|
|
Практикум по бх. Практикум по биологической химии Для студентов лечебного и педиатрического
Тема 2.2.
Водорастворимые витамины Актуальность
Водорастворимые витамины – низкомолекулярные органические вещества различной химической природы, регуляторы обменных процессов и жизнедеятельности организма. В организме они не синтезируются и являются незаменимыми пищевыми факторами. Исключением является витамин РР, синтезируемый в печени в недостаточном количестве. При недостаточном поступлении витаминов развиваются тяжелые состояния – гипо- и авитаминозы. Биологическая роль водорастворимых витаминов связана с регуляцией обменных процессов в организме, поскольку многие из них входят в состав коферментов (простетических групп) ферментов.
Теоретические сведения о витаминах, а также практические навыки качественного и количественного определения этих веществ в различных биологических объектах нужны врачу для профилактики гипо- и авитаминозов, для использования витаминов в качестве неспецифического средства лечения ряда заболеваний кожи, печени, крови и т.п.
Цель
Изучить свойства, химическую структуру, классификацию, биологическую роль витаминов, клиническую картину авитаминозов.
Приобретение практических навыков по проведению качественных реакций на витамины. Использовать полученные навыки для обнаружения водорастворимых витаминов в биологических объектах.
Научиться количественному определению витамина С в различных растительных объектах и моче.
Вопросы для самоподготовки
Характеристика всех водорастворимых витаминов по плану:
строение – химическая формула витаминов В1 (тиамин), В2 (рибофлавин), В3 (PP, никотиновая кислота, никотинамид), В5 (пантотеновая кислота), В6 (пиридоксин), С (аскорбиновая кислота), Н (биотин). Представление о строении витаминов В9 (фолиевая кислота), В12 (цианкобаламин);
пищевые источники;
минимальная суточная потребность;
формула кофермента (ТДФ, ФМН и ФАД, НАД+ и НАДФ+, ПФ);
биохимические функции, примеры реакций и/или процессов, в которых принимает участие кофермент;
возможные причины гипо- и авитаминоза и его клинические проявления.
Механизм антибактериальной активности сульфаниламидных препаратов.
Антивитамины – изониазид, авидин, птеридины. Механизм их действия. Использование антивитаминов в качестве лекарственных средств
Качественные реакции на тиамин, рибофлавин, никотиновую кислоту, пиридоксин, цианкобаламин, аскорбиновую кислоту. Принцип методов.
Количественное определение аскорбиновой кислоты в растительных объектах. Принцип метода. Нормальное содержание витамина С в продуктах питания.
Количественное определение аскорбиновой кислоты в моче. Принцип метода. Нормальные величины. Клинико-диагностическое значение определения витамина в моче.
Темы для реферативных сообщений
Витаминоподобные соединения, общая характеристика, виды, роль в метаболизме.
Витамин Р (биофлавоноиды), его значение и потребность для детского организма.
Моно- и поливитаминные препараты для неспецифической терапии. Достоинства и недостатки употребления этих препаратов в повседневной жизни.
Наследственные нарушения обмена и функций витамина В12.
Лабораторная работа 1 Качественные реакции на водорастворимые витамины Реактивы
1) 10% р-р NаОН, 2) конц. НСl, 3) 1% р-р FеСl3, 4) 10 % р-р тиомочевины, 5) 10% р-р CН3CООН, 6) 5% р-р Сu(СН3СОО)2, 7) изобутиловый спирт, 8) цинк металлический. 9) 5% р-р калия гексацианоферрата K3Fe(CN)6 (красная кровяная соль), 10) порошок гидросульфита натрия, 11) 0,001М р-р 2,6 дихлорфенолиндофенола (краска Тильманса), 12) 10% р-р HСl, 13) 10% р-р Na2CO3, 14) 0,01% р-р метиленового синего, 15) 2% р-р HСl.
Оборудование
Ртутно-кварцевая лампа, водяная баня.
Исследуемый материал
6% р-р тиамина бромида, 5% р-р пиридоксина гидрохлорида, сухая никотиновая кислота, 0,025% р-р рибофлавина, 1,0% раствор витамина В12, 1% раствор аскорбиновой кислоты.
