Практикум по бх. Практикум по биологической химии Для студентов лечебного и педиатрического
 Скачать 5.3 Mb.
|
Тема 7.2. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| | Опыт, мл | Стандарт, мл |
| Сыворотка крови | 0,04 | –– |
| Стандартный раствор альбумина | –– | 0,04 |
| Биуретовый реактив | 3,0 | 3,0 |
| | Выдерживают 15 минут. Измеряют оптическую плотность проб против воды на ФЭК при длине волны 540 нм (зеленый светофильтр) | |
Расчет
Концентрация белка, г/л =
, гдеЕоп и Ест – оптическая плотность опытной и стандартной проб,
Сст – концентрация белка в стандартной пробе.
Нормальные величины
| Сыворотка крови | дети от 1 года до 3 лет | 54-85 г/л |
| | старшие дети и взрослые | 65-85 г/л |
Клинико-диагностическое значение
См. ниже.
Рефрактометрический метод
Принцип
При переходе из одной прозрачной среды (стекло) в другую (сыворотка крови) под наклоном к поверхности раздела двух фаз луч света преломляется. При этом отношение синуса угла падения к синусу угла преломления называется коэффициентом преломления (рефракции). В сыворотке крови величина рефракции зависит от количества и состава белков.
Материал исследования
Сыворотка крови.
Оборудование
Рефрактометр.
Реактивы
1. Проверяют нулевую точку прибора путем определения показателя преломления дистиллированной воды.
Для этого на чистую поверхность измерительной призмы наносят 2-3 капли воды и опускают осветительную призму. Наводят окуляр на резкость. Поворотом рефрактометра к свету добиваются наилучшей освещенности шкалы и штриха. Вращением маховичка "И" границу светотени вводят в поле зрения окуляра. Вращают маховичок компенсатора "К" до исчезновения окраски границы светотеней. Наблюдая в окуляр, маховичком "И" наводят границу светотени точно на линию штриха.
Снимают отсчет по шкале. Показатель преломления дистиллированной воды должен быть равен 1,333.
2. Измерение показателя преломления сыворотки крови проводят аналогичным образом.
3. После проведения измерений поверхности призм очищают мягкой салфеткой.
Расчет
Зная показатель преломления, расчет проводят по таблице.
| Показатель преломления | Концентрация белка в сыворотке крови, г/л | Показатель преломления | Концентрация белка в сыворотке крови, г/л |
| 1,34500 1,34557 1,34575 1,34612 1,34650 1,34687 1,34724 1,34761 | 52,5 54,7 56,8 59,0 61,2 63,4 65,5 67,7 | 1,34798 1,34836 1,34870 1,34910 1,34947 1,34984 1,35021 | 69,8 72,0 74,2 76,3 78,5 80,6 82,8 |
Нормальные величины
| Сыворотка крови | дети от 1 года до 3 лет | 54-85 г/л |
| | старшие дети и взрослые | 65-85 г/л |
Клинико-диагностическое значение
Изменения концентрации общего белка в крови могут иметь как абсолютный (истинный), так и относительный характер. Изменения абсолютного характера являются следствием колебаний содержания белка в крови. Относительные изменения зависят от объема крови, то есть наблюдаются при обезвоживании или гипергидратации.
Гиперпротеинемия
Истинное повышение концентрации белка в крови чаще всего связано с увеличением фракции глобулинов. Встречается при острых инфекциях (увеличение синтеза белков острой фазы), при хронических инфекциях (за счет глобулинемии), при миеломной болезни, лимфогрануломатозе, саркоидозе.
Относительная гиперпротеинемия вызывается потерями внутрисосудистой жидкости в результате профузных поносов (например, холере), усиленном потоотделении, неукротимой рвоте, несахарном диабете, тяжелых и обширных ожогах, генерализованных перитонитах.
Гипопротеинемия
Снижение концентрации белка в крови чаще всего связано с уменьшением фракции альбуминов крови.
