Т.С., Носарева О.Л, Серебров В.Ю. 2012
Оглавление
Оглавление 3
Раздел 1.
Строение, свойства и функции белков 6
Раздел 2.
Строение, классификация и роль витаминов 22
Раздел 3.
Энзимология 36
Контрольные вопросы к итоговому занятию 51
Раздел 4.
Биологическое окисление 54
Раздел 5.
Обмен аминокислот и белков 58
Раздел 6.
Строение и обмен пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов 86
Раздел 7.
Матричные биосинтезы 94
Контрольные вопросы к итоговому занятию 107
Раздел 8.
Строение и обмен углеводов 111
Контрольные вопросы к итоговому занятию 133
Раздел 9.
Строение и обмен липидов 136
Контрольные вопросы к итоговому занятию 155
Раздел 10.
Гормональная регуляция обмена веществ
и функций организма 159
Раздел 11.
Биохимия крови 172
Раздел 12.
Биохимия почек и печени 206
Контрольные вопросы к итоговому занятию 223
Приложение 1 228
I класс. Оксидоредуктазы 229
II класс. Трансферазы 231
III класс. Гидролазы 233
IV класс. Лиазы 235
V класс. Изомеразы 237
VI класс. Лигазы 239
Приложение 2 242
Характеристика некоторых белков плазмы крови 243
1 глобулины 243
2 глобулины 244
глобулины 246
Приложение 3 248
Нормальные величины изученных
биохимических показателей 248
Приложение 4 253
Эталоны ответов к тестовым заданиям 253
Эталоны ответов к ситуационным задачам 255
Раздел 1.
Строение, свойства и функции белков
Тема 1.1.
Строение и классификация аминокислот.
Структура белков Актуальность
Аминокислоты являются материалом для строительства белков – пластического материала клеток живого организма. Особенностями аминокислотного состава обусловлено огромное разнообразие структуры и функций белковых молекул, благодаря чему белкам принадлежит ведущая роль во всех процессах жизнедеятельности. Аминокислоты участвуют в образовании биогенных аминов, азотистых оснований и мононуклеотидов, нейромедиаторов и т.д. Ряд из них используются в качестве лекарств.
Цель
Знакомство со строением, физико-химическими свойствами и классификацией аминокислот, входящих в состав белков организма человека.
Приобретение практических навыков по проведению качественного анализа биологических жидкостей на присутствие аминокислот, пептидов и белков при помощи цветных реакций.
Вопросы для самоподготовки
Принципы классификации аминокислот.
Классы аминокислот:
по биологической роли (заменимые и незаменимые);
по физико-химическим свойствам (нейтральные, кислые, основные; гидрофобные, гидрофильные);
по химическому строению (с алифатическими радикалами, с дополнительной функциональной группой, с ароматическим и гетероциклическим радикалом, иминокислоты);
по растворимости в воде (неполярные, полярные незаряженные, полярные отрицательно и положительно заряженные).
Структурные формулы протеиногенных аминокислот.
Физико-химические свойства аминокислот, роль их функциональных групп.
Изоэлектрическая точка аминокислот и пептидов. От чего она зависит?
Влияние изменения рН на заряд аминокислот.
Пептидная связь, реакция образования. Свойства пептидной связи.
Влияние изменения рН на заряд и растворимость пептидов.
Цветные качественные реакции на аминокислоты и белки. Принцип методов. Практическое применение реакций.
Обнаружение белка и свободных аминокислот в биологическом материале. Ключевые моменты анализа. Как удалить белок из биологической жидкости? Как обнаружить наличие свободных аминокислот в жидкости?
Лабораторная работа 1 Реактивы
1) 1% р-р яичного белка, 2) 0,5% р-р нингидрина, 3) 30% р-р NaOH, 4) 10% р-р NaOH, 5) 5% р-р Pb(CH3COO)2, 6) 5% р-р нитропруссида натрия, 7) конц. HNO3, 8) 5% р-р CuSO4.
Материал исследования
При изучении цветных реакций в качестве объекта исследования используют 1% водный раствор яичного белка, содержащего полный набор аминокислот.
Реакция на пептидную связь
Для обнаружения пептидной связи в белках и пептидах используется универсальная биуретовая реакция. Биуретовую реакцию дают вещества, содержащие не менее двух пептидных группировок.
Принцип
Пептидная группа образует в щелочной среде с ионами Сu2+ комплексное соединение фиолетового цвета с красным или синим оттенком в зависимости от числа пептидных связей. Интенсивность окрашивания пропорциональна количеству пептидных групп.
Проведение анализа
В пробирку с 5 каплями 1% раствора белка вносят 3 капли 10% раствора NаОН и 1 каплю 5% раствора CuSО4.
Реакция для обнаружения аминогрупп
Для обнаружения аминогрупп, содержащихся в аминокислотах, и концевых аминогрупп пептидов и белков используется нингидриновая реакция.
Принцип
При нагревании аминокислот и пептидов с нингидрином происходят окислительное отщепление аминогрупп и восстановление нингидрина. Восстановленный нингидрин реагирует с аммиаком и другой молекулой окисленного нингидрина с образованием комплекса сине-фиолетового цвета.
Проведение анализа
5 капель раствора белка смешивают с 5 каплями 0,5% раствора нингидрина. Пробирки нагревают и кипятят до появления сине-фиолетового окрашивания.
