практикум по биохимии. Практикум по биологической химии, изданный в 1986 году, подвергся существенной переработке, а также дополнен новыми лабораторными работами в разделах белки, липиды,
 Скачать 1.79 Mb.
|
|
В выводах указать на присутствие в биологическом материале изучаемых ферментов и практическое значение работы. Работа 21. Обнаружение холинэстеразы (ацетилхолинацилгидролаза; КФ 3.1.1.7) в сыворотке крови экспресс-методом Херцфельда и Штумпфа Реактивы. Полоски фильтровальной бумаги, смоченные субстратно-индикаторным раствором (0,2 г ацетилхолина-бромида и 0,1 г дибромсульфофталеина растворить в 7 мл 96%-ного этанола). Оборудование. Предметные стекла; пинцеты; микропипетки; часы; водяная баня. Материал. Сыворотка крови. Метод основан на изменении окраски индикатора дибромсульфофталеина (от синей до зеленой и желтой), происходящем в результате освобождения уксусной кислоты при гидролизе ацетилхолина холинэстеразой: O║ холинэстераза (CH3)3N+―CH2―CH2―O―C―CH3 + H2O (CH3)3N+―CH2―CH2OH + CH3COOH ацетилхолин холин уксусная кислота Ход определения. На чистое предметное стекло наносят каплю сыворотки крови, на нее пинцетом опускают полоску бумаги, которая тут же окрашивается в синий цвет. Засекают время. Пробу накрывают вторым предметным стеклом и отмечают время появления желтого окрашивания бумаги. Оформление работы. Занести результаты (время появления желтого окрашивания индикаторной бумаги от момента помещения ее на каплю сыворотки крови) и сравнить их с нормой, которая колеблется от 5 до 20 мин. Сделать вывод о присутствии изучаемой гидролазы в сыворотке крови. Работа 22. Определение активности фруктозо-1,6-бисфосфатальдолазы в сыворотке крови по методу В.И.Товарницкого и Е.Н.Волуйской Реактивы. Фруктозо-1,6-бисфосфата, натриевая соль, 1%-ный раствор*; смесь на альдолазу*, раствор 2,4-динитрофенилгидразина 0,1%-ный раствор, трихлоруксусная кислота 10%-ный раствор, едкий натрий 3%-ный раствор, калибр. раствор*. Оборудование. Штатив с пробирками, пипетки на 0,2; 0,1; 1,0; 2,0; 5,0 мл; центрифуга; термостатирующая водяная баня; фотоэлектроколориметр. Материал. Исследуемая сыворотка крови.  Метод основан на определении дигидроксиацетонфосфата (ДОФ), образующегося в ходе расщепления фруктозобисфосфата с участием альдолазы: Дигидроксиацетонфосфат при взаимодействии с 2,4-динитрофенил гидразином образует гидразон, который в щелочной среде имеет коричнево-бурую окраску:Ход определения. В центрифужную пробирку (опытная проба) к 0,2 мл смеси на альдолазу с фруктозо-1,6-бисфосфатом (смешать 1,75 мл смеси на альдолазу с 0,25 мл фруктозо-1,6-бисфосфата) внести 0,1 мл сыворотки крови. В другую центрифужную пробирку (контрольная проба) взять 0,175 мл смеси на альдолазу без фруктозо-1,6-бисфосфата и добавить 0,1 мл сыворотки крови. Обе пробирки поместить в термостат при температуре 37˚С на 1 час. По истечении времени пробирки вынуть из термостата и добавить к контрольной пробе 0,025 мл раствора фруктозо-1,6-бисфосфата. Для осаждения белков в обе пробирки внести по 0,3 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты. Центрифугировать 10 минут при 3000об/мин, слить центрифугат в другую пробирку и, добавив по 0,6 мл 3% раствора едкого натрия, оставить стоять на 10 минут при комнатной температуре. Затем прилить по 0,6 мл раствора 2,4-динитрофенилгидразина и пробы поместить на 10 минут в термостат или водяную баню при температуре 37˚С, затем добавить 4,2 мл 3% раствора едкого натрия. Фотометрировать на ФЭКе при длине волны 530-540 нм (зеленый светофильтр) в кювете на 0,5 см против контрольной пробы. Примечание. Так как окраска неустойчива, то фотометрировать следует сразу после добавления едкого натрия. Расчет. По полученной величине экстинкции по калибровочному графику находят активность фермента в мкмоль/ч∙л. Построение калибровочного графикаВ ряд пробирок (см. приложение) разливают калибровочный раствор диоксиацетона, доливают водой и далее проводят реакцию также, как и при определении активности фермента.