Качественная реакция на тиамин Принцип
В щелочной среде тиамин окисляется железосинеродистым калием в тиохром, который обладает интенсивной синей флуоресценцией в ультрафиолетовом свете.
Исследуемый материал
5% р-р тиамина бромида.
Проведение анализа
К 1-2 каплям раствора или 1-2 мг порошка тиамина прибавляют 5-10 капель раствора NаОН и 2 капли раствора К3[Fе(СN)6], перемешивают. Нагревают и наблюдают флуоресценцию в лучах ртутно-кварцевой лампы.
Качественные реакции на рибофлавин Материал исследования
0,025% р-р рибофлавина. Перед употреблением разводят в 5 раз.
Реакция флуоресценции
Рибофлавин обладает окислительно-восстановительными свойствами. Это связано с наличием двойных связей в структуре изоаллоксазинового кольца, по месту разрыва которых могут присоединяться к азоту 2 протона и 2 электрона окисляемого субстрата.
Принцип
Метод основан на способности окисленных форм рибофлавина и флавиновых коферментов давать в ультрафиолетовом свете желто-зеленую флуоресценцию, интенсивность которой зависит от концентрации окисленных форм рибофлавина. Восстановленные формы флавинов не флуоресцируют.
Проведение анализа
В пробирку вносят 10 капель раствора рибофлавина и приливают в каждую по 5 мл дистиллированной воды. Отмечают наличие флуоресценции.
Добавляют на кончике скальпеля порошок натрия гидросульфита (восстановитель) и наблюдают за гашением флуоресценции.
Реакция восстановления
Принцип
Метод основан на восстановлении рибофлавина водородом, выделяющимся при добавлении металлического цинка к концентрированной HСl. В начале образуется промежуточный продукт родофлавин розового цвета, а затем бесцветная лейкоформа.
Проведение анализа
К 10 каплям раствора рибофлавина добавляют 5 капель концентрированной HCl и гранулу металлического цинка. Жидкость окрашивается в розовый цвет, а затем обесцвечивается.
Качественная реакция на никотиновую кислоту Принцип
При нагревании витамина РР с раствором уксусно-кислой меди образуется плохо растворимый синий осадок медной соли никотиновой кислоты.
Материал исследования
Порошок никотинамида.
Проведение анализа
5-10 мг (щепотка) никотиновой кислоты помещают в пробирку с 10 каплями 10% раствора CН3CООН и растворяют при нагревании. К нагретому до кипения раствору добавляют равный объем раствора уксусно-кислой меди. Жидкость становится мутной.
При стоянии и постепенном охлаждении раствора выпадает синий осадок медной соли никотиновой кислоты.
Качественная реакция на пиридоксин Принцип
Витамин В6 с FеСl3 образует комплексную соль красного цвета.
Материал исследования
1% р-р витамина В6.
Проведение анализа
К 5 каплям 1% раствора витамина В6 прибавляют равное количество 1% раствора FеСl3. Развивается красное окрашивание.
Качественная реакция на цианкобаламин Принцип
При взаимодействии ионов кобальта, содержащихся в витамине, с тиомочевиной при нагревании образуется роданид кобальта зеленого цвета.
Материал исследования
1% р-р витамина В12.
Проведение анализа
1. Подготовительный этап (выполняет лаборант)
В пробирку вносят 5 капель раствора витамина В12, 5 капель концентрированной серной кислоты и сжигают (минерализуют) при нагревании под тягой. Затем пробирку охлаждают под током воды и добавляют 1 мл воды. Готовый минерализат используется в цветной реакции.
2. Цветная реакция
На беззольный фильтр наносят 2-3 капли тиомочевины, высушивают в горячем воздухе над плиткой. На фильтр наносят 1-2 капли минерализата витамина В12 и вновь высушивают в горячем воздухе.
На фильтре по краям пятна появляется зеленое окрашивание, свидетельствующее о наличии кобальта.
Качественные реакции на аскорбиновую кислоту Материал исследования
1% р-р аскорбиновой кислоты.