Абсолютная (истинная) гипопротеинемия связана:
с недостаточным потреблением белка с пищей – заболевания желудочно-кишечного тракта, сужение пищевода при опухолях, полное или частичное голодание;
со снижением синтеза белка – несбалансированный аминокислотный состав пищи, хронические паренхиматозные гепатиты, интоксикации, злокачественные новообразования, лечение кортикостероидами;
с усиленным распадом белков – кахексия, тяжелые инфекции, длительные воспалительные процессы, лихорадочные состояния, тиреотоксикозы;
с потерей белка – нарушения проницаемости капиллярных стенок, кровоизлияния, ожоги, острые и хронические кровотечения, нефротический синдром.
Относительная гипопротеинемия связана с нарушением водного баланса – гипергидратация при гиперальдостеронизме, при почечной недостаточности со снижением экскреции солей, при использовании для питья морской воды, при неадекватных инфузиях солевых растворов.
Оформление работы
Указывают принцип методов, ход работы, нормальные величины и результаты исследования биуретовым и рефрактометрическим методами, отмечают клинико-диагностическое значение показателя и делают выводы о возможной патологии.
Лабораторная работа 2
Определение содержания белка в моче
Материал исследования
Нормальная моча и моча с белком.
Реактивы
1) Конц. HNO3, 2) 20% р-р сульфосалициловой кислоты.
Полуколичественное определение методом Робертса-Стольникова
Принцип
Метод основан на реакции Геллера, заключающейся в том, что на границе концентрированной азотной кислоты и мочи при наличии белка происходит его коагуляция и появляется мутное белое колечко, толщина и быстрота появления которого зависят от количества белка.
Проведение анализа
Не касаясь стенок, на дно пробирки наливают около 1,0 мл конц.HNO3, осторожно наслаивают из пипетки 1,0 мл мочи. Появление тонкого белого кольца на границе двух жидкостей между 2-й и 3-й минутами указывает на наличие белка в концентрации примерно 0,033 г/л (33 мг/л).
Если кольцо появляется раньше 2 минут после наслаивания, мочу следует развести водой и провести повторное наслаивание уже разведенной мочи. Степень разведения мочи подбирают в зависимости от вида кольца, т.е. его ширины, компактности и времени появления. При нитевидном колечке достаточно разведения в 2 раза, при более широком кольце необходимо разведение в 5, 10 и более раз.
| Разведение | Количество жидкости, мл | |
| вода | моча | |
| 1 : 2 1 : 5 1 : 10 1 : 15 1 : 20 1 : 50 | 0,50 0,80 0,90 1,87 1,90 1,96 | 0,50 0,20 0,10 0,13 0,10 0,04 |
Путем последовательного разведения мочи и ее наслаивания на азотную кислоту достигают такого максимального разведения мочи, при котором еще появляется едва заметное колечко между 2-й и 3-й минутами. Это соответствует 0,033 г/л или 33 мг/л белка.
Расчет
Концентрация белка, мг/сут =
, гдегде 33 – минимально определяемое количество белка (мг/л),
А – разведение мочи, Д – суточный диурез (1,2-1,5 л).
Нормальные величины
| Моча | 50-150 мг/сут |
Клинико-диагностическое значение
См. ниже.
Проба с сульфосалициловой кислотой
Принцип
При добавлении сульфосалициловой кислоты к моче рН мочи снижается до 1,0-2,0. При этом белки образуют с анионом сульфосалицилата нерастворимые комплексы.
Проведение анализа
К 2,0 мл мочи добавляют 2-4 капли сульфосалициловой кислоты. При наличии белка в моче выпадает белый осадок.
Нормальные величины
| Моча | отсутствие помутнения |
Клинико-диагностическое значение
Небольшое количество белка в суточной моче присутствует и у вполне здоровых лиц, однако в разовой порции мочи такие концентрации обычными методами не выявляются. Часть этих белков сывороточного происхождения, другая часть является продуктом мочевыводящих путей.
