Практикум по бх. Практикум по биологической химии Для студентов лечебного и педиатрического

• Название: Практикум по биологической химии Для студентов лечебного и педиатрического
• Анкор: Практикум по бх.doc
• Дата: 28.01.2017
• Размер: 5.3 Mb.
• Имя файла: Практикум по бх.doc
• Тип: Практикум; #885
• страница: 12 из 38

Тема 6.1.
Строение и метаболизм пуриновых
и пиримидиновых нуклеотидов

Актуальность

Пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды выполняют ряд важнейших функций в клетке, одной из которых является построение нуклеиновых кислот. Нуклеиновые кислоты не являются незаменимыми пищевыми факторами, и поэтому большинство клеток организма способно к синтезу нуклеотидов. Синтез нуклеиновых кислот определяется скоростью обмена нуклеотидов.

К патологиям обмена пуриновых нуклеотидов относятся подагра, нефропатии и мочекаменная болезнь (образование уратных камней), синдром Леша-Нихана. К заболеваниям, связанным с нарушением обмена пиримидиновых нуклеотидов, относится оротатацидурия.

Нуклеотиды – лекарственные препараты (метилурацил, оротат калия) успешно применяются в спортивной медицине и в клинике с лечебной целью.

Цель

Изучение биосинтеза и катаболизма пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов, знакомство с нарушениями этих процессов.

Приобретение навыков обнаружения мочевой кислоты качественной реакцией и определения концентрации мочевой кислоты в сыворотке крови и моче.

Вопросы для самоподготовки

1. 
   Переваривание нуклеопротеинов в желудочно-кишечном тракте, ферменты. Дальнейшая судьба пуриновых и пиримидиновых нуклеотидов и оснований.
   
2. 
   Синтез пуриновых нуклеотидов:
   

• 
  реакции образования 5-фосфорибозиламина;
  
• 
  источники атомов азота и углерода пуринового кольца;
  
• 
  реакции синтеза АМФ и ГМФ из ИМФ;
  
• 
  реакции превращения АМФ в АТФ, ГМФ в ГТФ.
  

3. 
   Регуляция синтеза пуриновых нуклеотидов по механизму обратной отрицательной связи. Перекрестная положительная регуляция с участием АТФ и ГТФ.
   
4. 
   Катаболизм пуриновых нуклеотидов:
   

• 
  реакции распада АМФ;
  
• 
  реакции распада ГМФ;
  
• 
  реакция образования мочевой кислоты из гипоксантина и ксантина, роль ксантиноксидазы.
  

5. 
   Первичные и вторичные гиперурикемии:
   

• 
  мочекаменная болезнь, причины, основы лечения;
  
• 
  подагра, причины, клинические проявления, основы лечения. Механизм действия аллопуринола при лечении подагры.
  

6. 
   Синдром Леша-Нихана, причины, основы лечения, прогноз.
   
7. 
   Синтез пиримидиновых нуклеотидов:
   

• 
  реакции синтеза УМФ и УТФ.
  
• 
  реакции синтеза ЦТФ из УТФ.
  

8. 
   Регуляция синтеза пиримидиновых нуклеотидов по механизму обратной отрицательной связи.
   
9. 
   Синтез дезоксирибонуклеотидов. Роль тиоредоксина и НАДФН.
   
10. 
    Синтез dТМФ. Роль тетрагидрофолиевой кислоты. Причина развития мегалобластической анемии при дефиците фолиевой кислоты. Механизм антибактериальной активности сульфаниламидных препаратов.
    
11. 
    Катаболизм пиримидиновых нуклеотидов. Конечные продукты процесса.
    
12. 
    Заболевания, связанные с пиримидиновым обменом. Оротатацидурия, при1чина, клинические проявления, основы лечения.
    
13. 
    Использование в медицине ингибиторов синтеза пиримидиновых и пуриновых нуклеотидов на примере метотрексата, 5 фторурацила, азидотимидина.
    
14. 
    Качественная реакция на мочевую кислоту, принцип метода, его практическое значение.
    
15. 
    Количественное определение концентрации мочевой кислоты в сыворотке крови и моче. Принцип метода, клинико-диагностическое значение, нормальные показатели.
    

ТЕМЫ ДЛЯ РЕФЕРАТИВНЫХ СООБЩЕНИЙ

1. 
   Подагра: этиология, молекулярные механизмы развития, клинические проявления, лечение.
   
2. 
   Мочекаменная болезнь: этиология, виды мочевых камней, диагностика и клинические проявления, лечение.
   
3. 
   Ферменты синтеза рибо- и дезоксирибонуклеотидов как мишени для противовирусных и противоопухолевых препаратов.
   

Лабораторная работа 1

Качественная реакция на мочевую кислоту

Принцип

Мочевая кислота при окислении превращается в соединения (диалуровая кислота, аллоксан), которые конденсируются в аллоксантин. Аллоксантин, взаимодействуя с аммиаком, образует аммонийную соль (мурексид) кирпично-красного цвета. При добавлении КОН к мурексиду образуется калиевая соль сине-фиолетового цвета.