Оформление работы. После определения активности фермента по полученным данным сделать вывод о возможных изменениях активности фермента и причинах этих отклонений. Практическое значение работы. В норме активность фруктозо-1,6-бис-фосфатальдолазы составляет 3,6-21,8 мкмоль/ч∙л. Повышение активности фермента наблюдается при заболеваниях печени, поражении ее гепатотропными ядами, а также в случае нарушений со стороны сердечной и скелетной мышц (инфаркт миокарда, прогрессирующая мышечная дистрофия, миозит и т.д.). Работа 23. Определение глюкозофосфат-изомеразы (D-глюкозо-6-фосфат кетол-изомераза; КФ 5.3.1.9) в сыворотке крови Реактивы. Субстратная смесь для выявления глюкозофосфат-изомеразы*, трихлоруксусная кислота, 10%-ный раствор; резорцин, 0,1%-ный раствор в 3,6%-ной соляной кислоте; соляная кислота, 36%-ный раствор. Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 5 мл; водяная баня; лабораторный термометр. Материал. Сыворотка крови. Метод основан на определении фруктозо-6-фосфата, образующегося в ходе изомеризации глюкозо-6-фосфата под действием глюкозофосфат-изомеразы:  Фруктозо-6-фосфат образует с резорцином в присутствии соляной кислоты соединение красного цвета. Ход определения. В две пробирки вносят по 0,5 мл сыворотки крови. В одну из них (опытную) добавляют 1 мл субстратной смеси и перемешивают. Помещают обе пробирки на 30 мин в водяную баню при 37˚С, а по окончании инкубации в них приливают по 1,5 мл раствора трихлоруксусной кислоты (для остановки реакции). В контрольную пробу доливают 1 мл субстратной смеси. После перемешивания содержимое каждой пробирки фильтруют через складчатый бумажный фильтр. Отбирают по 1 мл фильтрата в чистые пробирки, приливают по 1 мл резорцина и по 3 мл раствора соляной кислоты. Смеси энергично встряхивают и оставляют для развития окраски. Отмечают разницу окрашивания в пробах. Оформление работы. Отметить различие окраски проб и сделать вывод о присутствии фермента в сыворотке крови. 3. Изучение кинетических свойств ферментов Кинетика ферментативных реакций – это раздел энзимологии, который изучает зависимость скорости реакций, катализируемых ферментами, от химической природы реагирующих веществ (т.е. субстратов и ферментов) и от условий их взаимодействия, т.е. от температуры, концентрации компонентов, рН среды, состава среды, присутствия модификаторов и т.д. Изучение кинетики ферментативных реакций показывает не только их отличия от небиологических катализаторов, обусловленные прежде всего белковой природой ферментов, но и многообразие условий, от которых зависит правильное определение активности любого фермента. Скорость реакции, т.е. убыль субстрата или прирост количества продукта за определенные промежутки времени, является мерой каталитической активности фермента или просто активностью фермента. Использование методов качественного анализа субстратов и продуктов реакции позволяет выявить присутствие фермента в биологическом материале, а количественное определение их дает возможность определить содержание фермента или его активность в расчете на единицу массы или объема исследуемого образца. Работа 24. Кинетика ферментативных реакций на примере α-амилазы слюны Реактивы. Крахмал, 1%-ный раствор, свежеприготовленный; раствор иода в иодиде калия*; фосфатно-цитратный буфер, 0,1 М с рН 5,6; 6,4; 6,8; 7,2 и 8,0*. Оборудование. Штатив с пробирками; водяная баня; лабораторный термометр; пипетки вместимостью 1 и 5 мл; бюретка вместимостью 25 мл; химические стаканы (для льда или снега). Материал. Слюна разбавленная (см. работу 18). а. Зависимость скорости реакции от количества фермента. Метод основан на определении скорости гидролиза крахмала, выявляемого пробой с иодом, в зависимости от количества добавленной α-амилазы слюны. Ход определения. Разводят исходную разбавленную слюну водой в пробирках в 20, 40, 80 и 160 раз. Берут четыре пробирки и вносят в каждую 1 мл одного из полученных разведений слюны. В пробирки из бюретки добавляют по 4 мл раствора крахмала, быстро помещают их в водяную