Практикум по бх. Практикум по биологической химии Для студентов лечебного и педиатрического

• Название: Практикум по биологической химии Для студентов лечебного и педиатрического
• Анкор: Практикум по бх.doc
• Дата: 28.01.2017
• Размер: 5.3 Mb.
• Имя файла: Практикум по бх.doc
• Тип: Практикум; #885
• страница: 8 из 38

Тема 5.1.
Внешний обмен белков

Актуальность

Источником белков для человека являются пищевые продукты животного и растительного происхождения. Отклонения состава пищеварительных соков от нормы или появление в них компонентов, не содержащихся в физиологических условиях, приводит к патологии пищеварения. Ухудшение переваривания белков и всасывания аминокислот может повлечь за собой недостаток синтеза белков в организме и нарушение деятельности органов и систем.

Методы анализа состава желудочного сока имеют большое значение для оценки переваривающей способности желудочного сока в норме и при патологии.

Цель

Изучить ферменты, условия и механизмы переваривания белков в желудке и кишечнике.

Освоение методов качественного и количественного анализов желудочного сока для исследования секреторной функции желудка здорового организма и возможных отклонений при патологии.

Вопросы для самоподготовки

1. 
   Повторите строение аминокислот и белков, роль пептидной связи в организации белковой молекулы.
   
2. 
   Повторите класс ферментов "Гидролазы".
   
3. 
   Понятие "азотистый баланс" и причины его изменения (равновесие, положительный и отрицательный азотистый баланс). Особенности азотистого баланса у детей.
   
4. 
   Пищевые источники белка. Суточная потребность в белке у детей разного возраста и взрослых.
   
5. 
   Биологическая ценность белков. Понятие эталонного белка. Клинические проявления белковой недостаточности у детей. Заболевание "квашиоркор".
   
6. 
   Механизм синтеза и биологическая роль соляной кислоты желудочного сока. Понятия "гиперхлоргидрия", "гипохлоргидрия", "ахлоргидрия", "ахилия".
   
7. 
   Переваривание белков в желудке и кишечнике. Характеристика ферментов желудочного сока (пепсин, гастриксин, химозин (реннин)), панкреатического сока (трипсин, химотрипсин, эластаза, карбоксипептидазы) и кишечного сока (аминопептидазы, дипептидазы) по плану:
   

• 
  место синтеза;
  
• 
  механизм активации;
  
• 
  оптимальные условия для работы;
  
• 
  субстратная специфичность.
  

8. 
   Вторичный активный транспорт аминокислот через клеточные мембраны.
   
9. 
   Возрастные особенности переваривания белков и всасывания аминокислот у детей. Причины нарушения нормальных процессов переваривания и всасывания у детей и связь этих нарушений с развитием аллергических реакций. Причины и клинические проявления заболевания "целиакия".
   
10. 
    Общая характеристика процесса "гниения белков" в толстом кишечнике. Причины и последствия этого процесса. Вещества, образующиеся при гниении белков.
    
11. 
    Реакции превращения аминокислот под действием ферментов микрофлоры кишечника:
    

• 
  реакции образования крезола и фенола;
  
• 
  реакции образования скатола и индола;
  
• 
  реакции образования кадаверина и путресцина;
  
• 
  источники метилмеркаптана и сероводорода.
  

12. 
    Обезвреживание токсичных продуктов в печени: микросомальное окисление и система конъюгации. Какие ферменты участвуют в микросомальном окислении? Строение УДФ-глюкуроновой кислоты (УДФГК) и фосфоаденозинфосфосерной кислоты (ФАФС). Реакции образования животного индикана.
    
13. 
    Качественные реакции на свободную соляную кислоту. Принцип методов. Нормальная величина рН желудочного сока, клинико-диагностическое значение определения рН в желудочном соке.
    
14. 
    Определение общей кислотности, свободной и связанной соляной кислоты в желудочном соке. Принцип метода, нормальные показатели. Клинико-диагностическое значение исследования кислотности.
    
15. 
    Качественная реакция на молочную кислоту в желудочном соке. Принцип метода и нормальные показатели. Клинико-диагности­ческое значение.
    
16. 
    Обнаружение крови и гемоглобина в желудочном соке. Принцип метода. Нормальные показатели. Клинико-диагностическое значение.
    
17. 
    Беззондовый метод определения кислотности желудочного сока (ацидотест). Клинико-диагностическое значение.
    

