практикум по биохимии. Практикум по биологической химии, изданный в 1986 году, подвергся существенной переработке, а также дополнен новыми лабораторными работами в разделах белки, липиды,
 Скачать 1.79 Mb.
|
|
В выводе указать на присутствие анализируемых фосфолипидов в ткани мозга и практическую значимость проведенного исследования. Практическое значение работы. В клинико-биохимических исследованиях качественные реакции на фосфолипиды и их компоненты используются для обнаружения их в экстрактах биологического материала, а в фармации – при анализе лекарственных препаратов, содержащих фосфолипиды. При разделении фосфолипидов эти реакции применяются для проявления хроматограмм, а также для разработки методов количественного определения фосфолипидов. Работа 18. Качественные реакции на стероидыСтероидные соединения – стерины и стериды, широко распространены в животных и растительных организмах. Типичным представителем стероидов организма животных (зоостеринов) является холестерин, который находится в тканях и жидкостях в свободном виде или в виде холестеридов, т.е. эфиров пальмитиновой, стеариновой или олеиновой кислот. Особенно богата холестерином нервная ткань, где его содержится до 20-30 г/кг, причем больше всего холестерина в белом веществе головного и спинного мозга, где его концентрация достигает 40-55 г/кг. Высоко содержание холестерина в ланолине, который используется в фармации для приготовления мазей. Холестерин извлекается из биологического материала хлороформом, горячим этиловым спиртом, диэтиловым эфиром, ацетоном и др. На практике чаще всего используют смеси органических растворителей. В воде холестерин набухает и образует эмульсии; в отличие от других липидов он не разрушается под действием концентрированных щелочей. К растительным стеринам (фитостерины) относятся эргостерин, стигмастерин, β-ситостерин, фукостерин, которые содержатся в растительных маслах, плодах, водорослях и т.д. В лекарственных растениях (наперстянка, горицвет, ландыш, кендырь и др.) имеются сердечные гликозиды, агликоны которых представляют собой тоже скелет стерана. Реактивы. Сульфат кальция (гипс), порошок; хлороформ; серная кислота, конц.; уксусный ангидрид; смесь формалина с конц. серной кислотой (1:50). Оборудование. Штатив с пробирками; весы аптечные; ступка с пестиком; стеклянная пластинка (100х100 мм); лопаточка; воронка с бумажным фильтром; сушильный шкаф, отрегулированный на 60˚С; скальпель; пипетка вместимостью 5 мл; глазные пипетки. Материал.
Для выделения холестерина 3 г ткани мозга тщательно растирают с двукратным количеством гипса. Густой гомогенат распределяют лопаточкой по стеклянной пластинке и высушивают в сушильном шкафу при 60˚С. Высушенную массу счищают скальпелем в сухую ступку, растирают и переносят в сухую пробирку. В пробирку добавляют 6 мл хлороформа и содержимое взбалтывают 5 мин. Отфильтровывают хлороформный экстракт через сухой бумажный фильтр в сухую пробирку и проделывают с ним перечисленные ниже реакции.  а. Реакция Гупперт-Сальковского. Метод основан на дегидратации молекулы холестерина под действием концентрированной серной кислоты с образованием холестерилена, имеющего красную окраску:H2SO4 -H2O  холестерилен холестерин Ход определения. В пробирку наливают 1 мл хлороформного экстракта мозга и осторожно подслаивают по стенке пробирки 1 мл концентрированной серной кислоты. Пробирку легко встряхивают. На границе двух жидкостей появляется кольцо красного цвета, затем вся жидкость принимает последовательно красную, оранжевую и красно-фиолетовую окраску.   б. Реакция Либермана-Бурхарда. Метод основан на дегидратации холестерина с последующим соединением двух образовавшихся молекул холестерина в бихолестадиен:Бихолестадиен в присутствии уксусного ангидрида и сульфокислоты дает сульфопроизводные зеленого цвета. Ход определения. В сухую пробирку наливают 2 мл хлороформного экстракта мозга и добавляют в нее 10 капель уксусного ангидрида и 2 капли концентрированной серной кислоты. Появляется вначале красное окрашивание, переходящее затем в сине-зеленое и зеленое. в. Реакция Витби. Метод, как и в предыдущих реакциях, основан на образовании окрашенных производных дегидратированного и окисленного холестерина под действием серной кислоты. Ход определения. В одну пробирку вносят 2 мл хлороформного экстракта мозга, в другую – 2-3 капли растительного масла и 1 мл хлороформа. В обе пробы добавляют по 20 капель смеси формалина с серной кислотой и встряхивают. Растворы делятся на два слоя – верхний (хлороформный) окрашивается в яркий вишневый цвет, нижний (кислотный) – в тусклый буро-красный с зеленой флуоресценцией. Из хлороформного слоя обеих пробирок отбирают пипеткой несколько капель, переносят в другие (сухие!) пробирки и прибавляют по 2 капли уксусного ангидрида. Вишневая окраска переходит в сине-зеленую. Оформление работы. Результаты оформить в виде таблицы, отмечая их знаками «+» или «–». В выводе указать на присутствие в исследуемом материале соответствующих стероидов, специфичность использованных реакций и их практическое значение.
|