баню при 38˚С и засекают время начала реакции. Через каждые 1-2 мин отбирают по 2 капли жидкости из каждой пробы и приливают к ним по 1 капле раствора иода в иодиде калия. Вначале пробы дают синее, затем красно-фиолетовое и, наконец, красное окрашивание. Отмечают с точностью до 0,5 мин время от начала опыта до появления в каждой из четырех пробирок красного окрашивания – стадия образования эритродекстринов из крахмала. Оформление работы. Результаты изобразить графически, откладывая по оси ординат v – скорость реакции (величина, обратная времени образования эритродекстринов), а по оси абсцисс [C] – относительную концентрацию амилазы (разведение). Сделать вывод о зависимости скорости реакции от концентрации фермента и сравнить с той же зависимостью для небиологических катализаторов. б. Зависимость скорости ферментативной реакции от температуры. Метод основан на определении скорости гидролиза α-амилазой слюны крахмала в зависимости от температуры. Ход определения. В пробирку помещают 5 капель слюны, кипятят 1-2 мин на водяной бане и остужают. В две другие помещают по 5 капель некипяченой слюны. Вносят во все пробы по 10 капель раствора крахмала и ставят первую и вторую пробирки в водяную баню при 38˚С, а третью – в воду со льдом или снегом на 3 мин. Затем прибавляют в каждую пробирку по 1 капле раствора иода в иодиде калия и сравнивают развивающуюся окраску. Оформление работы. Данные оформляют в виде таблицы, делают вывод о зависимости ферментативной реакции от температуры и причинах этой зависимости.
в. Зависимость скорости ферментативной реакции от рН среды. Метод основан на сравнении скорости гидролиза крахмала, определяемого пробой с иодом, под действием α-амилазы слюны при разных рН среды. В результате устанавливается оптимум рН действия α-амилазы. Ход определения. В пять пробирок отмеривают по 10 капель растворов фосфатно-цитратного буфера со следующими значениями рН: 5,6; 6,4; 6,8; 7,2; 8,0. Прибавляют во все пробы по 5 капель разведенной в 10 раз слюны и по 10 капель раствора крахмала и ставят пробирки в водяную баню при 38˚С. Через 1-2 мин отбирают по 1 капле содержимого в другие пробирки и приливают по 1 капле раствора иода в иодиде калия. Отмечают время наступления красного окрашивания (стадия образования эритродекстринов) в каждой из пяти проб. Оформление работы. Данные оформить графически, откладывая по оси абсцисс значения рН среды и по оси ординат – время (в мин), которое необходимо для гидролиза крахмала до стадии эритродекстринов. Сделать вывод об оптимуме рН действия α-амилазы слюны. Практическое значение работы. Кинетические свойства ферментов изучаются для подбора оптимальных условий (концентрация субстрата, оптимум рН среды и температуры, ионный состав среды), определения активности ферментов в научных и клинических исследованиях, а также при стандартизации ферментных препаратов. Неверно подобранные стандартные условия определения конкретного фермента приводят к ошибкам в диагностике заболеваний и контроле качества ферментных препаратов. 4. Специфичность действия ферментов Ферменты в отличие от небиологических катализаторов обладают высокой специфичностью. Однако степень специфичности разных энзимов неодинакова, что позволяет клеткам живых организмов приспосабливаться к изменениям среды. Работа 25. Демонстрация абсолютной субстратной специфичности уреазы (карбамидамидогидролаза; КФ 3.5.1.5.) Реактивы. Мочевина, 1%-ный раствор; тиомочевина, 1%-ный раствор; ацетамид, 1%-ный раствор; фенолфталеин, 0,5%-ный спиртовой раствор; лакмусовая бумага. Оборудование. Аптечные весы с разновесами; штатив с пробирками; глазные пипетки; пипетки вместимостью 1 мл. Материал. Соевая мука. Метод основан на определении аммиака, образующегося под действием уреазы соевой муки на мочевину: уреаза H2N ― C ― NH2 + H2O 2NH3↑ + CO2↑ ║ O мочевина Выделение аммиака обнаруживается по запаху и по изменению окраски фенолфталеина и красной лакмусовой бумаги. Сравнивают возможность гидролиза уреазой веществ, сходных по строению с мочевиной:
|