Обнаружение в моче белков чаще всего свидетельствует о заболеваниях почек. Принято подразделять протеинурию в зависимости от места возникновения:
преренальную, связанную с усиленным распадом белков тканей или выраженным гемолизом;
ренальную, обусловленную патологией клубочков или канальцев почек;
постренальную, связанную с воспалением мочевыводящих путей.
Оформление работы
Указывают принцип метода, ход работы, нормальные величины, отмечают клинико-диагностическое значение. Результаты работы записывают в виде таблицы. В выводах указывают состояния, при которых в моче обнаруживается белок.
| Название метода | Материал исследования | Результаты |
| Проба Робертса-Стольникова | Нормальная моча | |
| Моча с белком | | |
| Проба с сульфосалициловой кислотой | Нормальная моча | |
| Моча с белком | |
Тестовые задания
Выберите один правильный ответ.
Правильно характеризует свойства биологического кода следующее положение:
1) каждому кодону соответствует до трех аминокислот
2) одну аминокислоту могут кодировать несколько триплетов
3) каждой аминокислоте соответствует только один кодон
4) кодоны м-РНК считываются в направлении от 3` к 5` концу
Для процесса транскрипции матрицей является
1) ДНК
2) мРНК
3) тРНК
4) рРНК
Для реакций трансляции необходимо наличие
1) лизосом
2) РНК-полимеразы
3) м-РНК
4) АТФ
Для образования пептидных связей в процессе синтеза белка необходима
1) аминоацил-т-РНК синтетаза
2) пептидилтрансфераза
3) транслоказа
4) карбоксипептидаза
К посттрансляционным изменениям, которые могут происходить с белковыми молекулами, не относится
1) частичный протеолиз
2) полиаденилирование
3) ковалентное присоединение простетической группы
4) карбоксилирование
Синтез белка стимулирует гормон
1) инсулин
2) глюкагон
3) адреналин
4) вазопрессин
Причиной, которая обусловливает фенотипические различия органов и тканей многоклеточного организма, является
1) стойкая репрессия отдельных генов
2) аллостерическое ингибирование различных ферментов
3) различия в наборе ДНК
4) различия в посттрансляционной модификации белков
Синтез белка на стадии инициации ингибирует
1) пенициллин
2) стрептомицин
3) эритромицин
4) хлорамфеникол
Пептидилтрансферазную реакцию ингибирует
1) хлорамфеникол
2) ампициллин
3) рифампицин
4) эритромицин
Транслоказную реакцию ингибирует
1) эритромицин
2) тетрациклин
3) ампициллин
4) хлорамфеникол
Ситуационные задачи
1. В кодоне 5'-ГАА-3' информационной РНК, ответственной за синтез полипептидной цепи гемоглобина, обнаружено замещение последнего аденилового нуклеотида на уридиловый. В результате чего имеется такая замена и к возникновению какого заболевания она приведет и почему?
2. Противоопухолевый препарат цисплатин является ингибитором ферментов топоизомераз. Каким образом это ингибирование влияет на состояние опухолевых клеток?
3. Для транспорта жиров в крови присутствуют надмолекулярные структуры – липопротеины. Некоторые из липопротеинов содержат белки, называемые апоВ-48 и апоВ-100. Известно, что синтез обоих апоВ-белков кодирует один ген, но масса белков отличается примерно в 2 раза (апоВ-48 – 241 кДа, апоВ-100 – 512 кДа). Предположите причину такого различия.
Контрольные вопросы к итоговому занятию
Баланс азота в организме. Понятие азотистого равновесия. Биологическая ценность белков. Заменимые и незаменимые аминокислоты. Нормы потребления белка у детей и взрослых и пищевые источники белка. Что такое эталонный белок? Симптомы белковой недостаточности.
Переваривание белков в желудочно-кишечном тракте. Реакции образования соляной кислоты, роль HCl. Регуляция секреции соляной кислоты. Ферменты ЖКТ, экзо- и эндопептидазы, их локализация, механизм активации ферментов, их оптимум pH, специфичность. Механизм всасывания аминокислот.