ТЕМЫ ДЛЯ РЕФЕРАТИВНЫХ СООБЩЕНИЙ

1. 
   Заболевания желудочно-кишечного тракта, сопровождающиеся нарушением переваривания белков и всасывания аминокислот.
   
2. 
   Характерные нарушения при белковой недостаточности и болезни "квашиоркор".
   

Лабораторная работа 1

Качественные реакции на
свободную соляную кислоту в желудочном соке

В клинической практике используют методы анализа желудочного сока для диагностики и контроля лечения заболеваний.

Материал исследования

Модельные образцы N 1, 2, 3 желудочного сока с разной кислотностью.

При помощи индикатора конго красный

Принцип

В присутствии свободной соляной кислоты в желудочном соке индикатор конго красный меняет окраску на синюю, оставаясь в слабокислой, нейтральной и щелочной среде красным (зона перехода рН 3,0 5,2).

Реактивы

Индикаторная бумага "конго красный".

Проведение анализа

На полоски индикаторной бумаги наносят стеклянной палочкой по 1 капле образцов желудочного сока.

При помощи индикатора диметиламиноазобензола

Принцип

Индикатор п диметиламиноазобензол в присутствии свободной соляной кислоты имеет красную окраску, в щелочной среде – желтую (зона перехода рН 2,3 4,2).

Реактивы

Индикатор п диметиламиноазобензол.

Проведение анализа

В пробирки вносят по 10 капель исследуемого желудочного сока, добавляют по 2 капли п диметиламиноазобензола.

Нормальные величины

Желудочный сок

pH 1,5-1,8

Клинико-диагностическое значение

Повышенная кислотность может отмечаться при язве двенадцатиперстной кишки и некоторых случаях язв желудка. При стрессе наблюдается vagus-опосредованное усиление секреции кислоты.

Снижение кислотности наблюдается при атрофическом гастрите, пернициозной анемии, карциноме желудка.

Оформление работы

Отмечают принцип методов, регистрируют результаты в таблице, отмечают клинико-диагностическое значение, делают вывод о наличии патологий.

Образец желудочного сока	Изменение окраски индикатора		Величина pH
	Конго красный	п Диметиламино­азобензол
1 2 3

Лабораторная работа 2

Определение общей кислотности, свободной и связанной соляной кислоты в желудочном соке

Под общей кислотностью желудочного сока понимают сумму всех кислореагирующих веществ: свободная соляная кислота, кислые фосфаты и органические кислоты (молочная, уксусная).

Соляная кислота, называемая "связанной", находится в солеобразном состоянии с белками и продуктами их переваривания.

Принцип

Метод основан на определении кислотных веществ желудочного сока путем титрования их раствором NaOH в присутствии двух индикаторов – диметиламиноазобензола (интервал перехода рН 2,3 4,2) и фенолфталеина (зона перехода рН 8,2 10,0).

В первую очередь с раствором NaOH взаимодействует свободная соляная кислота, поэтому по изменению рН от меньшей, чем 2,3, к большей, чем 4,2 (соответственно, окраски диметиламиноазобензола от красного к оранжевому), определяется количество свободной кислоты. Другие кислоты находятся в растворе в недиссоциированном состоянии и в реакцию со щелочью не вступают.

По переходу окраски фенолфталеина от отсутствия его цвета к розовому цвету (от рН меньшей, чем 8,2, к большей, чем 10,0) определяется общая кислотность желудочного сока.

Реактивы

1) 0,1 М р-р NaOH, 2) 1% спиртовой р-р фенолфталеина, 3) 0,5% спиртовой р-р п диметиламиноазобензола.

Материал исследования

Образцы N 1, 2, 3 желудочного сока.

Проведение анализа

1. В коническую колбу помещают 5 мл исследуемого желудочного сока, добавляют по 2 капли диметиламиноазобензола и фенолфталеина.

• 
  если в образце присутствует свободная HCl, то среда резко кислая и наблюдается красное окрашивание, обусловленное диметиламиноазобензолом. В данной порции желудочного сока можно определить все виды кислотности (выполняются пункты 2, 3, 4, см. ниже);
  
• 
  если свободная HCl отсутствует, то среда слабокислая и наблюдается желтое окрашивание, обусловленное диметиламиноазобензолом. В этом образце можно определить только общую кислотность (выполняется сразу пункт 4, см. ниже).
  

