практикум по биохимии. Практикум по биологической химии, изданный в 1986 году, подвергся существенной переработке, а также дополнен новыми лабораторными работами в разделах белки, липиды,

• Название: Практикум по биологической химии, изданный в 1986 году, подвергся существенной переработке, а также дополнен новыми лабораторными работами в разделах белки, липиды,
• Анкор: практикум по биохимии.docx
• Дата: 02.05.2017
• Размер: 1.79 Mb.
• Имя файла: практикум по биохимии.docx
• Тип: Практикум; #6494
• страница: 2 из 39

Фотометрические приборы

Фотометрия (абсорбциометрия) – метод качественного и количественного анализа, основанный на измерении интенсивности поглощения или рассеяния веществом светового потока.

Светопоглощение или экстинкция, согласно закону фотометрии Ламберта-Бугера-Бера прямо пропорционально концентрации поглощающего вещества, толщине слоя раствора и молярному коэффициенту экстинкции (Е). Последний представляет собой поглощение раствора вещества концентрацией 1моль/л, помещенного в кювету с толщиной слоя 1см, и измеряется в л·моль^-1·см^-1.

Рис. 1. Общий вид колориметра фотоэлектрического концентрационного

1 – гальваномер; 2 – крышка кюветного отделения; 3 – ручка установки «грубо»;

4 – ручка установки «точно»; 5 – ручка чувствительности; 6 – ручка кюветодержателя; 7 – переключатель светофильров.
Часто используют и другой показатель – удельный коэффициент экстинкции Е_1см^1%, т.е. поглощение света 1%-ным раствором вещества в кювете с толщиной слоя 1см. Для определения содержания какого-либо компонента биологического материала строят калибровочный график, отражающий зависимость между экстинкцией (Е) и концентрацией (С) этого вещества в растворе и представляющий собой прямую линию в прямоугольной системе координат.

Для фотометрического анализа используют фотоэлектроколориметры, фотоэлектроколориметры-нефелометры и спектрофотометры.

Фотоэлектроколориметры (ФЭК) различных моделей применяют для анализа светопоглощения окрашенных растворов веществ в видимой области спектра (рис.1).

Фотоэлектроколориметры-нефелометры применяют для измерения интенсивности светорассеивания или ослабления светового потока изучаемых веществ в мутных средах.

Колориметр фотоэлектрический концентрационный позволяет благодаря большому набору узкополосных светофильтров проводить измерения в определенной области спектра в диапазоне длин волн 315-980 нм. Этот прибор используют для определения светопоглощения веществ, а также коэффициент пропускания рассеивающих взвесей, эмульсий и коллоидных растворов в проходящем свете. Порядок работы изложен в инструкции.




Рис. 2. Общий вид спектрофотометра.
Спектрофотометры (рис.2) используют для изучения строения, качественного и количественного анализа вещества по интенсивности поглощения его в монохроматическом свете. В клинико-биохимических и научных исследованиях широко применяются спектрофотометры СФ-16, СФ-26, СФ-46 и их современные модификации, работающие в области спектра от 186 до 1100 нм.

Правила работы на спектрофотометре изложены в инструкциях к прибору.

Флуориметрические приборы

Для качественного и количественного анализа веществ, которые, поглощая энергию, способны к люминисценции (флуоресценции) применяются флуороскопы и флуориметры.

Флуороскоп позволяет проводить полуколичественный анализ путем визуального сравнения интенсивности флуоресценции опытного раствора со стандартным, где концентрация вещества известна.

Флуориметры позволяют проводить количественный анализ. В этих приборах выделение области спектра, необходимого для возбуждения данного вещества, осуществляется первичными светофильтрами, а пропускание характерного для него участка излучения (свечения) – с помощью вторичных светофильтров.

Центрифуги

Центрифугирование – метод разделения смеси компонентов жидких сред под действием центробежной силы. Его используют для отделения форменных элементов крови от плазмы, для осаждения и выделения клеток из мочи, спинно-мозговой жидкости и других сред организма, а также для отделения осадков от жидкой фазы (надосадочная жидкость, или супернатант). В клинико-биохимических лабораториях для этой цели используют малогабаритные центрифуги общего назначения. Они дают максимальную скорость около 6000 об·мин^-1.

Для специальных биохимических исследований применяют ультрацентрифуги с охлаждением (рефрижераторные), например ЦР-2-25, УЦП-1-75 и др. Они позволяют проводить дифференциальное центрифугирование, т.е. разделение частиц, отличающихся друг от друга размерами и плотностью.

Скорость осаждения частиц определяется центробежным ускорением, которое обычно выражают в единицах g (гравитационная постоянная, равная 980 см·с^-2). Величину g обозначают как относительное центробежное ускорение. Она зависит от скорости вращения ротора (п, об·мин^-1) и расстояния (r, см) от оси вращения ротора до середины столбика жидкости в пробирке и определяется по формуле

g = 1,11∙10^-5n²r
На практике g устанавливают по номограмме, прилагаемой к инструкции для каждой ультрацентрифуги. С помощью дифференциального центрифугирования выделяют субклеточные частицы – ядра, митохондрии, лизосомы, микросомы и др.