Особенности переваривания белков и всасывания аминокислот у детей разного возраста. Причины нарушения переваривания и всасывания у детей и связь этих нарушений с развитием аллергических состояний. Что такое целиакия, укажите причины и клинические проявления заболевания.
Процесс гниения белков в кишечнике. Его причины и последствия. Вещества, образующиеся в этом процессе. Системы обезвреживания токсичных продуктов в печени: микросомальное окисление, реакции конъюгации, укажите строение и роль ФАФС и УДФГК. Реакции образования животного индикана.
Качественные реакции на соляную кислоту в желудочном соке. Определение общей кислотности, свободной и связанной соляной кислоты желудочного сока. Принцип метода, ход определения, нормальные показатели и клинико-диагностическое значение.
Обнаружение молочной кислоты в желудочном соке. Принцип метода, ход определения, нормальные показатели и клинико-диагностическое значение.
Обнаружение крови и гемоглобина в желудочном соке. Принцип метода, ход определения, нормальные показатели и клинико-диагностическое значение.
Беззондовый метод определения кислотности желудочного сока (ацидотест), принцип метода.
Источники и пути превращений аминокислот в тканях. По какому признаку аминокислоты делятся на глюкогенные и кетогенные? Использование аминокислот в медицинской практике.
Четыре вида реакций дезаминирования аминокислот. Особенность окислительного дезаминирования. Характеристика трансдезаминирования – механизм реакций, ферменты, коферменты, локализация процесса. Значение реакций трансаминирования. Роль цикла ИМФ АМФ, его реакции.
Характеристика аспартатаминотрансферазы (АсАТ) и аланинаминотрансферазы (АлАТ), катализируемые реакции. Метод количественного определения активности аминотрансфераз АсАТ и АлАТ в сыворотке крови. Укажите клинико-диагностическое значение определения их активности в крови, нормальные показатели.
Глутаматдегидрогеназа: локализация, строение, роль, регуляция активности. Судьба азота и кетокислот, образовавшихся в процессах дезаминирования.
Значение декарбоксилирования аминокислот. Роль биогенных аминов – гистамин, серотонин, аминомасляная кислота, дофамин. Реакции синтеза биогенных аминов – химизм, ферменты, коферменты, продукты, локализация процесса. Реакции инактивации биогенных аминов.
Пути образования и связывания аммиака в тканях (схема). Роль печени, почек и кишечника в выведении аммиака. Каков допустимый уровень концентрации аммиака в крови? Основные причины токсичности аммиака. Гипераммониемии, укажите их причины и последствия. Глюкозо-аланиновый цикл, значение, реакции.
Синтез мочевины, реакции, локализация, значение. Нарушения синтеза мочевины. Количественное определение мочевины в сыворотке крови и моче. Принцип метода, ход определения, нормальные показатели и клинико-диагностическое значение.
Аммониогенез, реакции, их локализация, значение.
Синтез креатина и креатинфосфата, реакции. Биологическая роль креатинфосфата. Физиологическая креатинурия детей.
Синтез креатинина, реакция, локализация. Определение концентрации креатинина в сыворотке крови и моче. Принцип метода, ход определения, нормальные показатели и клинико-диагностическое значение.
Пути метаболизма глутаминовой и аспарагиновой кислот (схема). Реакции, в которых они принимают участие. Связь обмена аминокислот с циклом трикарбоновых кислот.
Пути использования цистеина и его серы (схема). Реакции синтеза таурина. Причина и последствия нарушений при цистинозе и цистинурии.
Пути использования серина и глицина (схема). Реакции взаимопревращения глицина и серина, реакция катаболизма глицина. Роль тетрагидрофолиевой кислоты.
Реакции, отражающие взаимосвязь обмена глицина, серина, метионина и цистеина. Участие фолиевой кислоты и витамина В12. Роль аденозилметионина в процессах трансметилирования. Гомоцистеинемия и гомоцистинурия, их причины и последствия.