2. Титруют 0,1 М раствором NaOH до появления оранжево-красной окраски и отмечают пункт 1 титрования, т.е. объем щелочи (мл), затраченной на титрование свободной HCl.

3. Продолжают титрование до появления лимонно-желтой окраски и снова отмечают объем щелочи, израсходованной с начала титрования – пункт 2 титрования.

4. Далее титруют до появления розовой окраски и отмечают общее количество щелочи, затраченное на титрование – пункт 3 титрования.

Расчет

За единицу кислотности желудочного сока принимается: объем 0,1 М NaOH (мл), необходимого для нейтрализации кислых эквивалентов в 100 мл желудочного сока (титрационные единицы, ТЕ) или количество миллимолей соляной кислоты в 1 л желудочного секрета. Численно эти величины совпадают (например, 40 ТЕ = 40 ммоль/л).

Пример расчета

На титрование 5 мл желудочного сока до первой отметки израсходовано 2,0 мл NaOH, до второй – 2,22 мл, до третьей – 3,18 мл (все отсчеты делаются от нулевой отметки). Тогда

а) содержание свободной HCl будет равно:

Количество свободной HCl =  = 40 ммоль/л, где

2,0 – количество мл раствора NaOH,
5,0 – количество мл желудочного сока, взятого для титрования,
0,1 – молярность раствора NaOH, 1000 – пересчет на 1 л;

б) содержание общей HCl рассчитывается исходя из среднего арифметического между пунктами 2 и 3 титрования:

Количество общей HCl =  = 54 ммоль/л;

в) содержание связанной HCl соответствует разности показателей общей и свободной соляной кислоты:

54 – 40 = 14 ммоль/л;

г) общая кислотность желудочного сока рассчитывается, исходя из общего объема NaOH, затраченного на титрование:

Общая кислотность =  = 63,6 ммоль/л

Нормальные величины

Свободная HCl	20-40 ммоль/л
Связанная HСl	10-20 ммоль/л
Общая кислотность	40 60 ммоль/л

Клинико-диагностическое значение

Определение кислотности желудочного сока имеет значение для диагностики некоторых заболеваний желудка. При патологии кислотность может быть нулевой, повышенной или пониженной.

Гиперхлоргидрия (увеличение содержания свободной HCl и общей кислотности) имеет место при гиперацидном гастрите и часто сопровождается язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки.

Гипохлоргидрия (пониженная кислотность) встречается при гипоацидном гастрите, иногда при язвенной болезни желудка. Как следствие, снижается усвоение витаминов группы В и всасывание железа, развивается железодефицитная анемия, активируются процесы гниения белков в кишечнике.

Ахлоргидрия (полное отсутствие соляной кислоты) и значительное снижение общей кислотности отмечается при атрофическом гастрите, пернициозной анемии, карциноме желудка. Диагноз ахлоргидрии ставится только после теста со стимуляцией секреции.

Так как при отсутствии соляной кислоты в желудке под влиянием микроорганизмов развиваются процессы брожения, то ахлоргидрия сопровождается появлением в желудке продуктов брожения – молочной, масляной, уксусной кислот, в результате у больных может быть неприятный запах изо рта.

Ахилия (отсутствие соляной кислоты и пепсина) связана со злокачественными новообразованиями желудка, пернициозной анемией.

Оформление работы

Отмечают принцип метода, ход работы, заносят в таблицу результаты анализа количества соляной кислоты и общей кислотности, отмечают клинико-диагностическое значение. Делают вывод о причинах выявленных нарушений.

Образец желудоч­ного сока	Количество 0,1М NaOH, мл			Соляная кислота, ммоль/л			Общая кислот­ность, ммоль/л
	Пункт 1	Пункт 2	Пункт 3	своб-я	общая	связ-я
1 2 3

Лабораторная работа 3

Качественная реакция на молочную кислоту
в желудочном соке

Принцип

Молочная кислота превращает фенолят железа (III) фиолетового цвета в малодиссоциирующую соль лактата железа желто-зеленого цвета.

Реактивы

1) 1% р-р фенола, 2) 1% р-р FeCl₃, 3) 40% р-р молочной кислоты.

Материал исследования

Нормальный желудочный сок и желудочный сок с молочной кислотой.

Проведение анализа

Готовят раствор фенолята железа (III), смешивая 2,0 мл 1% раствора фенола с 3 каплями 1% раствора FeCl_3.