Реакция с метиленовым синим
Принцип
Аскорбиновая кислота обладает способностью восстанавливать метиленовый синий, окисляясь при этом до дегидроаскорбиновой кислоты. Метиленовый синий при восстановлении обесцвечивается.
Проведение анализа
В 1-ю пробирку вносят 5 капель 1% раствора аскорбиновой кислоты, во 2 ю – 5 капель дистиллированной воды. В обе пробирки вносят по капле 0,01% раствора метиленового синего и ставят в водяную баню при +40С. Наблюдают обесцвечивание жидкости в пробирке с витамином.
Реакция с раствором калия гексацианоферрата
Принцип
Аскорбиновая кислота способна восстанавливать калия гексацианоферрат К3Fе(СN)6, окисляясь до дегидроаскорбиновой кислоты. При этом К3Fе(СN)6 восстанавливается до К4Fе(СN)6, который с ионами трехвалентного железа дает соль Fe4[Fе(СN)6] сине-зеленого цвета.
Проведение анализа
К 10 каплям 1% раствора аскорбиновой кислоты прибавляют 10 капель 5% раствора калия гексацианоферрата К3Fе(СN)6 и 5 капель 1% раствора FeCl3. Наблюдают образование сине-зеленого окрашивания (берлинская лазурь).
Оформление работы
Отмечают принцип методов, ход работы, регистрируют результаты анализа в таблице и делают вывод о возможности обнаружения витаминов данным методом.
Исследуемые
витамины
|
Используемый
метод и реактивы
|
Результат
|
|
|
| Лабораторная работа 2 Количественное определение содержания
аскорбиновой кислоты Принцип
Аскорбиновая кислота, содержащаяся в биологическом материале, восстанавливает в 2,6-дихлорфенолиндофеноле кетогруппу до спиртовой группы с образованием окрашенной лейкоформы 2,6-дихлорфенолиндофенола. При полном окислении аскорбиновой кислоты в кислой среде титруемый раствор приобретает розовую окраску. По количеству красителя, затраченному на титрование, определяют количество витамина.
Количественное определение содержания
аскорбиновой кислоты в моче
Материал исследования
Моча.
Проведение анализа
В колбу отмеряют 5 мл мочи и 5 мл дистиллированной воды, перемешивают, прибавляют 2,5 мл 2% раствора HCl. Титруют краской Тильманса до розовой окраски, сохраняющейся в течение 30 секунд. Записывают объем.
Рассчитывают содержание аскорбиновой кислоты в суточном объеме мочи по формуле:
 , где
0,088 – количество витамина С (мг), соответствующее 1 мл 0,001 М раствора краски Тильманса; А – количество краски, затраченной на титрование (мл); Б – средний суточный объем мочи (1000-1500 мл); В – объем мочи, взятый для титрования (мл).
Нормальные величины
Моча 20-30 мг/сут
Клинико-диагностическое значение
Метод используется для диагностики недостаточности аскорбиновой кислоты в организме. Концентрация витамина в моче понижается в 4-5 раз при гиповитаминозе С, токсикозах, бронхопневмониях, острых и хронических инфекционных заболеваниях.
Повышение концентрации витамина в моче может быть при избыточном приеме аскорбиновой кислоты или поливитаминных препаратов.
Оформление работы
Отмечают принцип метода, ход работы, регистрируют результаты анализа. Оценивают обеспеченность организма витамином С. Необходимо указать биохимические процессы, требующие наличия аскорбиновой кислоты, и возможные нарушения состояния организма при гиповитаминозе.
Количественное определение содержания
аскорбиновой кислоты в растительном материале
Материал исследования
Картофель, плоды шиповника.
Проведение анализа
1. Приготовление экстракта витамина С.
Навеску исследуемого материала (5 г картофеля или 1 г плодов шиповника) помещают в ступку, измельчают при необходимости ножницами и скальпелем, затем растирают с 5 мл 2% р-ра соляной кислоты, постепенно вливая 20 мл дистиллированной воды. Оставляют на 5 минут.