Реакции синтеза веществ с участием ТГФК (dТМФ, серин, метионин). Механизм антибактериальной активности сульфаниламидных препаратов.
Метаболизм фенилаланина и тирозина. Пути использования тирозина (схема). Реакции синтеза тирозина из фенилаланина и его катаболизма.
Фенилкетонурия I и II типов: причина, клинические проявления, основы лечения.
Тирозинемии I, II и III типов, алкаптонурия, паркинсонизм, альбинизм: причины, характерные особенности заболеваний, основы лечения.
Строение нуклеопротеинов: белки, нуклеиновые кислоты. Структурные формулы азотистых оснований, нуклеозидов, нуклеотидов. Ферменты переваривания нуклеопротеинов в ЖКТ. Дальнейшая судьба пуринов и пиримидинов.
Строение пурина, источники атомов азота и углерода пуринового кольца. Первые две реакции синтеза пуриновых нуклеотидов, реакции синтеза АМФ и ГМФ, превращения АМФ в АТФ, ГМФ в ГТФ. Регуляция синтеза пуриновых нуклеотидов.
Реакции катаболизма пуриновых нуклеотидов до мочевой кислоты. Реутилизация гуанина и гипоксантина.
Нарушения катаболизма пуринов:
гиперурикемия, ее причины, типы и последствия, основы лечения;
мочекаменная болезнь, ее причины, типы и последствия, основы лечения;
подагра, ее причины, типы и последствия, основы лечения;
синдром Леша-Нихана, его причины, типы и последствия, основы лечения.
Синтез пиримидиновых нуклеотидов УТФ и ЦТФ, реакции, локализация, регуляция. Оротатацидурия.
Синтез дезоксирибонуклеотидов. Роль тиоредоксина и НАДФН. Реакции синтеза dТМФ, участие метилен-ТГФК.
Реакции распада пиримидиновых нуклеотидов до углекислого газа, аммиака и воды.
Лекарственные препараты – ингибиторы синтеза пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов. Механизм их действия.
Особенности строения и отличия первичной и вторичной структур РНК и ДНК. Типы РНК, их локализация, функции. Роль гистонов в формировании третичной структуры ДНК (суперспирализация).
Репликация ДНК эукариот. Суммарное уравнение, ферменты ДНК-синтезирующей системы, основные этапы и особенности репликации ДНК. Связь с фазами клеточного цикла. Репарация ДНК.
Транскрипция РНК, ферменты и компоненты РНК-синтезирующей системы. Понятие экзонов и интронов. Процессы созревания тРНК, рРНК и мРНК. Регуляция транскрипции у прокариот путем индукции и репрессии. Способы регуляции транскрипции у эукариот.
Этапы трансляции, компоненты белок-синтезирующей системы, ферменты, регуляция процессов. Что такое генетический код? Свойства генетического кода. Адапторная роль транспортной РНК. Реакция синтеза аминоацил-тРНК.
Посттрансляционная модификация белков, примеры. Что такое фолдинг? Роль шаперонов.
Лекарственные препараты – ингибиторы биосинтеза РНК, ДНК, белка. Механизм их действия.
Принцип и ход определения количества белка в сыворотке крови биуретовым и рефрактометрическим методами. Нормальные показатели и клинико-диагностическое значение.
Обнаружение белка в моче пробой с сульфосалициловой кислотой и методом Робертса-Стольникова. Принцип методов и ход определения. Укажите нормальные показатели и клинико-диагностическое значение.
Виды хроматографии, их принцип. С какой целью используют хроматографию? Проведение распределительной хроматографии аминокислот на бумаге. Что такое диализ?
Проведение качественной реакции на мочевую кислоту. Принцип метода и ход определения.
Колориметрический и титрометрический методы определения концентрации мочевой кислоты в сыворотке крови и моче. Принцип методов, ход определения, нормальные показатели и клинико-диагностическое значение.
Анализ химического состава нуклеопротеинов. Принцип метода и ход определения.
Раздел 8.
Строение и обмен углеводов