Реакция на ароматические аминокислоты
Для обнаружения ароматических аминокислот (фенилаланин, тирозин, триптофан) используется ксантопротеиновая реакция.
Принцип
Ароматическое кольцо при взаимодействии с концентрированной азотной кислотой образует динитросоединение желтого цвета.
Проведение анализа
К 5 каплям 1% раствора белка добавляют 2 капли конц.HNO3 и осторожно нагревают. Наблюдают за появлением желтого окрашивания, при отсутствии желтого цвета еще добавляют 1-2 капли конц.HNO3. При добавлении избытка 30% раствора NаОН окраска переходит в оранжевую.
Реакции на серосодержащие аминокислоты
Принцип
Сульфгидрильные группы в белке или пептиде подвергаются щелочному гидролизу, в результате чего происходит отщепление серы в виде сульфида натрия Na2S, который вступает в дальнейшие реакции:
реакция Фоля – Na2S с ацетатом свинца Pb(CH3COO)2 дает черный или бурый осадок сульфида свинца;
реакция с нитропруссидом – Na2S дает с нитропруссидом натрия соединение, окрашенное в красно-коричневый цвет.
Проведение анализа
5 капель 1% раствора белка и 5 капель 30% раствора NaOH кипятить 1 2 минуты. Разделить содержимое на 2 части для реакций "а" и "б".
а) Реакция Фоля
К 5 каплям гидролизата добавляют 1 каплю раствора уксусно-кислого свинца и нагревают до кипения. Отмечают появление бурого или черного осадка.
б) Реакция с нитропруссидом
К 5 каплям гидролизата добавляют 2-3 капли раствора 5% натрия нитропруссида. Отмечают появление красно-коричневого окрашивания.
Практическое значение цветных реакций
Цветные реакции, являясь универсальными (биуретовая, нингидриновая) и специфическими (реакция Фоля, ксантопротеиновая), позволяют установить белковую природу вещества, обнаружить белок и аминокислоты в растворе, изучить состав белков и пептидов.
Принцип этих реакций используется для количественного определения аминокислот и белков в биологических жидкостях.
Оформление работы
Результаты оформляют в виде таблицы, где отмечают полученный цвет раствора и интенсивность окраски. Интенсивность окраски обозначают следующим образом: ‘’–‘’ отсутствие окраски; ‘’+’’ слабая окраска; ‘’++’’ сильная окраска; ‘’+++’’ очень сильная окраска.
Объект
исследования
|
Реакции
|
Биуретовая
|
Нингидриновая
|
Ксантопротеиновая
|
Фоля
|
С нитропруссидом
|
Раствор яичного
белка
|
|
|
|
|
|
В выводах указывается на возможность обнаружения пептидных связей и некоторых типов аминокислот при помощи используемых реакций.
Лабораторная работа 2
Химический состав биологических жидкостей (кровь, моча, желудочный сок, слюна и т.п.) характеризуется постоянством и отражает состояние биохимических процессов, происходящих в органах и тканях. Отклонение от нормы в качественном и количественном составах биологических жидкостей может быть показателями патологического процесса.
Материал исследования
Сыворотка крови, слюна, моча.
Реактивы
1) 0,5% р-р нингидрина, 2) 10% р-р NaOH, 3) 10% р-р трихлоруксусной кислоты (ТХУ), 4) 5% р-р CuSO4.
Проведение анализа
С 5 каплями сыворотки, слюны и мочи проводят биуретовую реакцию (см. "Лабораторная работа 1"), определяя наличие или отсутствие белка в пробах.
Дальнейшие действия зависят от наличия или отсутствия белка в пробах:
если жидкость не содержит белок, то с 10 каплями исследуемого материала проводят нингидриновую реакцию (см. "Лабораторная работа 1") для определения наличия или отсутствия аминокислот;
если в жидкости присутствует белок, то для последующего исследования берут 20 капель биологической жидкости, в нее добавляют 5 капель 10% раствора ТХУ и нагревают до осаждения белка. Белок отделяют центрифугированием или фильтрованием через бумажный фильтр (предварительно смочив фильтр водой).
Далее в безбелковом надосадке (или фильтрате) с помощью нингидриновой реакции определяют наличие или отсутствие аминокислот. Для этого к нему добавляют 5 капель 0,5% р-ра нингидрина и нагревают в кипящей водяной бане.
Оформление работы
Результаты анализа вносят в таблицу. Знаками ‘’+’’ и "–‘’ отмечают результаты наблюдения.
Делают вывод о содержании белка и аминокислот в биологических жидкостях и его причинах.
Объект
исследования
|
Обнаруженные соединения
|
Белок
|
Свободные
аминокислоты
|
Сыворотка крови
Слюна
Моча
|
|
| Практическое значение
Свойство биологических жидкостей изменять свой состав при патологии нашло применение в клинико-диагностических лабораториях для диагностики заболеваний и контроля лечения. Многие методы определения веществ требуют наличия безбелковой жидкости, поэтому они начинаются с удаления белка из раствора путем фильтрации или центрифугирования.
Цветные реакции на белок и аминокислоты используют в биохимических исследованиях для контроля полноты удаления белка из жидкости, наличия аминокислот в биологических средах, а также качественного анализа белковых лекарственных средств в фармацевтической практике.
|
Скачать 5.3 Mb.