|
|
Практикум по бх. Практикум по биологической химии Для студентов лечебного и педиатрического
Тема 1.2.
Структура и физико-химические свойства белков Актуальность
Выделение белков из раствора (в том числе высаливание и денатурация) широко используется в медицине для диагностических целей, получения и очистки белковых лекарственных препаратов, в экспериментальных исследованиях.
Цель
Изучить физико-химические свойства белков (молекулярная масса, форма, ионизация, гидратация, растворимость) и основные типы структур белковых молекул.
Научиться осаждать белки из раствора разными методами и использовать способность к осаждению белков в лабораторной практике.
Вопросы для самоподготовки
Строение протеиногенных аминокислот. Образование пептидной связи в пептидах и белках.
Уровни организации структуры белковых молекул (первичная, вторичная, третичная, четвертичная).
Связи, участвующие в формировании уровней структуры белка. Функциональные группы аминокислот, ответственные за образование этих связей.
Четвертичная структура белков. Что такое комплементарность протомеров? В чем заключаются кооперативные изменения конформации протомеров?
Свойства белков: амфотерность, ионизация (заряд), гидратация, растворимость. Что такое изоэлектрическая точка?
Молекулярная масса пептидов и белков. Способы ее определения (ультрацентрифугирование, гель-фильтрация).
Свойства белковых растворов. Факторы, стабилизирующие белковую молекулу в растворе. Коллоидные свойства белков.
Денатурация белков. Факторы, вызывающие денатурацию белков (физические, химические, биологические). Свойства денатурированного белка.
Ренативация белка, ее механизмы.
Способы удаления белков из раствора: осаждение кислотами, тяжелыми металлами, органическими растворителями. Принцип реакций осаждения белка.
Способы очистки белковых растворов от примесей (высаливание, гель-фильтрация, диализ). Принцип методов.
Темы для реферативных сообщений
Хроматография белков, ее виды, практическое применение.
Первая медицинская и первая врачебная помощь при отравлении органическими и неорганическими кислотами, солями тяжелых металлов. Биохимические основы.
Использование диализа и плазмафереза в клинической практике: принцип методов, эффективность и область применения.
Лабораторная работа 1 Высаливание белков
Высаливание – процесс осаждения белка солями щелочных, щелочно-земельных металлов и нейтральными солями. Процесс обратим, так как сохраняет нативные свойства белков.
Реактивы
1) Насыщенный р-р сульфата аммония (NH4)2SO4, 2) кристаллический сульфат аммония (NH4)2SO4, 3) 10% р р NaOH, 4) 1% р-р CuSO4.
Материал исследования
Сыворотка крови.
Принцип
Под действием нейтральных солей, солей щелочных и щелочно-земельных металлов происходят нейтрализация заряда белковых частиц и их дегидратация. Благодаря этому, используя разные концентрации солей, можно разделить белки сыворотки крови на фракции, т.е. осадить одни белки, сохраняя другие в растворенном состоянии. При растворении осажденного белка в воде происходит восстановление его исходных физико-химических и биологических свойств.
Проведение анализа
К 2 мл сыворотки крови добавляют 2 мл насыщенного раствора (NH4)2SO4, при этом получается полунасыщенный раствор. Перемешивают и отмечают выпадение осадка глобулинов.
Через 5 минут осадок отделяют центрифугированием или фильтрованием. Надосадочную жидкость (фильтрат) отделяют. Наличие белка в осадке (на фильтре) доказывают биуретовой реакцией (см Тема 1.1.).
Из надосадка (фильтрата) берут 10 капель и проводят биуретовую реакцию, доказывая наличие белка в растворе. К оставшейся части надосадка добавляют порошок сульфата аммония до полного насыщения, при этом выпадает осадок альбуминов.
Через 5 минут осадок отделяют центрифугированием или фильтрованием. Надосадочную жидкость отделяют и проводят с ней биуретовую реакцию, подтверждая удаление белка из раствора.
Осадок делят на две части. Наличие белка в осадке (на фильтре) доказывают биуретовой реакцией (см Тема 1.1.). Обратимость осаждения проверяют, добавляя к другой части осадка дистиллированную воду.
Клинико-диагностическое значение
Метод высаливания ранее использовали в лабораторной практике для разделения альбуминов и глобулинов, определения их соотношения в сыворотке крови. В норме отношение альбумины/глобулины в сыворотке крови человека колеблется в пределах 1,2-1,8 и при патологии может изменяться в сторону повышения или снижения. Например, при воспалительных заболеваниях увеличивается содержание глобулинов.
Оформление работы
Отмечают принцип метода, ход работы, регистрируют результаты анализа и делают вывод о возможности разделения альбуминов и глобулинов данным методом.