2. Для исследования берут часть экстракта (V2), который переносят в колбу для титрования. Для экстракта картофеля объем V2 равен 10 мл. Экстракт плодов шиповника берут в объеме 1 мл и разводят с дистиллированной водой в соотношении 1:5,
3. Титруют краской Тильманса до розовой окраски, сохраняющейся в течение 30 секунд. Записывают объем краски, затраченной на титрование.
4. Рассчитывают содержание аскорбиновой кислоты (мг в 100 г продукта) по формуле:
 , где
0,088 – количество витамина С (мг), соответствующее 1 мл 0,001 М раствора краски Тильманса; А – количество краски, затраченной на титрование (мл); Б – количество продукта, взятого для анализа (г); V1 – общее количество экстракта (мл); V2 – объем экстракта, взятый для титрования (мл); 100 – пересчет на 100 г продукта, В – разведение экстракта шиповника (в 5 раз)
Нормальные величины
Картофель 20 мг/100 г
Плоды шиповника 1500 мг/100 г
Оформление работы
Отмечают принцип метода, ход работы, регистрируют результаты анализа. В выводе сравнивают полученные значения с табличными, рассчитывают количество продукта, необходимое для удовлетворения суточной потребности в витамине. Также в выводах указывают лучшие пищевые источники аскорбиновой кислоты.
Тестовые задания
Выберите один правильный ответ.
Основная функция водорастворимых витаминов – это
1) предшественники гормонов
2) защита биологических мембран
3) предшественники коферментов
4) предшественники углеводов
Коферментная форма витамина В1 называется
1) пиридоксальфосфат
2) флавинмононуклеотид
3) тиаминдифосфат
4) никотинамидадениндинуклеотид
Коферментная форма витамина В2 называется
1) пиридоксальфосфат
2) флавинадениндинуклеотид
3) тетрагидрофолат
4) коэнзим А
Пантотеновая кислота является составной частью кофермента
1) коэнзим-А
2) тетрагидрофолиевая кислота
3) тиаминпирофосфат
4) флавинмононуклеотид
При длительном приеме антибиотиков и сульфаниламидов у человека развивается гиповитаминоз В6. Это обусловлено
1) подавлением микрофлоры кишечника
2) связыванием лекарства с витамином
3) действием лекарства на синтез коферментной формы
4) ингибированием пиридоксин-зависимых ферментов
При дефиците аскорбиновой кислоты развивается цинга, т.к.
1) окисляются сульфгидрильные группы ферментов
2) нарушается синтез коллагена
3) нарушается синтез альбумина
4) окисляются липидные мембраны клеток соединительной ткани
Простетической группой родопсина – рецепторного белка сетчатки глаза является
1) рибофлавин
2) кальциферол
3) ретиналь
4) токоферол
В состав витамина F входят:
1) олеиновая, линолевая и линоленовая кислоты
2) олеиновая, линолевая и стеариновая кислоты
3) арахидоновая, линолевая и линоленовая кислоты
4) олеиновая, линолевая и арахидоновая кислоты
Для недостаточности витамина А характерны:
1) гиперкератоз
2) снижение концентрации родопсина в крови
3) кровоточивость
4) остеомаляция
Основная роль витамина К состоит в том, что он
1) является антиоксидантом
2) увеличивает образование тромбоцитов
3) участвует в синтезе факторов свертывания крови
4) участвует в реакциях свертывания крови
Ситуационные задачи
1. Бактерии Lactobacillus casei способны расти на простой культуральной среде, содержащей витамины рибофлавин и пиридоксин и 4 аминокислоты. Если в культуральную среду добавить полный набор аминокислот и рибофлавин, то количество пиридоксина, необходимого для оптимального роста бактерий, сократится на 90%. Объясните, почему это происходит.
С троение
сульфаниламидов
| 2. В качестве антибактериальных средств широкого спектра действия первыми стали использоваться сульфаниламиды, содержащие структуру, схожую с парааминобензойной кислотой. На чем основано использование сульфаниламидов? Что также нужно рекомендовать при применении этих препаратов?
3. Больному предстоит операция. Какие витамины следует назначить до операции? Почему?
Раздел 3.
Энзимология
|
|
|
Скачать 5.3 Mb.