практикум по биохимии. Практикум по биологической химии, изданный в 1986 году, подвергся существенной переработке, а также дополнен новыми лабораторными работами в разделах белки, липиды,
 Скачать 1.79 Mb.
|
|
В выводах указать разницу в действии катализаторов на скорость гидролиза крахмала. 2. Выявление ферментов, относящихся к разным классам Все ферменты в зависимости от типа катализируемых химических реакций делятся на шесть классов: оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы (синтетазы). Внутри каждого класса ферменты подразделяются на подклассы, подподклассы, которые уточняют природу ферментативной реакции (номенклатуру и систему нумерации ферментов см. учебник, с.125-129). Для обнаружения ферментов каждого класса в биологическом материале имеются свои особенности, поэтому необходимо определить условия для протекания ферментативной реакции. Качественные реакции на ферменты используются в клинике для обнаружения ферментов в мазках крови, биоптатах и микропрепаратах при энзимоцитохимических исследованиях, а также в гигиенической практике при постановке проб на присутствие ферментов в продуктах питания (молоко, картофель и т.д.). При разделении ферментов методом электрофореза их идентификацию также производят с помощью качественных реакций. Работа 20. Обнаружение оксидоредуктаз в биологическом материалеВ реакциях, катализируемых оксидоредуктазами, окисляемый субстрат рассматривается как донор водорода или электронов, а акцептором могут быть природные вещества (коферменты – НАД, НАДФ, ФМН, ФАД, КоQ, кислород, органические соединения, цитохромы и др.) и ксенобиотики. Для большинства ферментов этого класса рекомендуются названия: дегидрогеназы и редуктазы. В тех случаях, когда акцептором служит О2, используется термин оксидаза, а если кислород в ходе реакции включается в состав субстрата, то фермент называется оксигеназа. Пероксидаза является ферментом, использующим Н2О2 в качестве акцептора, а каталаза – ферментом, катализирующим реакции, где донорно- акцепторную пару составляют две молекулы Н2О2. Реактивы. Формальдегид, 0,4%-ный раствор; метиленовый синий, 0,01%-ный раствор. Оборудование. Штатив с пробирками; водяная баня; лабораторный термометр; пипетки вместимостью 1 и 5 мл. Материал.
а. Выявление альдегидоксидазы (альдегид: кислород оксиредуктаза; КФ 1.2.3.1) в молоке. Метод основан на визуальном наблюдении за обесцвечиванием метиленового синего (МС), связывающего водород, который отщепляется с участием альдегидоксидазы от субстрата. Альдегидоксидаза катализирует реакцию дегидрирования различных альдегидов, например, формальдегида. Водород переносится на ФАД+, являющийся коферментом данного фермента, а затем на конечный акцептор – кислород – по уравнению Альдегидоксидаза НС ═ О + Н2О + ФАД+ Н ─ С ═ О + ФАД∙Н2 │ │ Н ОН Альдегидоксидаза ФАД∙Н2 + О2 ФАД+ + Н2О2 При добавлении МС – искусственного акцептора водорода – в бескислородных условиях образуется его восстановленная форма (лейкоформа) МС∙Н2: Альдегидоксидаза Н ─ С ═ О + Н2О Н ─ С ═ О │ │ Н ФАД+ ФАД∙Н2 ОН МС∙Н2 МС (лейкоформа) (синее окрашивание) Если бесцветный раствор метиленового синего встряхнуть, то он вновь приобретет синюю окраску: МС∙Н2 + О2 → МС + Н2О2 Ход определения. В две пробирки вносят по 5 мл свежего молока и добавляют в первую 1 мл воды, а во вторую такой же объем раствора формальдегида. В обе пробы приливают по 1 мл раствора метиленового синего, содержимое перемешивают и приливают 3-4 капли вазелинового масла (для предохранения жидкой смеси от контакта с кислородом воздуха). Пробирки ставят в водяную баню, нагретую до 37˚С. Через 5-10 мин сравнивают изменение окрашивания в пробах. Сильно встряхнув, вновь отмечают переход окраски. б. Выявление пероксидазы (донор: Н2О2 оксидоредуктаза; КФ 1.11.1.7) в картофеле и в молоке. В основе метода лежит реакция с бензидином (см. работу 9, а). Ход определения. В две пробирки наливают по 1 мл соответственно сырого молока и картофельного сока. Добавляют в обе пробы по 5 капель спиртового раствора бензидина и по капле раствора пероксида водорода. Отмечают характерное окрашивание. Оформление работы. Результаты занести в таблицу и отметить характерное окрашивание индикатора реакции.
|