Реактивы

1) Конц. HNO₃, 2) конц. р-р NH₄ОН (аммиак), 3) 10% р-р КOH.

Материал исследования

Кристаллы мочевой кислоты.

Проведение анализа

Кристаллы мочевой кислоты помещают на дно фарфоровой чашки, смачивают каплями азотной кислоты (осторожно!), выпаривают досуха под тягой при температуре не выше 70С. Появляется коричнево-красное пятно.

После охлаждения осторожно на один край пятна наносят 1 каплю раствора аммиака, наблюдают окрашивание в пурпурно-красный цвет. С другого края пятна наносят 1 каплю раствора КОН – появляется сине-фиолетовое окрашивание.

Клинико-диагностическое значение

Мурексидную пробу используют для открытия мочевой кислоты в мочевых камнях и осадках.

Оформление работы

Указывают принцип метода, ход работы, нормальные величины и результаты исследования, отмечают клинико-диагностическое значение показателя и делают выводы о возможной патологии.

Лабораторная работа 2

Определение концентрации мочевой кислоты
в биологических жидкостях

Ферментативное определение концентрации мочевой кислоты
в сыворотке крови и моче

Принцип

Мочевая кислота расщепляется ферментом уриказой до аллантоина с одновременным образованием пероксида водорода. Последний при участии пероксидазы взаимодействует с дихлоргидроксибензолсульфонатом и 4 аминоантипирином с образованием окрашенных в розово-малиновый цвет продуктов. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию мочевой кислоты и определяется фотоколориметрически.

Реактивы

1) Рабочий реактив, содержащий фенол, уриказу, пероксидазу, дихлоргидроксибензолсульфонат и 4 аминоантипирин в калиево фосфатном буфере.

Стандартный раствор мочевой кислоты, 500 мкмоль/л.

Материал исследования

Сыворотка крови. Моча (разведение 1:5).

Проведение анализа

	Опыт 1, мл	Опыт 2, мл	Стандарт, мл
Сыворотка крови Моча (разведение 1:5)	0,025 ––	–– 0,025	–– ––
Стандартный раствор мочевой кислоты	––	––	0,025
Рабочий реактив	1,0	1,0	1,0
	Выдерживают 10 минут при температуре 37С. Измеряют оптическую плотность проб против воды при длине волны 540 нм (зеленый светофильтр)

Расчет

Концентрация мочевой кислоты сыворотки, мкмоль/л = ,

Концентрация мочевой кислоты мочи, ммоль/сут = , где

Е_оп и Е_ст – оптическая плотность опытной и стандартной проб,
С_ст – концентрация мочевой кислоты в стандартной пробе,
5 – разведение мочи, 1000 – коэффициент пересчета мкмоль в ммоль, Д – суточный диурез (1300-1500 мл).

Нормальные величины

Сыворотка крови	дети	0,12 0,32 ммоль/л
	взрослые	0,16 0,45 ммоль/л
Моча		1,46-4,43 ммоль/сут

Клинико-диагностическое значение

Сыворотка крови

Уровень уратов в крови (мононатриевая соль в комплексе с белком) определяется интенсивностью синтеза мочевой кислоты и скоростью ее выведения из организма. Белки сыворотки стабилизируют ураты, но при снижении pH ураты кристаллизуются в тканях.

Для первичной гиперурикемии выделяют метаболический (наиболее частый) и почечный типы. Метаболический тип является следствием усиления синтеза пуриновых нуклеотидов, например, повышенная активность фосфорибозилдифосфатсинтетазы или недостаточная активность гипоксантин­гуанин­фосфорибозилтрансферазы. Почечный тип может быть при генети­чески обусловленном уменьшении экскреции мочевой кислоты почками.

Вторичная гиперурикемия наблюдается при всех состояниях, связанных с усиленным распадом нуклеопротеинов: лейкозы, лечение цитостатиками, облучение, обширный псориаз, пернициозная анемия, гемолитическая анемия. Наиболее частой причиной является почечная недостаточность с нарушением процессов фильтрации и канальцевой секреции мочевой кислоты. Также замедление выведения уратов из организма отмечается при микседеме, гиперпаратиреозе, сахарном диабете, гестозе.

Обнаружение гипоурикемии диагностически малозначимо, иногда отмечается при анемии, после приема салицилатов, при избытке кортикотропина.

Моча

См. ниже.

Титрометрическое определение мочевой кислоты в моче

Принцип

Мочевая кислота восстанавливает фосфорно-вольфрамовый реактив, при этом развивается синяя окраска, интенсивность которой пропорциональна содержанию мочевой кислоты. Концентрацию образовавшейся фосфорновольфрамовой сини определяют путем ее титрования красной кровяной солью K₃[Fe(CN)₆], которая окисляет фосфорно-вольфрамовую синь в бесцветное соединение.