Разливают смесь в 4 пробирки:

• 
  в первую по каплям вносят раствор молочной кислоты,
  
• 
  в остальные – образец нормального желудочного сока и патологического желудочного сока с молочной кислотой.
  

При наличии молочной кислоты фиолетовая окраска раствора заменяется желто-зеленой.

Нормальные величины

Молочная кислота

отсутствие

Клинико-диагностическое значение

Накопление молочной, масляной, уксусной кислот в желудке происходит в результате гипо- и ахлоргидрии или ахилии из-за отсутствия защитной функции соляной кислоты. Развивается застой пищевой кашицы и брожение компонентов пищи микроорганизмами.

Оформление работы

Указывают принцип метода, ход работы, нормальные величины и результаты исследования, отмечают клинико-диагностическое значение показателя и делают выводы о возможных причинах изменений.

	Окраска раствора	Наличие молочной кислоты
Р-р молочной кислоты Нормальный желудочный сок Желудочный сок с лактатом

Лабораторная работа 4

Обнаружение крови и гемоглобина в желудочном соке
с помощью диагностических полосок "Гемофан"

Принцип

Зона индикации диагностических полосок "Гемофан" содержит стабилизированную органическую гидроперекись, кислотный буфер и хромоген. При наличии крови в исследуемой жидкости гемоглобин, обладающий ферментативной пероксидазной активностью, катализирует окисление хромогена гидроперекисью с образованием продуктов синего цвета. В присутствии свободного (растворенного) гемоглобина зона индикации окрашивается в синий цвет равномерно, при наличии эритроцитов на светлом фоне видны яркие синие точки.

Материал исследования

Нормальный желудочный сок и желудочный сок с кровью.

Проведение анализа

В каждый образец исследуемого желудочного сока погружают индикационную зону диагностической полоски, быстро вынимают и через 30 секунд сравнивают с цветной шкалой на этикетке. По шкале сравнения на упаковке тест полосок определяют концентрацию гемоглобина и количество эритроцитов.

Нормальные величины

Кровь

отсутствие

Клинико-диагностическое значение

Кровотечение в полость желудка наблюдается при гастрите, изъязвлении стенок желудка, злокачественных опухолях. При этом под действием соляной кислоты кровь преобразуется в гематин темно-коричневого цвета, напоминающий кофейную гущу, обнаруживаемый либо при зондировании, либо окрашивающий кал в черный цвет. Кровоточивость десен также может давать положительный результат.

Свежая кровь в кале может появляться в результате травмы или кровотечения в тонком кишечнике или прямой кишке.

Оформление работы

Указывают принцип метода, ход работы, нормальные величины и результаты исследования, отмечают клинико-диагностическое значение показателя и делают выводы о возможной патологии.

Лабораторная работа 5 (теоретически)

Беззондовый метод определения кислотности
желудочного сока (ацидотест)

Метод беззондового определения кислотности желудочного сока удобен, надежен, щадит больного. Рекомендуется при противопоказаниях к фракционному зондированию (гипертоническая болезнь, невропатии), а также у детей младшего возраста.

Принцип

Введенный per os краситель (2,4-диамино-4-этоксиазо­бензол) в желудке при наличии и под действием свободной соляной кислоты (pH3) освобождается из драже и всасывается. Через 1,5 часа в моче определяют количество красителя. При подкислении мочи 25% раствором HCl образуется солянокислая соль красителя красного цвета. Степень окраски мочи (количество красителя) прямо пропорционально кислотности желудочного сока. Сопоставление окраски со шкалой служит количественным показателем кислотности.

Реактивы

1) 25% р-р соляной кислоты, 2) драже красителя 2,4-диамино-4 этоксиазобензола, 3) таблетки кофеинбензоата натрия.

Материал исследования

"Контрольная" порция мочи и собранная через 1,5 часа после приема красителя.

Проведение анализа

Подготовка пациента: после голодания в течение 8 часов и опорожнения мочевого пузыря пациент принимает кофеинбензоат натрия (в 100 мл воды), стимулирующего желудочную секрецию и диурез.

Через 1 час собирают "контрольную" мочу. После этого пациент, не разжевывая, проглатывает драже красителя и через 1,5 часа снова собирают мочу.

Анализ проводят одновременно с обеими порциями мочи: доводят водой до 200 мл, отбирают по 5 мл разбавленной мочи, добавляют по 5 мл 25% р-ра HCl и сравнивают со шкалой.

Оформление работы

Отмечают принцип метода и методику проведения анализа.