Лабораторная работа 2 Исследование денатурации белков
Денатурация белков – это изменение структурной организации белковой молекулы (четвертичной, третичной и вторичной структуры), приводящее к изменению физико-химических и биологических свойств белка. Денатурирующие факторы делятся на химические (кислоты, тяжелые металлы), физические (ультразвук, высокая и низкая температуры).
Реактивы
1) 1% и 10% р-р СН3СООН, 2) ацетон, 3) 10% р-р ТХУ, 4) конц.HNO3, 5) 1% р-р СuSO4, 6) конц.H2SO4, 7) 5% р-р Pb(CH3COO)2, 8) танин, 9) 20% р-р сульфосалициловой кислоты, 10) 10% р-р NaOH, 11) насыщенный р-р NaCl.
Материал исследования
Яичный белок, 1% водный раствор.
Принцип
Денатурация снижает заряд и гидратную оболочку белков и, соответственно, гидрофильность и устойчивость их в растворе.
Исследование химической денатурации
Проведение анализа
В ряд пронумерованных пробирок вносят по 5 капель 1% раствора яичного белка и добавляют реактивы, пользуясь указаниями таблицы. Знаками "+" и "–" отмечают результаты наблюдения. Интенсивность денатурации указывают числом знаков "+".
Необратимость или обратимость осаждения белка устанавливают добавлением к осадку 20-30 капель дистиллированной воды.
N проб
|
Используемые
реактивы
|
Число капель
|
Механизм и
особенности реакции
|
Результат
|
Денатурация солями тяжелых металлов
|
1
2
|
Меди сульфат
Свинца ацетат
|
2
2
|
Ионы металлов связываются с заряженными группами аминокислот, в результате чего изменяется пространственная структура белка
|
|
Денатурация концентрированными минеральными кислотами
|
3
4
|
Азотная
Серная
|
2
2
|
Концентрированные кислоты вызывают дегидратацию белков, нейтрализуют заряд белка, связываясь с катионными группами
|
|
5
6
|
Азотная
Серная
|
10
10
|
Исчезновение осадка белка при добавлении избытка серной кислоты обусловлено перезарядкой ионных групп
|
|
Денатурация органическими кислотами
|
7
|
Трихлоруксусная
|
2
|
Кислоты нейтрализуют заряд белка, разрушают систему водородных связей и образуют комплексы с белком
|
|
8
|
Сульфосалициловая
|
2
|
Денатурация дубильными веществами
|
9
|
Танин
|
2
|
Образуются нерастворимые солеобразные соединения
с аминогруппами основных
аминокислот
|
|
Денатурация органическими растворителями
|
10
|
Ацетон
|
5
|
Нарушаются гидрофобные взаимодействия внутри белковой молекулы
|
| Практическое значение
Реакции химической денатурации используют для осаждения белка в биологическом материале с целью дальнейшего определения в фильтрате низкомолекулярных веществ, для выявления присутствия белка в различных физиологических жидкостях и количественного анализа.
В лечебной деятельности их используют при лечении и для профилактики отравлений солями тяжелых металлов в быту и на производстве; для обезвреживания отходов в санитарной практике; для дезинфекции кожи и слизистых.
Оформление работы
Отмечают принцип метода, ход работы, регистрируют механизм осаждения и результаты анализа в таблице. Делают вывод о наиболее эффективном способе осаждения белков.
Исследование денатурации белков
при нагревании в условиях различной рН
Проведение анализа
В 5 пронумерованных пробирок наливают по 10 капель раствора яичного белка.
Нагревают 1-ю пробу и наблюдают помутнение раствора вследствие термической денатурации.
Во 2-ю пробу добавляют 2 капли 1% раствора СН3СООН (слабокислая среда). Нагревают, наблюдают сначала помутнение (белок теряет заряд и приближение к изоэлектрическому состоянию), а при дальнейшем нагревании – белый хлопьевидный осадок.
В 3-ю пробу добавляют 2 капли 10% раствора СН3СООН (сильнокислая среда) и нагревают. Обычно осадок не образуется, так как частицы белка перезаряжаются и приобретают положительный заряд.
В 4-ю пробу добавляют 2 капли 10% раствора СН3СООН и 1 каплю насыщенного раствора NaCl (сильнокислая среда + электролит) и нагревают. Осадок белка выпадает, так как происходит нейтрализация заряда на частицах белка.
В 5-ю пробу добавляют 2 капли 10% раствора NaOH (щелочная среда) и нагревают. Осадок не образуется, так как отрицательный заряд на частицах белка усиливается.
Оформление работы
Отмечают принцип метода, ход работы, регистрируют в таблице результаты и делают вывод о механизмах осаждения белка.
N
пробы
|
Реактивы
|
pH
|
Результаты
|
Вывод о механизме
осаждения
|
|
|
|
|
| |
|
|
Скачать 5.3 Mb.