Реактивы

1) 20% р-р Na₂CO₃, 2) фосфорно-вольфрамовый реактив, 3) 3,992 моль/л раствор K₃[Fe(CN)₆].

Материал исследования

Нормальная моча и моча с добавлением мочевой кислоты (пробы 1 и 2 соответственно).

Проведение анализа

В 2 колбы наливают по 5 мл нормальной и мочи с добавлением мочевой кислоты, добавляют по 2 мл фосфорно-вольфрамового реактива и по 10 мл раствора Na₂CO₃, перемешивают. Из бюретки (осторожно!) по каплям добавляют раствор K₃[Fe(CN)₆] до исчезновения синего оттенка и появления желтого окрашивания.

Расчет

Концентрация мочевой кислоты, ммоль/сут = , где

С_ст – концентрация стандартного раствора мочевой кислоты, соответствующая 1 мл раствора K₃[Fe(CN)₆], С_ст = 0,004 ммоль/л или 4 ммоль/мл, В – объем мочи, взятый для анализа (мл),
А – количество мл раствора K₃[Fe(CN)₆], пошедшего на титрование,
Д – суточный диурез (1300-1500 мл).

Нормальные величины

Моча

обычная диета мясная диета

1,46-4,43 ммоль/сут 2,36-5,90 ммоль/сут

Клинико-диагностическое значение

Моча

Повышение содержания мочевой кислоты в моче наблюдается при гиперурикемии непочечного происхождения. Также повышают экскрецию уратов салицилаты, соли лития.

Уменьшают концентрацию мочевой кислоты злоупотребление алкоголем, отравление солями тяжелых металлов, заболевания почек.

Так как при подагре мочевая кислота откладывается в тканях, суставных сумках, хрящах, сухожилиях, ее суточное количество в моче иногда может снижаться.

Оформление работы

Указывают принцип метода, ход работы, нормальные величины и результаты исследования, отмечают клинико-диагностическое значение показателя и делают выводы о возможной патологии.

Тестовые задания

Выберите один правильный ответ.

1. 
   Соединение, являющееся донором азота в синтезе пиримидиновых нуклеотидов, это
   

1) глицин

2) аспарагин

3) аспартат

4) глутамат

2. 
   Соединение, являющееся донором углерода в синтезе пуриновых нуклеотидов, это
   

1) аспарагиновая кислота

2) формил-ТГФК

3) глутамин

4) триптофан

3. 
   Регуляторным ферментом синтеза пиримидиновых нуклеотидов является
   

1) ксантиноксидаза

2) карбамоилфосфатсинтетаза II

3) дигидрооротаза

4) карбамоилфосфатсинтетаза I

4. 
   Причинами эффективности аллопуринола при лечении подагры является
   

1) конкурентное ингибиторование ксантиноксидазы

2) понижение концентрации гипоксантина в моче

3) увеличивает скорость выведения мочевой кислоты почками

4) уменьшает скорость образования пуриновых оснований

5. 
   Антивитамины фолиевой кислоты блокируют реакции
   

1) образования dТМФ из dУМФ

2) образования оротовой кислоты

3) синтеза карбамоилфосфата

4) образование ЦТФ из УТФ

6. 
   Ингибитором карбамоилфосфатсинтетазы II является
   

1) ЦТФ

2) ГМФ

3) dАТФ

4) 5-фосфорибозил-1-пирофосфат

7. 
   К развитию оротацидурии приводит дефект фермента
   

1) карбамоилфосфатсинтетаза I

2) карбамоилфосфатсинтетаза II

3) ксантиноксидаза

4) ОМФ-декарбоксилаза

8. 
   Конечным продуктом распада пуриновых нуклеотидов является
   

1) мочевина

2) мочевая кислота

3) молочная кислота

4) малоновая кислота

9. 
   При распаде пиримидиновых нуклеотидов образуется
   

1) ацетил-S-КоА

2) урат натрия

3) ксантин

4) -аминоизомасляная кислота

10. 
    У больных с синдромом Леша-Нихана имеется генетический дефект
    

1) ксантиноксидазы

2) гипоксантин-гуанин-фосфорибозилтрансферазы

3) гексозо-1-фосфат-уридилтрансферазы

4) фосфорибозилдифосфат-синтетазы

Ситуационные задачи

1. Ребенок в возрасте 1 год поступил в детскую больницу с явлениями отсталости физического и умственного развития. При исследовании мочи выявлена высокая концентрация мочевой кислоты. Какова причина ее появления?

2. При недостатке в рационе фолиевой кислоты развиваются мегалобластическая анемия, лейкопения, нарушается состояние слизистых оболочек и кожи. В чем биохимическая причина таких нарушений?

Раздел 7.
Матричные биосинтезы